本发明属于干细胞冻存技术领域，特别涉及一种人胎盘羊膜和绒毛膜的冷冻保护液及其制备方法。
背景技术：
羊膜和绒毛膜是人胎盘的两个主要组成部分。羊膜在胎盘的最内层，其具有一定的弹性，并具有多潜能性、移植后不会诱导免疫排斥反的多能干细胞，其可分泌神经营养因子，还可作为眼科手术的基底膜；而绒毛膜上同样含有丰富的具有多分化潜能的干细胞，可应用于由于衰老和病变引起的组织器官损伤修复以及移植中。
虽然羊膜和绒毛膜具有很广的应用范围，但是其深低温的保存成了应用的瓶颈。现有技术中用于保存羊膜和绒毛膜的保存液有由胎牛血清、二甲基亚砜和右旋糖酐40组成的冷冻保护液，该保护液保持细胞活力的时间比较短，无法满足临床长时间保存的需要，并不且该保护液中所使用的胎牛血清价格昂贵，并且不同厂家不同生产批次和质量存在显著不同，进而会对整个冷冻保护液的质量产生显著影响，进而影响冻存的细胞复苏率。
技术实现要素：
为了解决上述技术问题，本发明提供一种人胎盘羊膜和绒毛膜的冷冻保护液及其制备方法，该冷冻保护液可以长期保存人胎盘羊膜和绒毛膜，并且可长期保存细胞活力。
本发明具体技术方案如下：
本发明提供一种人胎盘羊膜和绒毛膜的冷冻保护液，该冷冻保护液主要由下列重量份数的组分组成：
进一步的改进，所述卡波姆微球是由如下重量份数成分制备而成：
磷脂酰丝氨酸2.5-4.3
卡波姆0.5-0.8。
本发明提供的人胎盘羊膜和绒毛膜的冷冻保护液，在dmso内加入十二烷基氨基丙酸钠、卡波姆微球和卵磷脂的混合物制成的冷冻保护液可显著提高该冷冻保护液对人胎盘羊膜和绒毛膜冻存的时间，长期保存细胞的活力。
进一步的改进，所述卡波姆微球是通过如下方法制备得到的：将3/4重量份的卡波姆溶于2重量份的水中，制得卡波姆水溶液；将1/4重量份的卡波姆和磷脂酰丝氨酸加入液体石蜡中混合均匀形成油相，将卡波姆水溶液加入到油相中，经剪切机乳化，静置分层，去除液体石蜡，洗涤，干燥，即得卡波姆微球。
进一步的改进，所述冷冻保护液中还包括重量份数为0.2-0.5份的月桂酰乙二醇胺和1-2.5份的甘氨酸钠。
本发明通过在冷冻保护液内加入月桂酰乙二醇胺和甘氨酸钠的混合物可以进一步提高冷冻保护液对人胎盘羊膜和绒毛膜的保存时间，提高细胞复苏后的活率，并且还可以提高冷冻保护液的稳定性。
进一步的改进，所述冷冻保护液主要由下列重量份数的组分组成：
本发明另一方面提供一种人胎盘羊膜和绒毛膜的冷冻保护液的制备方法，该方法包括如下步骤：
s1：卡波姆微球的制备：
将3/4重量份的卡波姆溶于2重量份的水中，制得卡波姆水溶液；将1/4重量份的卡波姆和磷脂酰丝氨酸加入液体石蜡中混合均匀形成油相，将卡波姆水溶液加入到油相中，经剪切机乳化，静置分层，去除液体石蜡，洗涤，干燥，即得卡波姆微球；
s2：将十二烷基氨基丙酸钠、卡波姆微球和卵磷脂置于研钵中研磨，获得研磨混合物，将研磨混合物和卵磷脂溶于dmso中，即得冷冻保护液。
进一步的改进，卡卡波姆微球和液体石蜡的重量份数比为3-5.1：18-32。
进一步的改进，剪切机乳化的具体条件为：第一次乳化速度2500rpm，时间5min，静置1min；第二次乳化速度4500rpm，时间5min，静置5min；第三次乳化5000rpm，时间10min。
