本发明属于干细胞冻存技术领域，特别涉及一种直接应用的间充质干细胞冻存液及其制备方法。
背景技术：
间充质干细胞(mesenchymalstemcells，mscs)是一种具有自我复制能力和多向分化潜能的成体干细胞。间充质干细胞具有来源广泛、取材方便、体外扩增简单迅速、扩增培养后分化能力不变等优点，在临床疾病的治疗中具有广阔的应用前景。其应用途径有静脉输注、局部注射等方式，静脉输注这种方式因其操作简单、调节全身免疫状态效果好等优点成为比较常用的方法，临床应用间充质干细胞的一个疗程通常需要多次输注间充质干细胞，每次输注相隔一定时间，一个疗程大约1-2个月完成。所以间充质干细胞的保存，并且复苏后的活率是该间充质干细胞应用最关键的瓶颈。
现有冻存液技术是将胎牛血清、细胞培养基及dmso(二甲基亚砜)按照一定比例混合成冻存液来存储间充质干细胞。dmso具有一定的副作用，因此临床应用通常控制在5％-10％浓度范围内；冻存液中的胎牛血清及细胞培养基需要在间充质干细胞应用前经过反复洗涤去除，才能够进行静脉注射，并且长期接触胎牛血清有可能引起细胞某些蛋白表达及特性的变化，细胞回输人体后有可能引起过敏反应。另外一种间充质干细胞冻存液中虽然不含有胎牛血清，而是以细胞培养基、人白蛋白及dmso配制成间充质干细胞冻存液，但是其复苏后细胞活率低，无法长时间保存细胞，因此不能满足临床应用1个疗程的时间要求。另外还有一种由dmso、人ab血浆、勃脉力a注射液组成的间充质干细胞冻存液，其虽然不含培养基和牛血清等，可以直接应用与人体，但是该冻存液冻存的细胞活力仍很低，并且人ab血浆可能出现人体不耐受的情况，进而产生副作用。
技术实现要素：
为了解决上述技术问题，本发明提供一种直接应用的间充质干细胞冻存液及其制备方法，该冻存液可以长期保存间充质干细胞，并且可长期保存细胞活力，并且所使用的成分不需要经过洗涤，直接用于人体。
本发明具体技术方案如下：
本发明提供一种直接应用的间充质干细胞冻存液，该冻存液主要由下列重量份数的组分组成：
进一步的改进，所述聚乙二醇微球是由如下重量份数成分制备而成：
聚乙二醇4002.8-3.5
壳聚糖0.5-1.2。
本发明提供的直接应用的间充质干细胞冻存液，将dmso替换成生理盐水，克服了dmso超过用量范围后可能存在的风险问题，并且在生理盐水内加入淀粉甘醇酸钠、聚乙二醇微球和甘油的混合物制成的冻存液可显著提高该冻存液对间充质干细胞冻存的时间，长期保存细胞的活力，并且该冻存液不用经过洗涤可直接应用于人体。
进一步的改进，所述聚乙二醇微球是通过如下方法制备得到的：配置浓度为15.4g/ml的壳聚糖水溶液；将聚乙二醇400加入液体石蜡中混合均匀形成油相，将壳聚糖水溶液加入到油相中，经剪切机乳化，然后加入交联剂，室温搅拌发生交联反应1-2h，静置分层，去除液体石蜡，洗涤，干燥，即得聚乙二醇微球。
进一步的改进，所述冻存液中还包括重量份数为2-3份的吐温80和0.5-1份的月桂酰谷氨酸钠。
本发明通过在冻存液内加入吐温80和月桂酰谷氨酸钠的混合物可以进一步提高冻存液对间充质干细胞的保存时间，提高细胞复苏后的活率，并且还可以提高冻存液的稳定性。
进一步的改进，所述冻存液主要由下列重量份数的组分组成：
本发明另一方面提供一种直接应用的间充质干细胞冻存液的制备方法，该方法包括如下步骤：
s1：聚乙二醇微球的制备：
配置浓度为15.4g/ml的壳聚糖水溶液；将聚乙二醇400加入液体石蜡中混合均匀形成油相，将壳聚糖水溶液加入到油相中，经剪切机乳化，然后加入交联剂，室温搅拌发生交联反应1-2h，静置分层，去除液体石蜡，洗涤，干燥，即得聚乙二醇微球；
s2：将淀粉甘醇酸钠和聚乙二醇微球置于研钵中研磨，获得研磨混合物，将研磨混合物溶于生理盐水和甘油的混合物中，即得冻存液。
进一步的改进，聚乙二醇微球和液体石蜡的重量份数比为3.3-4.7：20-30。
