本发明属于细胞培养技术领域，具体涉及一种成纤维细胞培养基及其制备方法。
背景技术：
成纤维细胞(fibroblast)是疏松结缔组织的主要细胞成分，由胚胎时期的间充质细胞(mesenchymal cell)分化而来。肺成纤维细胞(lung fibroblast，LF)是体内外研究肺纤维化及其他肺部疾病的主要细胞，原代新生大鼠的肺成纤维细胞由于直接来源于机体组织，生物性状尚未发生较大的变化，能较好反应体内的生长特性，因此广泛用于药理、毒理、药效试验。
目前，用于成纤维细胞无血清培养基存在的共同问题：①白蛋白作为血清的主要成分，是无血清培养基中普遍的添加成分，由于牛血清白蛋白(BSA)为动物源性蛋白，可能携带致病因子；目前的无动物源性培养基多是采用重组白蛋白(HSA)替代BSA，导致培养基成本较高。②血清中含有多种贴壁因子，依赖血清的细胞在无血清培养时则不易贴壁，所以在无血清培养贴壁细胞时，需要提前包被贴壁因子，增加了操作的复杂性，而且常用的贴壁因子(如胶原、多聚赖氨酸、纤连蛋白、层粘连蛋白等)价格昂贵，提高了培养基成本。③多数无血清培养基的使用需给细胞一个适应过程，逐步降低培养基中血清浓度，最终过渡到无血清培养；另外，在用于原代培养时，还需要额外添加2％的血清，使其不成为真正意义上的无血清培养。④无血清培养基传代次数较少，例如，ATCC公司的Fibroblast GrowthKit Serum-Free培养基在说明书中明确指出，培养10代之后细胞增殖速率减缓。
中国专利申请(CN103911339A)公开了一种无血清成纤维细胞培养基及其制备方法，本发明的基础培养基为DMEM培养基或其与F12培养基的混合；外源添加物包括激素、转金属蛋白、谷氨酰胺、脂类浓缩剂、抗氧化剂、嘌呤、糖类和细胞生长因子。
中国专利申请(CN101795668B)提供了一种成纤维细胞增殖剂，其含有酵母提取物和红花提取物作为有效成分，有效地提高皮肤成纤维细胞的增殖，但是在成纤维细胞培养的过程中，细胞培养基中均含有牛血清，因此，成纤维细胞增殖剂的发明并没有解决牛血清带来的安全隐患，并且此成纤维细胞增殖剂主要应用于化妆品中。
技术实现要素：
为解决上述成纤维细胞无血清细胞培养基存在的不足，本发明提供了一种成纤维细胞培养基，其能够促进成纤维细胞的增殖和贴壁粘附。同时本发明还提供了一种成纤维细胞培养基的制备方法。
本发明培养基通过以下技术方案实现：
一种成纤维细胞培养基，主要由以下成分及其浓度组成：基础培养基10-20g/L，重组白蛋白1-15g/L，柠檬酸铁铵0.1-5mg/L，环庚三烯酚酮2-15μM，硫酸皮肤素0.1-1mg/L，卵磷脂2-15g/L，黄芪多糖1-20mg/L，胰岛素5-15mg/L，地塞米松0.05-5μg/L，谷氨酰胺3-8mM，亚硒酸钠3-7.5μg/L，维生素E 3-17mg/L。
优选地，一种成纤维细胞培养基，主要由以下成分及其浓度组成：基础培养基13-18g/L，重组白蛋白7.5-12g/L，柠檬酸铁铵1-3mg/L，环庚三烯酚酮3-8.5μM，硫酸皮肤素0.75-0.95mg/L，卵磷脂5-13.5g/L，黄芪多糖5.5-12mg/L，胰岛素10-13mg/L，地塞米松0.73-1.25μg/L，谷氨酰胺5-7.5mM，亚硒酸钠4.5-6μg/L，维生素E 8-14mg/L。
优选地，一种成纤维细胞培养基，由以下成分及其浓度组成：基础培养基15.5g/L，重组白蛋白9.5g/L，柠檬酸铁铵2.75mg/L，环庚三烯酚酮5.86μM，硫酸皮肤素0.83mg/L，卵磷脂10.5g/L，黄芪多糖6.85mg/L，胰岛素11.63mg/L，地塞米松0.92μg/L，谷氨酰胺7.32mM，亚硒酸钠5.86μg/L，维生素E 13.2mg/L。
优选地，所述基础培养基为DMEM/F12培养基。
一种成纤维细胞培养基制备方法，包括以下步骤：
