一种牙髓间充质干细胞的冻存液及其冻存方法与流程

本发明涉及细胞培养技术领域，特别涉及一种牙髓间充质干细胞的冻存液及其冻存方法。

背景技术：

牙周炎是累及四种牙周支持组织(牙龈、牙周膜、牙槽骨和牙骨质)的慢性感染性疾病，往往引发牙周支持组织的炎性破坏。在35岁以后较为多见。常见病因为菌斑、牙石、创伤性咬合、食物嵌塞、不良修复体、口呼吸等。牙周炎具有四大特征，即牙周袋形成、袋壁的炎症、牙槽骨吸收、牙齿逐渐松动。严重的牙周炎会造成牙齿脱落，从而导致咀嚼功能低下而引起消化不良及胃肠病，影响全身心的健康。

治疗牙周炎的主要在于消除炎症，促进被破坏的牙周组织的再生，恢复牙齿的正常功能。临床常采用的牙周炎治疗方法包括：牙周基础治疗(洁治、刮治、根面平整)、牙周翻瓣术及牙周组织再生术。

牙周基础治疗：洁治，也称洁牙，俗称洗牙，其是预防和治疗牙病的一种方法。即用洁治器械清除龈上牙石、菌斑和牙面上附着的色素，并抛光牙面，是防止菌斑和牙石再沉积，防治牙周病的措施。在洁治时还应该将龈沟内与龈上牙石相连的一部分龈下牙石也一并清除掉。根据所用的器械不同，龈上洁治术分为手用器械洁治法和超声波洁牙机洁治法。对于牙龈炎患者，每6～12个月作一次洁治，可有效地维护牙周健康。龈下刮治术，即根面平整术，其是用手工的龈下刮治器械伸入牙周袋内去除附着于牙周袋内根面上和嵌入牙骨质内的龈下牙石和菌斑，并刮除牙根表面受到毒素污染的病变牙骨质，从而形成光滑、清洁的根面，使根面具有生物相容的表面，有利于牙周组织的附着和新生。根面平整术不应用于健康牙周部位，以免导致牙周附着丧失。

牙周翻瓣术：指采用不同的手术切口，将牙龈与下方的组织分离，形成牙龈组织瓣，暴露病变区的根面和牙槽骨，提供清创入路和可视性。刮除病变组织和菌斑牙石后，将牙龈瓣复位在合适的位置上并缝合，达到消除牙周袋或使牙周袋变浅的目的。

牙周组织再生术：在已经缺失的牙槽骨区植入人工骨，并覆盖专用的生物引导膜，使牙周膜上的细胞选择性地在根面上生长，从而达到牙周膜、牙槽骨和牙骨质的再生。通过这种骨植和生物膜的技术，恢复已经破坏的牙槽骨、牙龈及其他的牙周组织，完成牙齿的重新稳定。

以上方法无法修复损伤的牙周附着及牙槽组织，不能满足目前临床上对口腔颌面部组织缺损修复再生及功能、外形恢复的要求，其次牙周炎治疗通过抗生素来控制菌斑生长，进行全身和局部的药物治疗。但抗生素副作用较多，病原微生物也会产生耐药性。

牙髓干细胞(dental pulp stem cells，DPSCs)是存在于牙齿牙髓组织中的一类具有自我更新、增殖能力强，及多向分化能力的间充质干细胞。牙髓干细胞具有多向分化的潜能，它除了能形成矿化结节能力的细胞外，经过不同细胞因子的诱导，还能够分化为脂肪、骨、软骨、肌肉、血管内皮、肝、神经等细胞系类型。据报道，牙髓干细胞在牙周炎治疗中可起到很好的修复作用，作用机制为：通过植入局部并分化为缺损细胞，分泌细胞因子，趋化干细胞到局部，抑制局部炎症，促进局部血管新生。

在牙髓干细胞的临床应用中涉及到牙髓干细胞的冻存、复苏技术，细胞冻存是将37℃生长培养的细胞，添加营养成分及防冻保护剂DMSO，通过逐渐降温的方式将细胞长期超低温冻存于液氮中的过程。当细胞迅速解冻到常温过程，依然可以恢复细胞的活性与保持良好的生物学特征。目前，细胞的冻存通常采用二甲基亚砜(DMSO)对干细胞进行冻存，还会采用普通商品化的培养基或血清进行细胞冻存。但这些冻存液在细胞的冻存过程中还是会无法避免地对牙髓干细胞造成一定的损伤，无法保证干细胞的活力，细胞增值率较低，影响干细胞的临床利用。因此，需要开发一种能够更好地维持牙髓间充质干细胞活力的冻存液及其冻存方法。

