本发明涉及细胞领域，特别涉及一种冻存表皮干细胞的复苏方法。
背景技术：
：表皮基底部具有不断增殖和分化能力的干细胞称为表皮干细胞。表皮干细胞为皮肤组织中的专能干细胞，是一种成年组织干细胞，可增殖分化为表皮中各种细胞成分，保持皮肤正常的表皮结构。表皮干细胞作为组织特异性干细胞，具有高增殖能力及可分化形成全层表皮的能力，是组织工程皮肤的重要种子细胞。冷冻保存是干细胞的研究及其应用的核心技术之一，安全高效的表皮干细胞冻存方法是表皮干细胞广泛用于研究和应用的必要条件。马英智.利用人表皮干细胞和人真皮成纤维细胞体外构建组织工程符合皮肤的研究[D].吉林大学,2009.的论文中以人表皮干细胞作为种子细胞，利用鼠尾胶原制备真皮支架材料，体外构建组织工程复合皮肤，其中28页有介绍表皮干细胞的冻存与复苏，其在实际应用中，表皮干细胞存在冷冻与复苏的效果不够理想，体外培养的表皮干细胞常常会发生破裂，比较脆弱，成活率比较低。技术实现要素：针对现有技术存在的不足，本发明的目的在于提供一种表干细胞的复苏液，使用该复苏液的表皮干细胞具有良好的成活率。本发明的上述技术目的是通过以下技术方案得以实现的：一种表皮干细胞的复苏液，包括如下重量份数的组分，通过上述技术方案，组分中糖类物质能够提供表皮干细胞正常生长的营养物质；表皮生长因子是人体内存在的一种生长因子，他的主要功能是促进皮肤细胞的分裂，极微量的表皮生长因子既能强烈刺激细胞生长，抑制衰老基因表达，阻止皮肤衰老，使皮肤各成分保持最佳生理状态，此外还能够刺激细胞外的一些大分子的合成和分泌，滋养皮肤，是决定皮肤活力和健康的关键因素；碱性成纤维细胞生长因子作为化学趋化剂趋化多种炎性细胞、组织细胞与修复因子，向创面或伤口迁移，为创面杀菌以及后期修复创造重要和必须条件；利用多聚赖氨酸处理培养皿的表面后采用含血清的培养液，能够促进细胞的黏附；胶质细胞源神经营养因子在神经系统的发育、生长、损伤及修复等过程中发挥重要的神经营养作用，在神经系统中的分布广泛，其神经影响活性较高，不仅可以保护多巴胺运动神经元，对于中枢及外周的神经元及交感神经元等多种神经元具有营养作用；胰蛋白酶是动物消化道中一种主要的碱性蛋白水解酶，属于丝氨酸蛋白酶家族，其在动物细胞培养液中可用于分散组织中的细胞以及使贴壁生长的细胞脱落，而且胰蛋白酶会选择性的水解蛋白质中的赖氨酸；胎牛血清是细胞培养中用量最大的天然培养基，含有丰富的细胞生长必须的营养成份，常用于动物细胞的体外培养，具有极为重要的功能，其能提供结合蛋白，识别维生素、脂类、金属和其他激素等，能结合或调变它们所结合的物质活力，有些情况下结合蛋白质能与有毒金属和热原质结合，起到解毒作用，是细胞贴壁、铺展在塑料培养基质上所需因子来源，起酸碱度缓冲液作用，能提供蛋白酶抑制剂，使在细胞传代时使剩余胰蛋白酶失活，保护细胞不受伤害，胎牛血清是品质最高的，因为胎牛还未接触外界，血清中所含的抗体、补体等对细胞有害的成分最少。本发明进一步设置为：所述组分中还包括有氯化钙、氯化钠和氯化钾中的一种或两种。通过上述技术方案，上述组分在使用过程中能够起到提供表皮干细胞生长所需的无机盐类。本发明进一步设置为：所述氯化钙的质量份数为0.1-0.2份，氯化钠的质量分数为1-1.2份，氯化钾的质量份数为0.2-0.3份。通过上述技术方案，选择上述组分含量既能够符合规定的使用量，而且在该范围内，还不会出现由于含量添加不合适所导致的表皮干细胞的正常生长受到影响。本发明进一步设置为：所述组分中还包括有重量份为0.01-0.02份的中性蛋白酶。