进一步的改进，剪切机乳化的具体条件为：第一次乳化速度5000rpm，时间7.5min，静置2.5min；第二次乳化速度2500rpm，时间20min，静置4min；第三次乳化1500rpm，时间7.5min。
进一步的改进，所述交联剂为过氧化氢二异丙苯。
进一步的改进，研磨的具体步骤为：将淀粉甘醇酸钠溶于2.5倍重量的水中，置于研钵内研磨5min，研磨速度300rpm，加入1/3重量份的聚乙二醇微球，继续研磨，研磨速度200rpm，继续研磨至含水量小于20％水总重量，加入2/3重量份的聚乙二醇微球，研磨速度500rpm，继续研磨10min，研磨速度100rpm，研磨3min，获得研磨混合物。
本发明通过对保存液制备方法的限定，能够显著提高冻存液对细胞的活力。
本发明提供的直接应用的间充质干细胞冻存液，将dmso替换成生理盐水，克服了dmso超过用量范围后可能存在的风险问题，并且在生理盐水内加入淀粉甘醇酸钠、聚乙二醇微球和甘油的混合物制成的冻存液可显著提高该冻存液对间充质干细胞的保存活力，并且该冻存液不用经过洗涤可直接应用于人体。
具体实施方式
实施例1
实施例2
聚乙二醇微球是通过如下方法制备得到的：配置浓度为15.4g/ml的壳聚糖水溶液；将聚乙二醇400加入液体石蜡中混合均匀形成油相，将壳聚糖水溶液加入到油相中，经剪切机乳化，然后加入交联剂，室温搅拌发生交联反应1-2h，静置分层，去除液体石蜡，洗涤，干燥，即得聚乙二醇微球。
实施例3
该冻存液的制备方法：
s1：聚乙二醇微球的制备：
配置浓度为15.4g/ml的壳聚糖水溶液；将聚乙二醇400加入液体石蜡中混合均匀形成油相，将壳聚糖水溶液加入到油相中，经剪切机乳化，然后加入交联剂，室温搅拌发生交联反应1-2h，静置分层，去除液体石蜡，洗涤，干燥，即得聚乙二醇微球；
s2：将淀粉甘醇酸钠和聚乙二醇微球置于研钵中研磨，获得研磨混合物，将研磨混合物溶于生理盐水和甘油的混合物中，即得冻存液。
实施例4
该冻存液的制备方法：
s1：聚乙二醇微球的制备：
配置浓度为15.4g/ml的壳聚糖水溶液；将聚乙二醇400加入25g液体石蜡中混合均匀形成油相，将壳聚糖水溶液加入到油相中，经剪切机乳化，第一次乳化速度5000rpm，时间7.5min，静置2.5min；第二次乳化速度2500rpm，时间20min，静置4min；第三次乳化1500rpm，时间7.5min；然后加入过氧化氢二异丙苯，室温搅拌发生交联反应2h，静置分层，去除液体石蜡，洗涤，干燥，即得聚乙二醇微球；
s2：将淀粉甘醇酸钠溶于2.5倍重量的水中，置于研钵内研磨5min，研磨速度300rpm，加入1/3重量份的聚乙二醇微球，继续研磨，研磨速度200rpm，继续研磨至含水量小于20％水总重量，加入2/3重量份的聚乙二醇微球，研磨速度500rpm，继续研磨10min，研磨速度100rpm，研磨3min，获得研磨混合物，将研磨混合物溶于生理盐水和甘油的混合物中，即得冻存液。
实施例5
实施例6
实施例7
该冻存液的制备方法：
s1：聚乙二醇微球的制备：
配置浓度为15.4g/ml的壳聚糖水溶液；将聚乙二醇400加入液体石蜡中混合均匀形成油相，将壳聚糖水溶液加入到油相中，经剪切机乳化，然后加入交联剂，室温搅拌发生交联反应1-2h，静置分层，去除液体石蜡，洗涤，干燥，即得聚乙二醇微球；
s2：将淀粉甘醇酸钠和聚乙二醇微球置于研钵中研磨，获得研磨混合物，将研磨混合物、吐温80和月桂酰谷氨酸钠溶于生理盐水和甘油的混合物中，即得冻存液。
实施例8
该冻存液的制备方法：
s1：聚乙二醇微球的制备：