技术实现要素：

有鉴于此，本发明提供了一种牙髓间充质干细胞的冻存液及其冻存方法。该冻存液能够更好地维持牙髓间充质干细胞活力。

为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：

本发明提供了一种牙髓间充质干细胞的冻存液，包括DMSO、FBS和牙髓间充质干细胞的条件培养基；

牙髓间充质干细胞的条件培养基的制备方法为：牙髓间充质干细胞采用细胞培养基进行细胞培养，待细胞汇合度达到80％～90％，收集细胞培养基上清液，获得牙髓间充质干细胞的条件培养基。

作为优选，DMSO、FBS与牙髓间充质干细胞的条件培养基的体积比为(1～3)：(3～5)：(4～6)。

优选地，DMSO、FBS与牙髓间充质干细胞的条件培养基的体积比为1：4：5。

在本发明提供的一些实施例中，细胞培养基为含有10％FBS的DMEM/F12培养基。

作为优选，细胞培养的牙髓间充质干细胞接种密度为(5～10)×10³/cm²。

优选地，细胞培养的牙髓间充质干细胞接种密度为7×10³/cm²。

在本发明提供的一些实施例中，细胞培养为在37℃、5％CO₂条件下培养。

作为优选，收集细胞培养基上清液后还包括离心的步骤。

作为优选，离心为1000～2000rpm离心5～10min。

在本发明提供的一些实施例中，离心为1000rpm离心5min。

作为优选，离心后还包括过滤除菌的步骤。

在本发明提供的一些实施例中，用于过滤除菌的滤膜的孔径为0.22μm。

本发明还提供了一种牙髓间充质干细胞的冻存方法，采用本发明提供的冻存液冻存牙髓间充质干细胞。

作为优选，以mL/cell计，冻存液与牙髓间充质干细胞的比例为1：(1～2)×10⁶。

在本发明提供的一些实施例中，以mL/cell计，冻存液与牙髓间充质干细胞的比例为1：1×10⁶。

作为优选，冻存的温度≤-80℃。

本发明提供了一种牙髓间充质干细胞的冻存液及其冻存方法。该冻存液包括DMSO、FBS和牙髓间充质干细胞的条件培养基；牙髓间充质干细胞的条件培养基的制备方法为：牙髓间充质干细胞采用细胞培养基进行细胞培养，待细胞汇合度达到80％～90％，收集细胞培养基上清液，获得牙髓间充质干细胞的条件培养基。本发明的有益效果为：采用本发明冻存液对牙髓间充质干细胞进行冻存，大大减少了冻存液对牙髓间充质干细胞的损伤作用，有利于牙髓间充质干细胞在冻存及复苏过程中细胞活力的提高，能够更好的保持牙髓间充质干细胞的生物学特征。

附图说明

图1示实施例1中复苏后的牙髓间充质干细胞的流式检测结果；其中图1-1示CD73检测结果，图1-2示CD90检测结果，图1-3示CD105检测结果，图1-4示CD34检测结果，图1-5示CD45检测结果，图1-6示HLA-DR检测结果；

图2示实施例1中复苏后的牙髓间充质干细胞的诱导成骨分化鉴定结果；

图3示实施例1中复苏后的牙髓间充质干细胞的诱导成脂分化鉴定结果。

图4示实施例2中复苏后的牙髓间充质干细胞的流式检测结果；其中图1-1示CD73检测结果，图1-2示CD90检测结果，图1-3示CD105检测结果，图1-4示CD34检测结果，图1-5示CD45检测结果，图1-6示HLA-DR检测结果；

图5示实施例3中复苏后的牙髓间充质干细胞的流式检测结果；其中图1-1示CD73检测结果，图1-2示CD90检测结果，图1-3示CD105检测结果，图1-4示CD34检测结果，图1-5示CD45检测结果，图1-6示HLA-DR检测结果；

