一种骨骼肌干细胞的冻存液和冻存方法与流程

本发明属于细胞生物学领域，具体涉及一种骨骼肌干细胞的冻存液及冻存方法。

背景技术：

间充质干细胞是一类具有自我更新、增殖和多向分化潜能的干细胞，在1966年首先由Friedenstein等从骨髓中发现的。大量研究发现，间充质干细胞不仅可以分化为多种间质组织的细胞，如骨、脂肪、软骨、肌肉、肌腱和韧带等。同时在一定的诱导条件下还可以横向分化为外胚层和内胚层细胞。如上皮细胞、神经元细胞、神经胶质细胞、血管内皮细胞、表皮干细胞等。目前研究表明，间充质干细胞来源十分广泛，除骨髓外，脂肪、脐带华通胶、胎盘、羊膜、肌肉、韧带等均已分离培养出。近年来大量研究证明人体和动物的颅颌面部，特别是牙源性组织中存在具有特殊分化和再生功能的间充质干细胞。近年来因其在组织工程和细胞替代治疗的临床前研究而备受关注。

骨骼肌肌源性干细胞(muscle-derived stem cells，MDSCs)是成年动物或人肌肉组织中特有的干细做为中胚层起源的一种成体间充质干细胞，具有自我更新能力和多项分化的潜能，可在体外分化为血细胞、骨细胞、内皮细胞、神经细胞等系的细胞。骨骼肌干细胞这种功能特性极大地吸引了来自基础医学和临床医学的研究者，给基础科学的研究者们提供了一种研究发展生物学的模式，骨骼肌干细胞所具有的修复、替代和再生能力也为临床医学提供了一个发展新疗法的机会。

近几年，干细胞库建立的需要以及临床上对干细胞的需求增加，对干细胞冻存与复苏方面的研究引起了越来越多的关注。与其他来源MSCs一样，MDSCs作为组织工程学研究和潜在临床应用的种子细胞，其过度传代会表现明显衰老或凋亡，且长期体外培养易发生自发分化，失去多分化潜能，增殖、黏附能力下降，细胞凋亡率增加，所以冻存MDSCs也是其研究应用的重要环节之一。

细胞冻存液是一种细胞冻存时使用的溶液，它可以供给细胞生命代谢所必须的营养物质，同时可以防止或减少冷冻冰晶对细胞的损伤作用。目前常用的细胞冻存液或市售的细胞冻存液中通常是由二甲基亚砜(dimathyl sulfoxide,DMSO)和胎牛血清(fetal bovine serum，FBS)混合组成。DMSO是一种分子量小，且具有强溶解能力和渗透能力的化学物质。在许多研究中，DMSO是最常用的细胞冻存保护剂，用其保存的细胞复苏后与新鲜细胞比较，具有相似的表型、细胞表面标记及生长速率。DMSO的作用机制是在降温过程中透过细胞膜进入细胞内，降低细胞内、外未结冰溶液中电解质浓度，从而保护细胞免受高浓度电解质损伤，同时细胞内水分不会过度外渗，避免细胞过度脱水皱缩。然而，DMSO对细胞有一定毒性作用，浓度过高会引起较高的渗透压，不利于细胞复苏。因此，目前DMSO常规使用浓度为1％-5％。FBS属于异源性物质，成分复杂，并存在引入污染和过敏原的风险，不适合于临床应用。特别是在细胞治疗中，异源性蛋白的存在，可能会引起不必要的，甚至是未知的不良反应，严重影响治疗结果。

技术实现要素：

本发明目的在于针对现有技术存在的问题，提供一种临床安全性高，同时又能很好保持冻存细胞活性的细胞冻存液，用于冻存MDSCs。

为实现本发明的目的，本发明采用如下技术方案。

一种骨骼肌干细胞的冻存液，由DMSO、右旋糖酐40和人血白蛋白注射液组成，所述DMSO、右旋糖酐40和血白蛋白注射液的体积比为1:4:5。

作为优选，所述冻存液中所述人血白蛋白注射液中白蛋白的质量浓度为20％。即25mL人血白蛋白注射液中含5g白蛋白。

本发明还提供了一种骨骼肌干细胞的冻存方法，向骨骼肌干细胞中加入本发明所述冻存液，混匀后冻存。

其中，本发明所述的冻存方法中所述冻存液的加入量为至骨骼肌干细胞密度为1×10⁶-3×10⁶cells/mL。

在一些实施方案中，所述冻存液的加入量为至骨骼肌干细胞密度为1.5×10⁶cells/mL。

本发明所述的冻存方法中所述冻存优选为放入程序降温盒内-80℃超低温冰箱保存，2-3天后转移到液氮保存。

程序降温盒是一个隔层中装有异丙醇的塑料盒，冻存的细胞直接放入盒内，然后细胞即可直接放入-80℃超低温冰箱保存。程序降温盒中的异丙醇在-80℃超低温冰箱里是每10分钟下降1℃，可以很好的保护冻存细胞不会因为温度剧变而受到损害。

