一种利用甘蓝DH株根系再生植株的方法与流程

本发明属于农业技术领域，涉及一种利用甘蓝dh株根系再生植株的方法。

背景技术：

甘蓝(brassicaoleracea)俗称卷心菜、包菜，是十字花科(cruciferae)芸苔属(brassica)植物，甘蓝具有适应性广、抗逆性强、容易栽培、产量高、耐运输、耐贮藏等优点。随着甘蓝产业的发展和人们生活水平的不断提高，甘蓝产业种植的品种更换年限极大缩短，来自国内和国外品种的市场竞争力显得尤为强劲。当今生产上的甘蓝品种要求品质更优、抗病性更强、商品性更好和产量更高的新品种,但甘蓝育种者仅靠传统的常规育种方法很难取得突破性进展，多目标的杂种优势品种选育往往滞后于产业发展。甘蓝游离小孢子培养技术研究和应用已成为现阶段突破甘蓝强优势多目标育种的瓶颈和加快甘蓝新品种选育的有效途径，该技术在短暂的1～2年就能快速创制出大批不同基因型聚集优势基因在一起的育种自交系，从而加快育种进程；但该技术中甘蓝游离小孢子来源大多来自杂种一代或低代自交系，理论上花蕾中每个小孢子的基因型存在极大差异。故此，花蕾小孢子再生植株间基因型具有不一致性，经高海娜、张恩慧、董韩等研究报道，每个小孢子只能再生一个胚状体，一个胚状体只能再生1～5个dh植株，这就易造成当代每个基因型小孢子群体过少，不易对dh植株农艺性状科学观察和用于配制新组合。据杨安平、马勇斌等研究报道，甘蓝小孢子试管再生植株根系较发达，次生根系生长旺盛。因而，利用小孢子再生植株根系扩繁dh株群体就成为更进一步加快甘蓝育种进程的重要研究目标。近年来国内外关于甘蓝离体再生体系建立的研究报道甚多，外植体多以植株地上部分茎叶和花器为主，但很少见到以植株地下部的根系，特别是未见到以dh植株根系段为外植体的再生体系的研究报道。甘蓝利用植株的子叶、下胚轴、茎、真叶和花蕾等作为外植体成功诱导出再生植株，技术已经较为成熟；利用根系仅见用杂种一代品种的根段再生植株，仅诱导出愈伤未见再生成苗。

技术实现要素：

本发明的目的在于提供一种利用甘蓝dh株根系再生植株的方法，以基因型高度纯合的甘蓝dh植株根系段为外植体，研究甘蓝dh植株根系再生植株技术，为每个小孢子再生dh植株当年快速扩繁群体创造条件，为提高dh系利用加快育种进程奠定基础。

其具体技术方案为：

一种利用甘蓝dh株根系再生植株的方法，包括以下步骤：

步骤1、根系外植体培养

栽培甘蓝三个优良杂种一代组合植株抽薹开花，选取单核靠边期的花蕾游离小孢子培养诱导再生植株，当胚状体诱导数个不定芽生长高度达3cm时，至基部切下转接生根培养基上培养再生dh植株，等不定芽诱导出的根生长不同天数后，将试管苗放置8～10℃光照培养箱炼苗5天，随后在超净工作台取出dh植株，无菌水冲洗净根部培养基，然后将一定粗度的根切下放到ms+8～12％蔗糖液体培养基浸泡5～8分钟，冲洗干净，切成1cm左右的根系段作为外植体。

步骤2、根系再生植株培养方式与ms培养基适宜naa浓度筛选

选用dh植株即dh15-1a的根系为试材，将根系切成1cm左右长度的根段为外植体。采用二因子系统分组设计，共有两组变量，其一，将供试外植体分设为两组处理；一组处理即进行预培养，3d后转入共培养基中进行培养；另一组处理即直接进行共培养基中培养。其二，将共培养基中的naa浓度设五个处理，即naa浓度分别为0.045mg/l、0.03mg/l、0.025mg/l、0.018mg/l、0.015mg/l。预培养基为ms+1.0mg/l2，4-d+4.5mg/l6-ba，共培养基为ms+naa+4.5mg/l6-ba+6mg/lagno3+0.1mg/lznso4。外植体接入三角瓶诱导培养，每个处理选用10个外植体，三次重复。培养温度25℃、光照强度为3000lx、光照时数12h/d；比较分析dh植株根系再生植株的适宜培养方式、培养基和最适naa浓度。