图6示实施例1骨髓间充质干细胞经不同冻存液冻存后复苏的细胞活力检测图，其中实验组为本发明实施例1骨髓间充质干细胞的冻存液冻存，对照组为标准冻存液冻存。

具体实施方式

本发明公开了一种牙髓间充质干细胞的冻存液及其冻存方法，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。

本发明提供的牙髓间充质干细胞的冻存液及其冻存方法中所用生物材料均可由市场购得。

下面结合实施例，进一步阐述本发明：

实施例1

(一)牙髓间充质干细胞的培养及条件培养基的收集

(1)牙髓间充质干细胞的培养

收集30岁以下人脱落及拔出的健康牙齿，PBS清洗牙齿表面污垢，用钳夹裂牙齿，暴露牙髓组织；用无菌镊子夹取牙髓组织。剪碎，放置50mL离心管中，加入10倍体积的3-5g/L I型胶原酶，封口后充分混合均匀，转移至恒温空气摇床中，37℃、200R消化10-20min左右，加入等体积的完全培养基终止消化，反复吹打离散细胞团块，通过70μm的细胞筛网过滤，以获得单个离散的细胞，1000rpm离心5min。丢弃上清，用30mL PBS清洗沉淀1次，1000rpm离心5min。沉淀用DMEM/F12+10％FBS培养重悬，以0.5～1×10⁴/cm²接种至六孔板中，每孔加入2mL生长培养基，再加入表皮生长因子EGF与碱性成纤维生长因子bFGF(两者终浓度为10ng/mL)，混匀细胞悬液，放于37℃、湿度为95％的二氧化碳培养箱中培养。每3d换液1次，7-14d左右在显微镜下能观察到克隆的形成，当细胞生长至80％-90％汇合时，0.125％胰蛋白酶消化细胞，进行传代培养。离心后用完全培养基重悬沉淀，7×10³/cm²细胞密度接种培养皿中继续培养。取P3-P5代细胞进行条件培养基收集。

(2)条件培养基收集

用于条件培养基的牙髓间充质干细胞，先按照7×10³/cm²细胞密度接种培养皿，DMEM/F12+10％FBS培养基进行培养，待细胞汇合度达到80％-90％，收集细胞培养基上清，将上清分装于50mL离心管中，1000～2000rpm离心5～10min。去除沉淀，收集上清。用一次性注射器吸取条件培养基，用0.22μm滤膜过滤除菌，收集在无菌培养瓶中。

(二)牙髓间充质干细胞的冻存

当牙髓间充质干细胞汇合度达到80％-90％，用PBS清洗2次，加入0.25％胰酶消化细胞2min，细胞变圆后，加入含血清的培养基终止消化，以1000-1500rpm离心5-10min，去上清，加入FBS重悬细胞沉淀，去20-50μl细胞悬液进行细胞计数，每1×10⁶细胞用1mL冻存液进行冻存(1mL细胞冻存液的配方为0.1mL DMSO、0.4mL FBS、0.5mL牙髓间充质干细胞条件培养基)。细胞置于冻存管中，放于含异丙醇的程序降温盒中，放入-80℃过夜后，即可转入液氮中进行长期冻存。

(三)牙髓间充质干细胞的复苏

将冻存的牙髓间充质干细胞从液氮中取出，放置在35-42℃的水浴锅中，震荡温育60秒，细胞解冻后，立即将冻存液加入到5倍体积的条件培养基中，取少量细胞悬液，加入台盼蓝，放置在细胞活力计数仪进行细胞活力检测，其余细胞悬液以1000离心5分钟，去上清，用步骤(一)第(2)部分中获得的条件培养基(以下提到的条件培养基均为该条件培养基)重悬沉淀；轻轻吹打混匀，并按照7×10³/cm²细胞密度接种培养皿中，用条件培养基培养。放置在37℃，5％CO₂培养箱静置24小时后，更换条件培养基继续培养，每日观察细胞扩增情况，细胞进行继续培养48小时，用胰酶消化离心细胞，用条件培养基重悬细胞，取少量细胞悬液，加入台盼蓝，放置在细胞活力计数仪进行细胞活力检测，其余细胞进行细胞传代或其他实验。