按照本发明，优选的，程序降温盒需预先恢复室温。而冻存的细胞放入程序降温盒内后优选在10min中内转入-80℃超低温冰箱。

本发明技术人员可以理解，冻存过程中，程序降温盒需提前放入4℃预冷，本发明所述优选冻存液现配完成，同时放入4℃预冷。细胞收集完成后用冻存液重悬，分装到冻存管冻存。

本领域技术人员可知，本发明所述骨骼肌干细胞可以由肌肉组织分离得到。

由上述技术方案可知，本发明提供了一种骨骼肌干细胞的冻存液及冻存方法。本发明所述骨骼肌干细胞的冻存液，由DMSO、右旋糖酐40和人血白蛋白注射液组成，所述DMSO、右旋糖酐40和人血白蛋白注射液的体积比为1:4:5。本发明所述骨骼肌干细胞的冻存方法为向骨骼肌干细胞中加入本发明所述冻存液，混匀后冻存。本发明所述骨骼肌干细胞冻存液不含有动物源血清，避免了引入污染和过敏原的风险，与常规细胞冻存液相比具有更高的临床安全性。同时，本发明所述骨骼肌干细胞冻存液能很好保持骨骼肌干细胞的活性。实验表明采用本发明所述冻存液冻存骨骼肌干细胞，明显提高了骨骼肌干细胞的冻存效果，不管是复苏后的活率还是增殖方面都可以保持较好的状态，并保持良好的干细胞特性。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍。

图1示MDSCs P2代细胞形态图，其中图A为40倍，图B为100倍；

图2示各实施例冻存复苏后细胞活率比较图；

图3示对比例1MDSCs生长曲线；

图4示实施例3MDSCs生长曲线；

图5示MDSCs形态图，其中图A、C、E、G、I、K、M为对比例1组，图B、D、F、H、J、L、N为实施例3组，图A、B为1d、图C、D为2d、图E、F为3d、图G、H为4d、图I、J为5d、图K、L为6d、图M、N7d；

图6示冻存前MDSCs表面marker流式结果图，其中图A为CD73表达情况、图B为HLA-DR表达情况、图C为CD105表达情况、图D为CD34表达情况、图E为CD90表达情况、图F为CD15表达情况；

图7示实施例3冻存后MDSCs复苏培养表面marker流式结果图，其中图A为CD73表达情况、图B为HLA-DR表达情况、图C为CD105表达情况、图D为CD34表达情况、图E为CD90表达情况、图F为CD15表达情况；

图8示对比例1冻存后MDSCs复苏培养表面marker流式结果图，其中图A为CD73表达情况、图B为HLA-DR表达情况、图C为CD105表达情况、图D为CD34表达情况、图E为CD90表达情况、图F为CD15表达情况。

具体实施方式

下面将结合本发明实施例，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

为了更好的理解本发明，下面结合具体实施例对本发明进行详细阐述。如无特殊说明本发明实施例所涉及的试剂均为市售产品，如20％人血白蛋白注射液购自。

实施例1MDSCs原代分离和纯化、传代培养及鉴定

1、取材：取成人正常颞肌标本(取自于开颅手术患者)，用含双抗的PBS缓冲液冲洗后转入无菌培养皿中，用眼科剪剪成1mm³左右大小的碎块，然后移入50mL离心管中，PBS缓冲液吹打冲洗3次，静置1分钟后弃上层液及漂浮组织。

2、酶解：向上述获得的肌肉碎块加入2倍的体积的混合酶，包括2.4μ/mLDispase II、1％I型胶原酶，2.5mmol/L CaCl₂，混匀后置37℃恒温摇床中消化60min左右，直到试管中的肌肉碎块消化为肌糜，肉眼看不到肌块。消化结束后，1000r/min离心5min，弃上清。加入2～3倍体积的0.25％胰蛋白酶-EDTA，混匀后置37℃恒温摇床中消化15min，消化结束后，1000r/min离心5min，弃上清。加入适量PBS重悬，1000r/min离心5min，弃上清。加入约3倍肌糜体积的PBS反复吹打后经200目滤网过滤，收集的滤液1000r/min离心5min，弃上清。生长培养基(含20％FBS的DMEM/F12)重悬细胞。