通过上述技术方案，中性蛋白酶是由枯草芽孢杆菌经发酵提取而得的，属于一种内切酶，可用于各种蛋白质水解处理，在一定温度、PH值下，本品能将大分子蛋白质水解为氨基酸等产物，可以提供细胞生长所需的氨基酸。本发明进一步设置为：所述组分中还包括有重量份为0.01-0.06份的聚维酮。通过上述技术方案，聚维酮是性能优异、用途广泛的水溶性高分子化合物，属高科技含量、高附加值精细化工产品，是重要化工中间体和医药中间体。本发明进一步设置为：所述组分中还包括有碳酸氢钠和碳酸钠，所述碳酸氢钠与碳酸钠的重量份数的比值为1:1。通过上述技术方案，碳酸钠和碳酸氢钠在组分中即作为无机盐提供所需的元素，而且还能作为缓冲对使用，调节复苏液的pH维持在稳定的状态。本发明进一步设置为：所述组分中还包括有100u/ml的青霉素或链霉素。通过上述技术方案，青霉素和链霉素能够有效促进表皮干细胞的增值，同时青霉素和链霉素也能够降低细胞外分泌物成分的表达，选择该含量能够使得效果达到充分的发挥。本发明进一步设置为：所述糖类物质选择葡萄糖、海藻糖、透明质酸、壳聚糖中的至少一种。通过上述技术方案，葡萄糖是细胞生长必须的碳源和能源物质，在细胞生长代谢过程中起重要作用；海藻糖的加入一放慢是提供能源，另一方面能够明显的提高表皮干细胞的复苏率；透明质酸是一种高度保守的不分支的阴离子多糖,广泛存在于中,属于的一种,尤其在结缔组织含量丰富，透明质酸具有高度水化的性能,在对组织内部的水分平衡、关节的润滑以及稳定软骨基质等方面发挥着重要的作用。高纯度的透明质酸免疫原性低,生物相容性好,其降解物对创面愈合具有促进作用,而且透明质酸在体内可被血清中的透明质酸酶所降解。透明质酸在药物佐剂、骨固定物以及皮肤覆盖物等方面都已有应用,但由于透明质酸的力学强度不够,无法单独应用于构建组织工程支架,多数情况下需要与其他种类的组织工程支架复合使用；壳聚糖是一种带有多氨基的多糖类物质,是甲壳素脱乙酞化的产物,其来源非常广泛,壳聚糖虽然不是人体中细胞外基质的构成物,但其结构和一些性质与细胞外基质的主要成分非常类似,由于壳聚糖分子链上富含氨基与轻基,非常便于对壳聚糖进行改性,以改变其溶解性和加工性能，壳聚糖具有良好的生物相容性和可降解性,无刺激性、无免疫原性、无热源反应及促进创面愈合的功能,而且易于加工成多样形状的支架，同时其具有止血活性和抗炎症性能，并能促进创伤愈合。本发明的另一发明目的在于提供一种表皮干细胞的复苏方法，包括如下的复苏步骤，步骤1：将冻存于液氮中的表皮干细胞，置于37±5℃的水浴中迅速晃动，使冻存的干细胞溶解；步骤2：将步骤1中溶解后的表皮干细胞加入到37±2℃复苏液中；步骤3：在1000rpm下离心5～10min后除去上清液；步骤4：向细胞沉淀内加入复苏液，轻轻吹打混匀，将细胞悬液转移到培养瓶内，补足复苏液在5％CO2温箱静置培养；步骤5：24h后更换复苏液，继续培养，观察生长情况。通过上述技术方案，通过上述的步骤能够快速的对冷冻的表皮干细胞进行解冻，控制适当的温度能够使得细胞解冻并且减小温度因素对存活率的影响，而复苏液的温度保持与水浴相近的温度能够减少温度差带来的影响，而离心除去上清液是使细胞形成微团，通过该方法操作复苏的表皮干细胞的存活率能够有所提高。本发明进一步设置为：所述步骤1中的溶解时间保持在1-2min内。通过上述技术方案，溶解时间选择1-2min，能使得表皮干细胞充分溶解，而同时也不会对表皮干细胞造成太大的影响。综上所述，本发明对比于现有技术的有益效果为：1、该复苏液在使用中主要用于表皮干细胞，其中表皮生长因子的加入能够刺激细胞生长、抑制衰老基因表达、阻止皮肤衰老，所以当该表皮干细胞用于美容行业是能够产生优良的效果；2、当壳聚糖与赖氨酸一起作用时能够促进表皮干细胞的生长；3、海藻糖在配合酪氨酸一起使用时同样能够提高表皮干细胞的生长；4、复苏液的pH能够维持在一个稳定的范围内，保证了良好的生长环境。