步骤3、根系再生植株适宜根龄筛选

选用dh植株即dh15-1a的根系为试材，待试管中dh15-1a植株长出可见根系时，开始计算根龄。根龄设15天、20天、25天共三个时间段处理，以上述试验所选根系诱导分化的适宜培养方式和共培养基为培养条件，每个处理选用10个外植体，三次重复；比较分析甘蓝dh15-1a植株不同根龄再生植株诱导效果。

步骤4、不同基因型dh植株根系诱导和植株再生

选用dh15-1a、dh15-2b、dh15-3c等三种基因型的dh植株20天根系为试材，将根系切成1cm左右长度的根段为外植体。以上述试验所选根系诱导分化的适宜培养方式和共培养基为培养条件，每个处理选用10个外植体，三次重复；比较分析不同基因型植株诱导效果。同时待不定芽长至2～3cm时，将芽从基部切下，转至生根培养基(ms+0.1mg/lnaa)上进行培养诱导成再生植株。

步骤5、数据计算和处理

愈伤诱导率＝诱导出愈伤的外植体数/总外植体数×100％

外植体诱导率＝诱导不定芽外植体数/总外植体数×100％

不定芽诱导率＝诱导不定芽总数/总外植体数×100％

植株再生率＝再生植株数/接种总芽数×100％

所得数据采用ibmspssstatistics20软件进行差异显著性分析，在0.05和0.01水平上进行多重比较分析。

进一步，根段在ms+0.03mg/lnaa+4.5mg/l6-ba+6mg/lagno3+0.1mg/lznso4的分化培养基中植株再生率为90.0％；dh植株根段再生植株所用的外植体根龄是20天；不同dh材料的再生能力有显著差异。

与现有技术相比，本发明的有益效果：

本发明以3个基因型高度纯合的甘蓝dh植株根段为外植体，研究甘蓝dh株根系再生植株技术，为每个小孢子再生dh植株当年快速扩繁群体创造条件。

1)最早对dh植株采用低温(t＝8～10℃)炼苗处理和根切段放置ms+8～12％蔗糖液体培养基浸泡5～8分钟，促进根系再生。

2)将不定芽根段接种到不同浓度6-ba与naa激素组合的ms分化培养基诱导芽苗的分化。首次筛选出dh植株根段再生植株最适培养基，即ms+0.03mg/lnaa+4.5mg/l6-ba+6mg/lagno3+0.1mg/lznso4；根段在ms+0.03mg/lnaa+4.5mg/l6-ba+6mg/lagno3+0.1mg/lznso4的分化培养基中植株再生率高达90.0％。

3)dh植株根段再生植株所用的外植体最佳根龄是20天；不同dh材料的再生能力有显著差异。再生苗经生根培养和驯化后，移栽田间可正常开花结果。

本发明以基因型高度纯合的甘蓝dh株根系段为外植体，研究甘蓝dh株根系再生植株技术，为每个小孢子再生dh植株当年快速扩繁群体创造条件，为提高dh系利用加快育种进程奠定基础。

附图说明

图1a：根段培养1周时形成愈伤组织；

图1b：根段培养10天形成愈伤组织；

图1c：根段培养2周形成愈伤组织；

图1d：根段愈伤组织形成芽点；

图1e：根段培养4周愈伤组织分化叶片；

图1f：根段培养6周愈伤组织分化叶片和根。

图2a：dh植株根段接种添加0.03mg/lnaa共培养基培养3周后分化丛生芽；

图2b：dh植株根段接种添加0.025mg/lnaa共培养基培养3周后分化丛生芽；

图2c：dh植株根段接种添加0.018mg/lnaa共培养基培养3周后分化丛生芽；

图3：三柱形左为15天，中为20天，右为25天等根龄根段外植体诱导再生植株结果。

图4：20d根龄外植体诱导培养42d分化不定芽表现。

图5a：左试管dh15-1a，中试管dh15-2b，右试管dh15-3c等三种基因型不定芽转接生根培养基上状况；

图5b：左试管dh15-1a，中试管dh15-2b，右试管dh15-3c等三种基因型不定芽转接生根培养基上培养2周的再生植株。

具体实施方式

下面结合附图和具体实施方案对本发明的技术方案作进一步详细地说明。

1.材料与方法

1.1供试材料

供试甘蓝双单倍体(dh)植株是由西北农林科技大学园艺学院甘蓝育种研究室配制的三个优良杂种一代组合，用其游离小孢子培养创制的基因型来源不同的三个胚状体诱导的再生dh植株，即dh15-1a、dh15-2b和dh15-3c无菌植株苗的根系作为外植体。