3、分离与纯化：采用差速贴壁分离技术对MDSCs进行分离。将细胞悬液接种于25ml培养瓶中，放置于37℃、体积分数为5％的CO₂培养箱中培养。2h后的贴壁细胞记为PP1，其中未贴壁细胞吸出后移入新的培养瓶中进行培养，并记为PP2。24h后将PP2中未贴壁的细胞吸出后移入新的培养瓶中培养，标记为PP3。以后每24h进行差速贴壁培养，直到获得PP6，期间根据细胞的生长情况进行换液。PP6培养3天后换液，以后每2-3天换液，倒置显微镜下观察记录细胞生长以及形成集落后每日扩增情况，待细胞生长融合至70-80％后传代培养。

4、MDSCs的传代培养：MDSCs原代培养8-10天，待细胞长满80-90％，用吸管吸弃旧培养液，加入适量0.25％胰蛋白酶-EDTA，消化1-3分钟，镜下观察细胞收缩变圆时，立即加入适量含20％FBS的DMEM/F12培养液终止消化，收集细胞，1000r/min离心5min，弃上清。加入适量含20％FBS的DMEM/F12培养液，进行细胞记数，按8×10⁴cells/mL密度接种于培养皿中进行传代培养，5％CO₂培养箱37℃培养，每隔2-3天换液一次。显微镜观察MDSCs P2代细胞形态，结果见图1。

对比例1

冻存液配制：细胞收集前先配制冻存液，配方为体积比DMSO：FBS＝1:9。4℃冰箱冷藏备用。

细胞收集：选取第3代MDSCs，待细胞长满80-90％，用吸管吸弃旧培养液，加入2-3mL0.25％胰蛋白酶，消化1-3分钟，镜下观察细胞收缩变圆时，立即加入5-10mL含10％FBS的DMEM/F12培养基终止消化，收集细胞，1000r/min离心5min，弃上清。

冻存：用配好的冻存液按1.5×10⁶cells/mL密度冻存细胞。分装到2ml冻存管内，每管1mL，放入程序降温盒内-80℃超低温冰箱保存，2-3天后转移到液氮保存。

实施例2

冻存液配制：细胞收集前先配制冻存液，配方为体积比DMSO:右旋糖酐40:人血白蛋白注射液(20％)＝1:3:6。4℃冰箱冷藏备用。

细胞收集：选取第3代MDSCs，待细胞长满80-90％，用吸管吸弃旧培养液，加入2-3mL0.25％胰蛋白酶，消化1-3分钟，镜下观察细胞收缩变圆时，立即加入5-10mL含10％FBS的DMEM/F12培养基终止消化，收集细胞，1000r/min离心5min，弃上清。

冻存：用配好的冻存液按1.5×10⁶cells/mL密度冻存细胞。分装到2mL冻存管内，每管1mL，放入程序降温盒内-80℃超低温冰箱保存，2-3天后转移到液氮保存。

实施例3

冻存液配制：细胞收集前先配制冻存液，配方为体积比DMSO:右旋糖酐40:人血白蛋白注射液(20％)＝1:4:5。4℃冰箱冷藏备用。

细胞收集：选取第3代MDSCs，待细胞长满80-90％，用吸管吸弃旧培养液，加入2-3mL0.25％胰蛋白酶，消化1-3分钟，镜下观察细胞收缩变圆时，立即加入5-10mL含10％FBS的DMEM/F12培养基终止消化，收集细胞，1000r/min离心5min，弃上清。

冻存：用配好的冻存液按1.5×10⁶cells/mL密度冻存细胞。分装到2mL冻存管内，每管1mL，放入程序降温盒内-80℃超低温冰箱保存，2-3天后转移到液氮保存。

实施例4

冻存液配制：细胞收集前先配制冻存液，配方为体积比DMSO:右旋糖酐40:人血白蛋白注射液(20％)＝1:5:4。4℃冰箱冷藏备用。

细胞收集：选取第3代MDSCs，待细胞长满80-90％，用吸管吸弃旧培养液，加入2-3mL0.25％胰蛋白酶，消化1-3分钟，镜下观察细胞收缩变圆时，立即加入5-10mL含10％FBS的DMEM/F12培养基终止消化，收集细胞，1000r/min离心5min，弃上清。

冻存：用配好的冻存液按1.5×10⁶cells/mL密度冻存细胞。分装到2mL冻存管内，每管1mL，放入程序降温盒内-80℃超低温冰箱保存，2-3天后转移到液氮保存。