具体实施方式以下结合实施例对本发明作进一步详细说明。本申请文件中的表皮干细胞标本来源于浙江医院泌尿外科15-56岁包皮环切术患者，患者均无泌尿系感染等疾病，且知情同意。选自美国sigma的表皮生长因子。选自日本Zentrifugen的低温高速离心机。一种复苏液实施例1-7中的组分均按重量份计算。实施例1实施例2实施例3实施例4实时例5实施例6实施例7一种表皮干细胞的复苏方法实施例8步骤1：将冻存于液氮中的表皮干细胞，置于32℃的水浴中迅速晃动，使冻存的干细胞溶解1min；步骤2：将步骤1中溶解后的表皮干细胞加入到32℃实施例1组分的复苏液中；步骤3：在1000rpm下离心5min后除去上清液；步骤4：向细胞沉淀内加入实施例1组分的复苏液，轻轻吹打混匀，将细胞悬液转移到培养瓶内，补足复苏液在5％CO2温箱静置培养；步骤5：24h后更换复苏液，继续培养，观察生长情况。实施例9步骤1：将冻存于液氮中的表皮干细胞，置于34℃的水浴中迅速晃动，使冻存的干细胞溶解1.1min；步骤2：将步骤1中溶解后的表皮干细胞加入到34℃实施例2组分的复苏液中；步骤3：在1000rpm下离心6min后除去上清液；步骤4：向细胞沉淀内加入实施例2组分的复苏液，轻轻吹打混匀，将细胞悬液转移到培养瓶内，补足复苏液在5％CO2温箱静置培养；步骤5：24h后更换复苏液，继续培养，观察生长情况。实施例10步骤1：将冻存于液氮中的表皮干细胞，置于35℃的水浴中迅速晃动，使冻存的干细胞溶解1.3min；步骤2：将步骤1中溶解后的表皮干细胞加入到35℃实施例3组分的复苏液中；步骤3：在1000rpm下离心7min后除去上清液；步骤4：向细胞沉淀内加入实施例3组分的复苏液，轻轻吹打混匀，将细胞悬液转移到培养瓶内，补足复苏液在5％CO2温箱静置培养；步骤5：24h后更换复苏液，继续培养，观察生长情况。实施例11步骤1：将冻存于液氮中的表皮干细胞，置于37℃的水浴中迅速晃动，使冻存的干细胞溶解1.5min；步骤2：将步骤1中溶解后的表皮干细胞加入到37℃实施例4组分的复苏液中；步骤3：在1000rpm下离心7.5min后除去上清液；步骤4：向细胞沉淀内加入实施例4组分的复苏液，轻轻吹打混匀，将细胞悬液转移到培养瓶内，补足复苏液在5％CO2温箱静置培养；步骤5：24h后更换复苏液，继续培养，观察生长情况。实施例12步骤1：将冻存于液氮中的表皮干细胞，置于39℃的水浴中迅速晃动，使冻存的干细胞溶解1.7min；步骤2：将步骤1中溶解后的表皮干细胞加入到39℃实施例5组分的复苏液中；步骤3：在1000rpm下离心8min后除去上清液；步骤4：向细胞沉淀内加入实施例5组分的复苏液，轻轻吹打混匀，将细胞悬液转移到培养瓶内，补足复苏液在5％CO2温箱静置培养；步骤5：24h后更换复苏液，继续培养，观察生长情况。实施例13步骤1：将冻存于液氮中的表皮干细胞，置于40℃的水浴中迅速晃动，使冻存的干细胞溶解1.8min；步骤2：将步骤1中溶解后的表皮干细胞加入到40℃实施例6组分的复苏液中；步骤3：在1000rpm下离心9min后除去上清液；步骤4：向细胞沉淀内加入实施例6组分的复苏液，轻轻吹打混匀，将细胞悬液转移到培养瓶内，补足复苏液在5％CO2温箱静置培养；步骤5：24h后更换复苏液，继续培养，观察生长情况。