(四)流式细胞仪检测复苏后的干细胞表面标志

待复苏后细胞汇合度达到80％-90％，用0.25％胰酶消化离心细胞，并计数后每管加入2×10⁵细胞数，染色缓冲液洗1次，1000rpm离心5min；弃上清，用染色缓冲液吹打混匀细胞；加入CD73、CD90、CD105、CD34、CD45、及HLA-DR抗体各2μL，并设一管为空白对照；在4℃下，避光反应15-20min；染色缓冲液洗一次，1000rpm离心5min；直接标记的细胞弃上清，避光加入500μL的上样缓冲液，混匀，用200目筛网过滤细胞样品，流式细胞仪检测细胞表面抗原。检测结果见图1。

由图1可见，间充质干细胞阴性表面CD34、CD45、HLA-DR均呈现阴性，同时间充质干细胞表面标记物CD73、CD90、CD105均呈现阳性。说明复苏后牙髓间充质干细胞依然保持间充质干细胞的生物学特征。

(五)冻存复苏后细胞诱导成骨分化鉴定

待复苏后细胞汇合度达到80％-90％，用0.25％胰酶消化离心细胞，按照1×10³细胞/cm²接种于六孔板中，加入完全培养基培养24h后，加入成骨诱导培养基进行诱导培养，每隔2天换液，28天后进行茜素红染色，结果见图2。

由图2可知，复苏后的间充质干细胞经过成骨诱导3周后，由茜素红染色可见钙化结节，说明经过条件培养基冻存复苏后的牙髓间充质干细胞仍然保持向成骨分化的潜能。

(六)冻存复苏后间充质干细胞诱导成脂分化鉴定

待复苏后细胞汇合度达到80％-90％，用0.25％胰酶消化离心细胞，收集细胞后，并按照1×10³细胞/cm²接种于六孔板中，加入完全培养基，24h后，加入成脂诱导培养基进行培养。成脂诱导培养基包括基础培养基DMEM、10％胎牛血清、0.5mM IBMX、1μM地塞米松、100μM吲哚美辛、5μg/mL胰岛素、2mm/L谷氨酰胺等。每三天换液。三周后进行油红O染色，鉴定脂滴形成情况，结果见图3。

由图3可知，复苏后的间充质干细胞经过成脂诱导3周后，由油红O染色可见红色油滴，说明经过条件培养基冻存复苏后的牙髓间充质干细胞仍然保持向脂肪分化的潜能。

实施例2

(一)牙髓间充质干细胞的培养及条件培养基的收集

(1)牙髓间充质干细胞的培养

收集30岁以下人脱落及拔出的健康牙齿，PBS清洗牙齿表面污垢，用钳夹裂牙齿，暴露牙髓组织；用无菌镊子夹取牙髓组织。剪碎，放置50mL离心管中，加入10倍体积的3-5g/L I型胶原酶，封口后充分混合均匀，转移至恒温空气摇床中，37℃、200R消化10-20min左右，加入等体积的完全培养基终止消化，反复吹打离散细胞团块，通过70μm的细胞筛网过滤，以获得单个离散的细胞，1000rpm离心5min。丢弃上清，用30mL PBS清洗沉淀1次，1000rpm离心5min。沉淀用DMEM/F12+10％FBS培养重悬，以0.5～1×10⁴/cm²接种至六孔板中，每孔加入2mL生长培养基，再加入表皮生长因子EGF与碱性成纤维生长因子bFGF(两者终浓度为10ng/mL)，混匀细胞悬液，放于37℃、湿度为95％的二氧化碳培养箱中培养。每3d换液1次，7-14d左右在显微镜下能观察到克隆的形成，当细胞生长至80％-90％汇合时，0.125％胰蛋白酶消化细胞，进行传代培养。离心后用完全培养基重悬沉淀，7×10³/cm²细胞密度接种培养皿中继续培养。取P3-P5代细胞进行条件培养基收集。

(2)条件培养基收集

用于条件培养基的牙髓间充质干细胞，先按照7×10³/cm²细胞密度接种培养皿，DMEM/F12+10％FBS培养基进行培养，待细胞汇合度达到80％-90％，收集细胞培养基上清，将上清分装于50mL离心管中，1000～2000rpm离心5～10min。去除沉淀，收集上清。用一次性注射器吸取条件培养基，用0.22μm滤膜过滤除菌，收集在无菌培养瓶中。