(1)准确称取DMEM/F12基础培养基干粉，重组白蛋白，柠檬酸铁铵，环庚三烯酚酮，壳聚糖，硫酸皮肤素，卵磷脂，亚硒酸钠和黄芪多糖，溶于40-45℃900mL超纯水中，搅拌至均匀得溶液I；
(2)将溶液I冷却至15-20℃后，加入胰岛素，地塞米松和谷氨酰胺，搅拌均匀，用超纯水定容至1L，得溶液II；
(3)将溶液II用1mol/L氢氧化钠溶液或1mol/L盐酸溶液调pH至7.2，得溶液III；
(4)将溶液III用0.2μm滤膜正压过滤除菌，即得。
本发明培养基是经过大量科学实验获得的，培养基中硫酸皮肤素(DS)为二糖聚合物，是动物体内分布最广泛的一种细胞外基质糖胺多糖。黄芪多糖由己糖醛酸、葡萄糖、果糖、鼠李糖、阿拉伯糖、半乳糖醛酸和葡萄糖醛酸等组成，可作为免疫促进剂或调节剂，同时具有抗病毒、抗肿瘤、抗衰老、抗辐射、抗应激、抗氧化等作用。柠檬酸铁铵和环庚三烯酚酮相结合能够促进铁地运输，可替代转铁蛋白；重组白蛋白由重组酵母生产得到，对细胞生长起重要的促进作用。胰岛素，地塞米松属于糖皮质激素，在本发明培养基浓度范围内对成纤维细胞起增殖促进作用。
本发明培养基与现有无血清细胞培养基相比具有以下优点：本发明培养基能够促进成纤维细胞的增殖和贴壁粘附。
附图说明
图1成纤维细胞在不同培养基中的生长曲线图：培养基为实施例1、对比例1、对比例2制备得到的培养基。
具体实施方式
下面结合附图和实施例对本发明做进一步详细说明，但这并非是对本发明的限制，本领域技术人员根据本发明的基本思想，可以做出各种修改或改进，但是只要不脱离本发明的基本思想，均在本发明的范围之内。
原料来源：
DMEM/F12培养基干粉：索莱宝生物科技有限公司；硫酸皮肤素，购于淮安麦德森制药有限公司；黄芪多糖，购于湖北佳诺信生物化工有限公司。
实施例1一种成纤维细胞培养基
一种成纤维细胞培养基，由以下成分及其浓度组成：DMEM/F1215.5g/L，重组白蛋白9.5g/L，柠檬酸铁铵2.75mg/L，环庚三烯酚酮5.86μM，硫酸皮肤素0.83mg/L，卵磷脂10.5g/L，黄芪多糖6.85mg/L，胰岛素11.63mg/L，地塞米松0.92μg/L，谷氨酰胺7.32mM，亚硒酸钠5.86μg/L，维生素E 13.2mg/L。
制备方法：
(1)准确称取DMEM/F12基础培养基干粉，重组白蛋白，柠檬酸铁铵，环庚三烯酚酮，壳聚糖，硫酸皮肤素，卵磷脂，亚硒酸钠和黄芪多糖，溶于43℃900mL超纯水中，搅拌至均匀得溶液I；
(2)将溶液I冷却至16℃后，加入胰岛素，地塞米松和谷氨酰胺，搅拌均匀，用超纯水定容至1L，得溶液II；
(3)将溶液II用1mol/L氢氧化钠溶液或1mol/L盐酸溶液调pH至7.2，得溶液III；
(4)将溶液III用0.2μm滤膜正压过滤除菌，即得。
实施例2一种成纤维细胞培养基
一种成纤维细胞培养基，由以下成分及其浓度组成：DMEM/F1210g/L，重组白蛋白1g/L，柠檬酸铁铵0.1mg/L，环庚三烯酚酮2μM，硫酸皮肤素0.1mg/L，卵磷脂2g/L，黄芪多糖1mg/L，胰岛素5mg/L，地塞米松0.05μg/L，谷氨酰胺3mM，亚硒酸钠3μg/L，维生素E 3mg/L。
一种成纤维细胞培养基制备方法，分为以下步骤：
(1)准确称取DMEM/F12基础培养基干粉，重组白蛋白，柠檬酸铁铵，环庚三烯酚酮，壳聚糖，硫酸皮肤素，卵磷脂，亚硒酸钠和黄芪多糖，溶于40℃900mL超纯水中，搅拌至均匀得溶液I；
(2)将溶液I冷却至15℃后，加入胰岛素，地塞米松和谷氨酰胺，搅拌均匀，用超纯水定容至1L，得溶液II；
(3)将溶液II用1mol/L氢氧化钠溶液或1mol/L盐酸溶液调pH至7.2，得溶液III；
(4)将溶液III用0.2μm滤膜正压过滤除菌，即得。
实施例3一种成纤维细胞培养基