1.2试验方法

1.2.1根系外植体培养

栽培甘蓝三个优良杂种一代组合植株抽薹开花，选取单核靠边期的花蕾游离小孢子培养诱导再生植株，当胚状体诱导数个不定芽生长高度达3cm时，至基部切下转接生根培养基上培养再生dh植株，等不定芽诱导出的根生长不同天数后，将试管苗放置低温(t＝8～10℃)光照培养箱炼苗5天，随后在超净工作台取出dh植株，无菌水冲洗净根部培养基，然后将一定粗度的根切下放到ms+8～12％蔗糖液体培养基浸泡5～8分钟，冲洗干净，切成1cm左右的根系段作为外植体。

1.2.2根系再生植株培养方式与ms培养基适宜naa浓度筛选

选用dh植株即dh15-1a的根系为试材，将根系切成1cm左右长度的根段为外植体。采用二因子系统分组设计，共有两组变量，其一，将供试外植体分设为两组处理；一组处理即进行预培养，3天后转入共培养基中进行培养；另一组处理即直接进行共培养基中培养。其二，将共培养基中的naa浓度设五个处理，即naa浓度分别为0.045mg/l、0.03mg/l、0.025mg/l、0.018mg/l、0.015mg/l。预培养基为ms+1.0mg/l2，4-d+4.5mg/l6-ba，共培养基为ms+naa+4.5mg/l6-ba+6mg/lagno3+0.1mg/lznso4。外植体接入三角瓶诱导培养，每个处理选用10个外植体，三次重复。培养温度25℃、光照强度为3000lx、光照时数12h/d；比较分析dh植株根系再生植株的适宜培养方式和最适naa浓度。

1.2.3根系再生植株适宜根龄筛选

选用dh植株即dh15-1a的根系为试材，待试管中dh15-1a植株长出可见根系时，开始计算根龄。根龄设15天、20天、25天共三个时间段处理，以上述试验所选根系诱导分化的适宜培养方式和共培养基为培养条件，每个处理选用10个外植体，三次重复；比较分析甘蓝dh15-1a植株不同根龄再生植株诱导效果。

1.2.4不同基因型dh植株根系诱导和植株再生

选用dh15-1a、dh15-2b、dh15-3c等三种基因型的dh植株20天根系为试材，将根系切成1cm左右长度的根段为外植体。以上述试验所选根系诱导分化的适宜培养方式和共培养基为培养条件，每个处理选用10个外植体，三次重复；比较分析不同基因型植株诱导效果。同时待不定芽长至2～3cm时，将芽从基部切下，转至生根培养基(ms+0.1mg/lnaa)上进行培养诱导成再生植株。

1.2.5数据计算和处理

愈伤诱导率＝诱导出愈伤的外植体数/总外植体数×100％

外植体诱导率＝诱导不定芽外植体数/总外植体数×100％

不定芽诱导率＝诱导不定芽总数/总外植体数×100％

植株再生率＝再生植株数/接种总芽数×100％

所得数据采用ibmspssstatistics20软件进行差异显著性分析，在0.05和0.01水平上进行多重比较分析。

2结果分析

2.1dh植株根系再生愈伤组织的形成

甘蓝根段外植体接种1周左右后开始膨大变绿，两端变褐，并在切口处形成少量愈伤组织(图1a)。随着进一步培养，愈伤组织逐渐覆盖外植体，供试的外植体愈伤组织形成率均达到100％(图1b)；培养2周后部分根段外植体初始愈伤组织结构致密呈绿色，愈伤组织两端呈白色，布满白色凸起，并产生大量绿色或紫色芽点(图1c)；随之培养部分愈伤组织结构致密呈黄绿色，分化出芽点(图1d)；4周后芽点增殖变大出现两片叶，主要分布在愈伤组织表面(图1e)；6周后大部分丛生不定芽生长出3～5片叶和大量不定根(图1f)。