(二)牙髓间充质干细胞的冻存

当牙髓间充质干细胞汇合度达到80％-90％，用PBS清洗2次，加入0.25％胰酶消化细胞2min，细胞变圆后，加入含血清的培养基终止消化，以1000-1500rpm离心5-10min，去上清，加入FBS重悬细胞沉淀，去20-50μl细胞悬液进行细胞计数，每1×10⁶细胞用1mL冻存液进行冻存(细胞冻存液的配方为0.2mL DMSO、0.5mL FBS、0.4mL牙髓间充质干细胞条件培养基)。细胞置于冻存管中，放于含异丙醇的程序降温盒中，放入-80℃过夜后，即可转入液氮中进行长期冻存。

(三)牙髓间充质干细胞的复苏

将冻存的牙髓间充质干细胞从液氮中取出，放置在35-42℃的水浴锅中，震荡温育60秒，细胞解冻后，立即将冻存液加入到5倍体积的条件培养基中，取少量细胞悬液，加入台盼蓝，放置在细胞活力计数仪进行细胞活力检测，其余细胞悬液以1000离心5分钟，去上清，用步骤(一)第(2)部分中获得的条件培养基(以下提到的条件培养基均为该条件培养基)重悬沉淀；轻轻吹打混匀，并按照7×10³/cm²细胞密度接种培养皿中，用条件培养基培养。放置在37℃，5％CO₂培养箱静置24小时后，更换条件培养基继续培养，每日观察细胞扩增情况，细胞进行继续培养48小时，用胰酶消化离心细胞，用条件培养基重悬细胞，取少量细胞悬液，加入台盼蓝，放置在细胞活力计数仪进行细胞活力检测，其余细胞进行细胞传代或其他实验。

(四)流式细胞仪检测复苏后的干细胞表面标志

待复苏后细胞汇合度达到80％-90％，用0.25％胰酶消化离心细胞，并计数后每管加入2×10⁵细胞数，染色缓冲液洗1次，1000rpm离心5min；弃上清，用染色缓冲液吹打混匀细胞；加入CD73、CD90、CD105、CD34、CD45及HLA-DR抗体各2μL，并设一管为空白对照；在4℃下，避光反应15-20min；染色缓冲液洗一次，1000rpm离心5min；直接标记的细胞弃上清，避光加入500μL的上样缓冲液，混匀，用200目筛网过滤细胞样品，流式细胞仪检测细胞表面抗原。检测结果见图4。

由图4可见，间充质干细胞阴性表面CD34、CD45、HLA-DR均呈现阴性，同时间充质干细胞表面标记物CD73、CD90、CD105均呈现阳性。说明复苏后牙髓间充质干细胞依然保持间充质干细胞的生物学特征。

(五)冻存复苏后细胞诱导成骨分化鉴定

待复苏后细胞汇合度达到80％-90％，用0.25％胰酶消化离心细胞，按照1×10³细胞/cm²接种于六孔板中，加入完全培养基培养24h后，加入成骨诱导培养基进行诱导培养，每隔2天换液，28天后进行茜素红染色，结果与图2相似。

可见，复苏后的间充质干细胞经过成骨诱导3周后，由茜素红染色可见钙化结节，说明经过条件培养基冻存复苏后的牙髓间充质干细胞仍然保持向成骨分化的潜能。

(六)冻存复苏后间充质干细胞诱导成脂分化鉴定

待复苏后细胞汇合度达到80％-90％，用0.25％胰酶消化离心细胞，收集细胞后，并按照1×10³细胞/cm²接种于六孔板中，加入完全培养基，24h后，加入成脂诱导培养基进行培养。成脂诱导培养基包括基础培养基DMEM、10％胎牛血清、0.5mM IBMX、1μM地塞米松、100μM吲哚美辛、5μg/mL胰岛素、2mm/L谷氨酰胺等。每三天换液。3周后进行油红O染色，鉴定脂滴形成情况，结果与图3相似。