进一步的改进，研磨的具体步骤为：将十二烷基氨基丙酸钠溶于2倍重量的水中，置于研钵内研磨5min，研磨速度500rpm，加入1/3重量份的卡波姆微球和2/3重量份的卵磷脂，继续研磨10min，研磨速度300rpm，加入2/3重量份的卡波姆微球，继续研磨10min，研磨速度200rpm，再加入1/3重量份的卵磷脂，研磨10min，研磨速度500rpm，获得研磨混合物。
本发明通过对冷冻保护液制备方法的限定，能够显著提高冷冻保护液对细胞的活力。
本发明提供的人胎盘羊膜和绒毛膜的冷冻保护液，在dmso内加入十二烷基氨基丙酸钠、卡波姆微球和卵磷脂的混合物制成的冷冻保护液可显著提高该冷冻保护液对人胎盘羊膜和绒毛膜冻存的时间，长期保存细胞的活力。
具体实施方式
实施例1
实施例2
实施例3
卡波姆微球是通过如下方法制备得到的：将3/4重量份的卡波姆溶于2重量份的水中，制得卡波姆水溶液；将1/4重量份的卡波姆和磷脂酰丝氨酸加入液体石蜡中混合均匀形成油相，将卡波姆水溶液加入到油相中，经剪切机乳化，静置分层，去除液体石蜡，洗涤，干燥，即得卡波姆微球。
实施例4
该冷冻保护液的制备方法：
s1：卡波姆微球的制备：
将3/4重量份的卡波姆溶于2重量份的水中，制得卡波姆水溶液；将1/4重量份的卡波姆和磷脂酰丝氨酸加入液体石蜡中混合均匀形成油相，将卡波姆水溶液加入到油相中，经剪切机乳化，第一次乳化速度2500rpm，时间5min，静置1min；第二次乳化速度4500rpm，时间5min，静置5min；第三次乳化5000rpm，时间10min，静置分层，去除液体石蜡，洗涤，干燥，即得卡波姆微球；
s2：将十二烷基氨基丙酸钠溶于2倍重量的水中，置于研钵内研磨5min，研磨速度500rpm，加入1/3重量份的卡波姆微球和2/3重量份的卵磷脂，继续研磨10min，研磨速度300rpm，加入2/3重量份的卡波姆微球，继续研磨10min，研磨速度200rpm，再加入1/3重量份的卵磷脂，研磨10min，研磨速度500rpm，获得研磨混合物，将研磨混合物和卵磷脂溶于dmso中，即得冷冻保护液。
实施例5
实施例6
实施例7
该冷冻保护液的制备方法：
s1：卡波姆微球的制备：
将3/4重量份的卡波姆溶于2重量份的水中，制得卡波姆水溶液；将1/4重量份的卡波姆和磷脂酰丝氨酸加入液体石蜡中混合均匀形成油相，将卡波姆水溶液加入到油相中，经剪切机乳化，第一次乳化速度2500rpm，时间5min，静置1min；第二次乳化速度4500rpm，时间5min，静置5min；第三次乳化5000rpm，时间10min，静置分层，去除液体石蜡，洗涤，干燥，即得卡波姆微球；
s2：将十二烷基氨基丙酸钠溶于2倍重量的水中，置于研钵内研磨5min，研磨速度500rpm，加入1/3重量份的卡波姆微球和2/3重量份的卵磷脂，继续研磨10min，研磨速度300rpm，加入2/3重量份的卡波姆微球，继续研磨10min，研磨速度200rpm，再加入1/3重量份的卵磷脂，研磨10min，研磨速度500rpm，获得研磨混合物，将研磨混合物、卵磷脂、月桂酰乙二醇胺和甘氨酸钠溶于dmso中，即得冷冻保护液。
对照例1
对照例2
对照例3
对照例4
对照例5
对照例6
对照例7
该冷冻保护液的制备方法：