2.2培养方式与培养基中naa浓度对外植体分化的影响

从表1可以看出，是否进行预培养对共培养的分化结果有较大影响。经预培养+共培养其愈伤诱导率、外植体诱导率和不定芽诱导率等三种诱导率平均值分别为67.3％、56.0和232.0％，均较直接共培养的值减少7.4％、9.3％和95.3％；两种不同培养方式中，不同naa浓度(0.045mg/l、0.030mg/l和0.018mg/l)三种诱导率也表现出前者培养方式均低于后者培养方式。在共培养中，添加naa不同浓度间诱导结果均存在显著性差异，其中添加0.030mg/l、0.025mg/l和0.018mg/l三种naa浓度的三种诱导率均较高，并培养5周后分化芽生长健壮，叶片翠绿(图2a，图2b，图2c)；尤其是0.030mg/lnaa三种诱导率分别为100.0％、90.0％和430.0％均达到最高值。由此结果表明，根段外植体在ms+1.0mg/l2.4-d+4.5mg/l6-ba培养基上3d预培养会抑制愈伤和不定芽形成，不利于根段再生植株培养；而直接采用共培养选用ms+0.030mg/lnaa+4.5mg/l6-ba+6mg/lagno3+0.1mg/lznso4培养基可获得根段诱导培养的最佳效果。

表1培养方式与共培养基不同naa浓度对dh植株根系再生培养影响结果

注：表中数据均为三次重复的平均值；同列数据后不同小写字母表示差异达到显著水平(p<0.05)；同列数据后不同大写字母表示差异达到极显著水平(p<0.01)。

2.3不同dh植株根龄对外植体不定芽分化的影响

由图3可知，根龄对dh植株根段外植体诱导具有不同的影响效果。从诱导愈伤的结果可以看出，三个不同根龄处理之间存在显著性差异，但不同根龄段外植体普遍都能诱导形成健康愈伤；其中，20天根龄的外植体愈伤诱导率最高，达96.0％。从外植体诱导率和不定芽诱导率的结果可以看出，三个不同根龄处理之间也存在显著性差异，两种诱导率的值均表现出20天为最高，分别为82.0％和420.0％，并且愈伤分化芽点多，芽点周围褐化少，芽健壮(图4)；而25天为最低，分别为30.0％和154.0％。由此表明，只经过共培养，在ms+0.030mg/lnaa+4.5mg/l6-ba+6mg/lagno3+0.1mg/lznso4培养基上选用20天根段培养诱导效果最好。

2.4不同基因型dh植株根系诱导和植株再生

由表2可知，甘蓝dh植株基因型不同，其根系再生诱导分化结果也不同。供试三种基因型dh植株根系间诱导分化结果存在极显著性差异，愈伤诱导率、外植体诱导率和不定芽诱导率dh15-2b基因型诱导值均比其余两种基因型高，分别达到83.3％、76.7％和430.0％，而dh15-3c基因型诱导值均最低，分别低于dh15-2b基因型49.6％、43.4％和203.3％。由此表明，甘蓝基因型是影响根系再生植株的一个主要因素。三种基因型根系诱导的不定芽当生长至2～3cm时，将芽从基部切下，转至生根培养基ms+0.1mg/lnaa上(图5a)，培养2周后，逐渐长出根系形成再生植株(图5b)。

表2不同基因型dh植株根段外植体诱导结果

注：表中数据均为三次重复的平均值；同列数据后不同小写字母表示差异达到显著水平(p<0.05)；同列数据后不同大写字母表示差异达到极显著水平(p<0.01)。

甘蓝dh植株不同根龄的外植体再生植株同样具有显著的差异结果，外植体选用20天根龄的根段培养易形成松脆柔软团状愈伤组织，诱导率达96.0％，显著高于15天和25天根龄；并且82.0％的外植体能诱导出不定芽。由此获得根龄与苗龄和叶龄再生植株的影响具有一致性，适宜的根龄有助于提高植株再生率。

以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，本发明的保护范围不限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明披露的技术范围内，可显而易见地得到的技术方案的简单变化或等效替换均落入本发明的保护范围内。