一种成纤维细胞培养基，由以下成分及其浓度组成：DMEM/F1220g/L，重组白蛋白15g/L，柠檬酸铁铵5mg/L，环庚三烯酚酮15μM，硫酸皮肤素1mg/L，卵磷脂15g/L，黄芪多糖20mg/L，胰岛素15mg/L，地塞米松5μg/L，谷氨酰胺8mM，亚硒酸钠7.5μg/L，维生素E 17mg/L。
一种成纤维细胞培养基制备方法，分为以下步骤：
(1)准确称取DMEM/F12基础培养基干粉，重组白蛋白，柠檬酸铁铵，环庚三烯酚酮，壳聚糖，硫酸皮肤素，卵磷脂，亚硒酸钠和黄芪多糖，溶于45℃900mL超纯水中，搅拌至均匀得溶液I；
(2)将溶液I冷却至20℃后，加入胰岛素，地塞米松和谷氨酰胺，搅拌均匀，用超纯水定容至1L，得溶液II；
(3)将溶液II用1mol/L氢氧化钠溶液或1mol/L盐酸溶液调pH至7.2，得溶液III；
(4)将溶液III用0.2μm滤膜正压过滤除菌，即得。
实施例4一种成纤维细胞培养基
一种成纤维细胞培养基，由以下成分及其浓度组成：DMEM/F1213g/L，重组白蛋白7.5g/L，柠檬酸铁铵1mg/L，环庚三烯酚酮3μM，硫酸皮肤素0.75mg/L，卵磷脂5g/L，黄芪多糖5.5mg/L，胰岛素10mg/L，地塞米松0.73μg/L，谷氨酰胺5mM，亚硒酸钠4.5μg/L，维生素E 8mg/L。
制备方法与实施例1类似。
实施例5一种成纤维细胞培养基
一种成纤维细胞培养基，由以下成分及其浓度组成：DMEM/F1218g/L，重组白蛋白12g/L，柠檬酸铁铵3mg/L，环庚三烯酚酮8.5μM，硫酸皮肤素0.95mg/L，卵磷脂13.5g/L，黄芪多糖12mg/L，胰岛素13mg/L，地塞米松1.25μg/L，谷氨酰胺7.5mM，亚硒酸钠6μg/L，维生素E 14mg/L。
制备方法与实施例1类似。
对比例1一种成纤维细胞培养基
一种成纤维细胞培养基，由以下成分及其浓度组成：DMEM/F1215.5g/L，重组白蛋白9.5g/L，柠檬酸铁铵2.75mg/L，环庚三烯酚酮5.86μM，硫酸皮肤素0.83mg/L，卵磷脂10.5g/L，黄芪多糖6.85mg/L，胰岛素11.63mg/L，地塞米松0.92μg/L，谷氨酰胺7.32mM，亚硒酸钠5.86μg/L，维生素E 13.2mg/L。
制备方法与实施例1类似。
与实施例1区别在于，黄芪多糖加入量为3.2mg/L。
对比例2一种成纤维细胞培养基
一种成纤维细胞培养基，由以下成分及其浓度组成：DMEM/F1215.5g/L，重组白蛋白9.5g/L，柠檬酸铁铵2.75mg/L，环庚三烯酚酮5.86μM，硫酸皮肤素0.08mg/L，卵磷脂10.5g/L，黄芪多糖6.85mg/L，胰岛素11.63mg/L，地塞米松0.92μg/L，谷氨酰胺7.32mM，亚硒酸钠5.86μg/L，维生素E 13.2mg/L。
制备方法与实施例1类似。
与实施例1区别在于，硫酸皮肤素浓度为0.08mg/L。
试验例1人成纤维细胞的原代培养
将消化后的人成纤维细胞用PBS溶液清洗；离心后用分别用实施例1-5及对比例1-2成纤维细胞培养基重悬，按2×104个/cm2接种至培养瓶中，置入培养箱在37℃、5％CO2条件下培养；24h后换液，继续培养，之后每隔2d换液。原代细胞在各培养基中贴壁率如表1所示。
表1原代成纤维细胞在各培养基中培养24h细胞贴壁情况
由表1可知，实施例1培养基中原代成纤维细胞贴壁率达80％，高于实施例2-5培养基，并且是对比例1中原代成纤维细胞贴壁率的1.4倍。因此，本发明培养基能够促进成纤维细胞贴壁。
试验例2人成纤维细胞的传代培养
将试验例1原代人成纤维细胞培养至60％汇合的细胞消化后，用PBS溶液清洗，离心弃上清后用分别用实施例1、对比例1和对比例2培养基重悬细胞，按1×104个/cm2的细胞密度接种，置于37℃、5％CO2条件培养箱进行培养，测定生长曲线，如图1所示。
由图1可知，实施例1培养基中成纤维细胞比对比例1、2中增殖速度快，增殖倍数高。由此可知，本发明培养基能够促进成纤维细胞生长。