实施例5

冻存液配制：细胞收集前先配制冻存液，配方为体积比DMSO:右旋糖酐40:人血白蛋白注射液(20％)＝1:6:3。4℃冰箱冷藏备用。

细胞收集：选取第3代MDSCs，待细胞长满80-90％，用吸管吸弃旧培养液，加入2-3mL0.25％胰蛋白酶，消化1-3分钟，镜下观察细胞收缩变圆时，立即加入5-10mL量含10％FBS的DMEM/F12培养基终止消化，收集细胞，1000r/min离心5min，弃上清。

冻存：用配好的冻存液按1.5×10⁶cells/mL密度冻存细胞。分装到2mL冻存管内，每管1mL，放入程序降温盒内-80℃超低温冰箱保存，2-3天后转移到液氮保存。

实施例6复苏后细胞活率比较

细胞复苏：对比例1与实施例2-5冻存的细胞于液氮冻存一个月后，分别取出三支细胞复苏，冻存管取出立即放入37℃水浴锅中溶解，溶解过程中需不断摇晃冻存管。1-2min液体融化后，用10mL培养基稀释细胞悬液(用培养基把冻存管洗一遍)，混匀后取0.5ml细胞悬液进行细胞计数与活性检测。实验结果见表1及图2。

实验结果显示实施例2、实施例5复苏后细胞活率较低，与对比例1(常规冻存液)有显著差异(p<0.05)，实施例4与对比例1(常规冻存液)无显著差异。但前述各组复苏后细胞活率均较低。而采用本发明所述人MDSCs冻存液冻存MDSCs，即实施例3所述细胞冻存液冻存，复苏后细胞数量更接近冻存前MDSCs的细胞数量，细胞存活率显著高于常规的细胞冻存液冻存MDSCs(p<0.05)，表明本发明所述MDSCs冻存液可以更好的保持MDSCs冻存复苏后的细胞活性，本发明所述MDSCs冻存液冻存效果明显优于常规细胞冻存液。

表2各组细胞复苏后计数结果及细胞活率

注：与对比例1相比*表示p<0.05，**表示p<0.01。

实施例7细胞生长曲线比较

对比例1与实施例3冻存的细胞于液氮冻存一个月后，冻存管取出立即放入37℃水浴锅中溶解，溶解过程中需不断摇晃冻存管。1-2min液体融化后，用10mL含10％FBS的DMEM/F12培养基稀释细胞悬液(用培养基把冻存管洗一遍)，1000r/min离心5min，弃上清。用含10ng/mLEGF的含10％FBS的DMEM/F12培养基重悬后，细胞按1×10⁴cells/mL密度接种于24孔板中，放入5％CO₂培养箱37℃培养，第四天换液一次。每天收集细胞进行细胞计数，每次随机收集计算3个孔，连续7天，绘制细胞生长曲线。结果如表2-3及图3和图4。每天细胞收集前在倒置显微镜下连续观察两组细胞的生长形态并采集图像。结果如图5所示。

结果显示采用实施例3冻存液冻存MDSCs，复苏后培养细胞生长规律正常，其增殖活性略高于对比例1常规的细胞冻存液冻存MDSCs。

表2对比例1冻存的MDSCs复苏培养每天计数结果

表3实施例3冻存的MDSCs复苏培养每天计数结果

实施例8细胞表面marker测定：

对比例1与实施例3冻存的细胞于液氮冻存一个月后，冻存管取出立即放入37℃水浴锅中溶解，溶解过程中需不断摇晃冻存管。1-2min液体融化后，用10mL含10％FBS的DMEM/F12培养基稀释细胞悬液(用培养基把冻存管洗一遍)，1000r/min离心5min，弃上清。用10mL含10ng/mL EGF的含10％FBS的DMEM/F12培养基重悬后，细胞接种于10cm培养皿中，放入5％CO₂培养箱37℃培养。48h后收集细胞，流式细胞仪检测其表面marker如CD73、CD105、CD90、CD34、CD45、HLA-DR等的表达情况。结果如表4、图6-8所示。

表4MDSCs细胞表面marker表达率结果

结果可见，采用本发明实施例3所述MDSCs冻存液冻存细胞，复苏后的MDSCs表达干细胞典型的表面markerCD73、CD105、CD90阳性表达，而CD34、CD45、HLA-DR阴性表达，且与冻存前MDSCs比较无显著性差异。表明本发明所述MDSCs冻存液对MDSCs的冻存不会影响细胞表面标记物的表达。