s1：卡波姆微球的制备：
将3/4重量份的卡波姆溶于2重量份的水中，制得卡波姆水溶液；将1/4重量份的卡波姆和磷脂酰丝氨酸加入液体石蜡中混合均匀形成油相，将卡波姆水溶液加入到油相中，经剪切机乳化，第一次乳化速度4000rpm，时间5min；第二次乳化速度1500rpm，时间5min；第三次乳化2000rpm，时间5min，静置分层，去除液体石蜡，洗涤，干燥，即得卡波姆微球；
s2：将十二烷基氨基丙酸钠溶于2倍重量的水中，置于研钵内研磨5min，研磨速度500rpm，加入1/3重量份的卡波姆微球和2/3重量份的卵磷脂，继续研磨10min，研磨速度300rpm，加入2/3重量份的卡波姆微球，继续研磨10min，研磨速度200rpm，再加入1/3重量份的卵磷脂，研磨10min，研磨速度500rpm，获得研磨混合物，将研磨混合物和卵磷脂溶于dmso中，即得冷冻保护液。
对照例8
该冷冻保护液的制备方法：
s1：卡波姆微球的制备：
将3/4重量份的卡波姆溶于2重量份的水中，制得卡波姆水溶液；将1/4重量份的卡波姆和磷脂酰丝氨酸加入液体石蜡中混合均匀形成油相，将卡波姆水溶液加入到油相中，经剪切机乳化，第一次乳化速度2500rpm，时间5min，静置1min；第二次乳化速度4500rpm，时间5min，静置5min；第三次乳化5000rpm，时间10min，静置分层，去除液体石蜡，洗涤，干燥，即得卡波姆微球；
s2：将十二烷基氨基丙酸钠溶于2倍重量的水中，置于研钵内研磨5min，研磨速度500rpm，加入1/3重量份的卡波姆微球和1/3重量份的卵磷脂，继续研磨10min，研磨速度200rpm，加入2/3重量份的卡波姆微球和2/3重量份的卵磷脂，继续研磨20min，研磨速度500rpm，获得研磨混合物，将研磨混合物和卵磷脂溶于dmso中，即得冷冻保护液。
对照例9
对照例10
对照例11
对照例12
试验例羊膜干细胞和绒毛膜干细胞的冻存及复苏后活力的检测
收集羊膜干细胞和绒毛膜干细胞，分别采用实施例1-7和对照例1-12的冷冻保护液保存，置于液氮中，分别在的冻存1个月、2个月、3个月、6个月、9个月和12个月从液氮中取出冻存的羊膜干细胞和绒毛膜干细胞，置于37℃的水浴中，复苏1-2min，用台盼蓝染色法进行细胞计数，计算细胞存活率，检测结果见表1。细胞存活率＝(复苏后羊膜干细胞和绒毛膜干细胞总数-冻存前羊膜干细胞和绒毛膜干细胞总数)/冻存前羊膜干细胞和绒毛膜干细胞总数。
表1各实施例和对照例冷冻保护液冻存细胞复苏后细胞存活率的检测结果
从表中可以看出，与cn102763642a(二甲基亚砜、人ab血浆、勃脉力a注射液体积比1:3:6)相比，本发明实施例1-7提供的冷冻保护液可以长期保存羊膜干细胞和绒毛膜干细胞，保存12个月后，细胞存活率均超过87.3％，表明本发明提供的冷冻保护液可以用于长时间保存羊膜干细胞和绒毛膜干细胞，与实施例1相比，实施例4-8提供的冷冻保护液可以进一步提高对羊膜干细胞和绒毛膜干细胞的保存时间，保存12个月后，细胞存活率仍然超过91.3％以上，从对照例保存的细胞存活率可以看出，当对冷冻保护液中的各成分进行替换、删除或者改变冷冻保护液的制备方法均会影响冷冻保护液冻存的细胞活力及冻存的时间。