配置浓度为15.4g/ml的壳聚糖水溶液；将聚乙二醇400加入25g液体石蜡中混合均匀形成油相，将壳聚糖水溶液加入到油相中，经剪切机乳化，第一次乳化速度5000rpm，时间7.5min，静置2.5min；第二次乳化速度2500rpm，时间20min，静置4min；第三次乳化1500rpm，时间7.5min；然后加入过氧化氢二异丙苯，室温搅拌发生交联反应2h，静置分层，去除液体石蜡，洗涤，干燥，即得聚乙二醇微球；
s2：将淀粉甘醇酸钠溶于2.5倍重量的水中，置于研钵内研磨5min，研磨速度300rpm，加入1/3重量份的聚乙二醇微球，继续研磨，研磨速度200rpm，继续研磨至含水量小于20％水总重量，加入2/3重量份的聚乙二醇微球，研磨速度500rpm，继续研磨10min，研磨速度100rpm，研磨3min，获得研磨混合物，将研磨混合物、吐温80和月桂酰谷氨酸钠溶于生理盐水和甘油的混合物中，即得冻存液。
对照例1
对照例2
对照例3
对照例4
对照例5
对照例6
对照例7
该冻存液的制备方法：
s1：聚乙二醇微球的制备：
配置浓度为15.4g/ml的壳聚糖水溶液；将聚乙二醇400加入25g液体石蜡中混合均匀形成油相，将壳聚糖水溶液加入到油相中，经剪切机乳化，第一次乳化速度2000rpm，时间5min；第二次乳化速度5000rpm，时间10min；第三次乳化500rpm，时间10min；然后加入过氧化氢二异丙苯，室温搅拌发生交联反应2h，静置分层，去除液体石蜡，洗涤，干燥，即得聚乙二醇微球；
s2：将淀粉甘醇酸钠溶于2.5倍重量的水中，置于研钵内研磨5min，研磨速度300rpm，加入1/3重量份的聚乙二醇微球，继续研磨，研磨速度200rpm，继续研磨至含水量小于20％水总重量，加入2/3重量份的聚乙二醇微球，研磨速度500rpm，继续研磨10min，研磨速度100rpm，研磨3min，获得研磨混合物，将研磨混合物溶于生理盐水和甘油的混合物中，即得冻存液。
对照例8
该冻存液的制备方法：
s1：聚乙二醇微球的制备：
配置浓度为15.4g/ml的壳聚糖水溶液；将聚乙二醇400加入25g液体石蜡中混合均匀形成油相，将壳聚糖水溶液加入到油相中，经剪切机乳化，第一次乳化速度5000rpm，时间7.5min，静置2.5min；第二次乳化速度2500rpm，时间20min，静置4min；第三次乳化1500rpm，时间7.5min；然后加入过氧化氢二异丙苯，室温搅拌发生交联反应2h，静置分层，去除液体石蜡，洗涤，干燥，即得聚乙二醇微球；
s2：将淀粉甘醇酸钠溶于2.5倍重量的水中，置于研钵内研磨5min，研磨速度100rpm，加入2/3重量份的聚乙二醇微球，继续研磨，研磨速度300rpm，继续研磨10min，加入1/3重量份的聚乙二醇微球，研磨速度100rpm，继续研磨5min，研磨速度500rpm，研磨5min，获得研磨混合物，将研磨混合物溶于生理盐水和甘油的混合物中，即得冻存液。
对照例9
对照例10
对照例11
对照例12
试验例间充质干细胞的冻存及复苏后活力的检测
收集脐带间充质干细胞，分别采用实施例1-8和对照例1-12的冻存液保存，置于液氮中，分别在的冻存1个月、2个月、3个月、6个月、9个月和12个月从液氮中取出冻存的间充质干细胞，置于37℃的水浴中，复苏1-2min，用台盼蓝染色法进行细胞计数，计算细胞存活率，检测结果见表1。
表1各实施例和对照例冻存液冻存细胞复苏后细胞存活率的检测结果
从表中可以看出，与cn101919378a(二甲基亚砜、人ab血浆、勃脉力a注射液体积比1:3:6)相比，本发明实施例1-8提供的冻存液可以长期保存间充质干细胞，保存12个月后，细胞存活率均超过86.1％，表明本发明提供的冻存液可以用于长时间保存间充质干细胞，与实施例1相比，实施例4-8提供的冻存液可以进一步提高对间充质干细胞的保存时间，保存12个月后，细胞存活率仍然超过90.4％，从对照例保存的细胞存活率可以看出，当对冻存液中的各成分进行替换、删除或者改变冻存液的制备方法均会降低冻存液冻存的细胞活力及冻存的时间。