实施例14步骤1：将冻存于液氮中的表皮干细胞，置于42℃的水浴中迅速晃动，使冻存的干细胞溶解2min；步骤2：将步骤1中溶解后的表皮干细胞加入到42℃实施例7组分的复苏液中；步骤3：在1000rpm下离心10min后除去上清液；步骤4：向细胞沉淀内加入实施例7组分的复苏液，轻轻吹打混匀，将细胞悬液转移到培养瓶内，补足复苏液在5％CO2温箱静置培养；步骤5：24h后更换复苏液，继续培养，观察生长情况。实验结果检测细胞死活鉴定及计数鉴定方法用95％酒精冲洗血球计数板及盖玻片，烘干；将盖玻片覆在计数板上面，露出计数板台面少许；用干净的吸管在培养瓶中吸取细胞悬液，向一试管中滴加6滴，在滴入0.4％台盼蓝3滴，混匀，染色3min；若细胞悬液含细胞过多，可用复苏液稀释，然后进行染色；之后向计数板边缘滴加1-2滴已染色的细胞悬液，显微镜下观察和计数，其中活细胞不着色，死细胞被染上蓝色；分别统计角上4个大方格内的活细胞和死细胞数。活细胞个数＝(4个大方格中的活细胞总数/4)×104×稀释倍数复苏率计算表1实施例8-14的表皮干细胞的复苏率项目实施例8实施例9实施例10实施例11实施例12实施例13实施例14复苏率/％40424445474640通过上述实验结果可以看出，实施例8-14中的表皮干细胞的复苏率保持在40-47％之间，在实施例12中复苏率最大。所以选择实施例12作为实施例8-14的最优实施例对比例1对比例1与实施例1的区别再与对比例1中不含有壳聚糖，其他均与实施例12保持一致。对比例2对比例2与实施例12的区别在于对比例2中不含有多聚赖氨酸，其他均与实施例12保持一致。对比例3对比例3与实施例12的区别在于对比例2中同时不含有壳聚糖和多聚赖氨酸，其他均与实施例12保持一致。低比例4对比例4与实施例12的区别在于对比例2中不含有海藻糖，其他均与实施例12保持一致。对比例5对比例4与实施例12的区别在于对比例2中同时不含有海藻糖和多聚赖氨酸，其他均与实施例12保持一致。实验检测按照上述的检验步骤，测定对比例1-5的存活率表2对比例1-5的表皮干细胞的复苏率项目实施例12对比例1对比例2对比例3对比例4对比例5复苏率/％474044324130对比对比例1与实施例12，在保持其他条件不变的情况下，当对比例1中不含有壳聚糖时，表皮干细胞的复苏率明显降低，实验结果证明壳聚糖能够提高表皮干细胞的复苏率；对比对比例2与实施例12，在保持其他条件不变的情况下，当对比例2中不含有多聚赖氨酸时，对比例2中的表皮干细胞的复苏率也存在明显的下降，所以说明多聚赖氨酸在表皮干细胞的复苏中也起着重要的作用；对比对比例3与实施例12，对比例3中同时不含有壳聚糖和多聚赖氨酸，从实验结果能够看出对比例3中的表皮干细胞的复苏率存在明显的下降，而且比对比例1与对比例2的加和效果还要低，则通过实验数据本申请人可以合理的推导出壳聚糖和多聚赖氨酸间存在符合的作用效果，能够提高表皮干细胞的复苏率；对比对比例4与对比例12，在保持其他条件不变的情况下，对比例4中不含有海藻糖，通过比较实验结果发现，表皮干细胞的复苏率存在明显的下降，则说明海藻糖的存在能够增加表皮干细胞复苏率；而对比对比例5与实施例12，在保持其他条件不变的情况下，发现当对比例5中同时不含有海藻糖和多聚赖氨酸时，对比例5的表皮干细胞的复苏率也存在着较大程度的下降，而且下降的幅度大于分别只含有海藻糖或多聚赖氨酸时的作用的加和效果，所以说明海藻糖和多聚赖氨酸之间存在中符合的作用效果能够提高表皮干细胞的复苏率。以上所述仅是本发明的示范性实施方式，而非用于限制本发明的保护范围，本发明的保护范围由所附的权利要求确定。当前第1页1 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