可见，复苏后的间充质干细胞经过成脂诱导3周后，由油红O染色可见红色油滴，说明经过条件培养基冻存复苏后的牙髓间充质干细胞仍然保持向脂肪分化的潜能。

实施例3

(一)牙髓间充质干细胞的培养及条件培养基的收集

(1)牙髓间充质干细胞的培养

收集30岁以下人脱落及拔出的健康牙齿，PBS清洗牙齿表面污垢，用钳夹裂牙齿，暴露牙髓组织；用无菌镊子夹取牙髓组织。剪碎，放置50mL离心管中，加入10倍体积的3-5g/L I型胶原酶，封口后充分混合均匀，转移至恒温空气摇床中，37℃、200R消化10-20min左右，加入等体积的完全培养基终止消化，反复吹打离散细胞团块，通过70μm的细胞筛网过滤，以获得单个离散的细胞，1000rpm离心5min。丢弃上清，用30mL PBS清洗沉淀1次，1000rpm离心5min。沉淀用DMEM/F12+10％FBS培养重悬，以0.5～1×10⁴/cm²接种至六孔板中，每孔加入2mL生长培养基，再加入表皮生长因子EGF与碱性成纤维生长因子bFGF(两者终浓度为10ng/mL)，混匀细胞悬液，放于37℃、湿度为95％的二氧化碳培养箱中培养。每3d换液1次，7-14d左右在显微镜下能观察到克隆的形成，当细胞生长至80％-90％汇合时，0.125％胰蛋白酶消化细胞，进行传代培养。离心后用完全培养基重悬沉淀，7×10³/cm²细胞密度接种培养皿中继续培养。取P3-P5代细胞进行条件培养基收集。

(2)条件培养基收集

用于条件培养基的牙髓间充质干细胞，先按照7×10³/cm²细胞密度接种培养皿，DMEM/F12+10％FBS培养基进行培养，待细胞汇合度达到80％-90％，收集细胞培养基上清，将上清分装于50mL离心管中，1000～2000rpm离心5～10min。去除沉淀，收集上清。用一次性注射器吸取条件培养基，用0.22μm滤膜过滤除菌，收集在无菌培养瓶中。

(二)牙髓间充质干细胞的冻存

当牙髓间充质干细胞汇合度达到80％-90％，用PBS清洗2次，加入0.25％胰酶消化细胞2min，细胞变圆后，加入含血清的培养基终止消化，以1000-1500rpm离心5-10min，去上清，加入FBS重悬细胞沉淀，去20-50μl细胞悬液进行细胞计数，每1×10⁶细胞用1mL冻存液进行冻存(细胞冻存液的配方为0.3mL DMSO、0.3mL FBS、0.3mL牙髓间充质干细胞条件培养基)。细胞置于冻存管中，放于含异丙醇的程序降温盒中，放入-80℃过夜后，即可转入液氮中进行长期冻存。

(三)牙髓间充质干细胞的复苏

将冻存的牙髓间充质干细胞从液氮中取出，放置在35-42℃的水浴锅中，震荡温育60秒，细胞解冻后，立即将冻存液加入到5倍体积的条件培养基中，取少量细胞悬液，加入台盼蓝，放置在细胞活力计数仪进行细胞活力检测，其余细胞悬液以1000离心5分钟，去上清，用步骤(一)第(2)部分中获得的条件培养基(以下提到的条件培养基均为该条件培养基)重悬沉淀；轻轻吹打混匀，并按照7×10³/cm²细胞密度接种培养皿中，用条件培养基培养。放置在37℃，5％CO₂培养箱静置24小时后，更换条件培养基继续培养，每日观察细胞扩增情况，细胞进行继续培养48小时，用胰酶消化离心细胞，用条件培养基重悬细胞，取少量细胞悬液，加入台盼蓝，放置在细胞活力计数仪进行细胞活力检测，其余细胞进行细胞传代或其他实验。

(四)流式细胞仪检测复苏后的干细胞表面标志

待复苏后细胞汇合度达到80％-90％，用0.25％胰酶消化离心细胞，并计数后每管加入2×10⁵细胞数，染色缓冲液洗1次，1000rpm离心5min；弃上清，用染色缓冲液吹打混匀细胞；加入CD73、CD90、CD105、CD34、CD45、及HLA-DR抗体各2μL，并设一管为空白对照；在4℃下，避光反应15-20min；染色缓冲液洗一次，1000rpm离心5min；直接标记的细胞弃上清，避光加入500μL的上样缓冲液，混匀，用200目筛网过滤细胞样品，流式细胞仪检测细胞表面抗原。检测结果见图5。

由图5可见，间充质干细胞阴性表面CD34、CD45、HLA-DR均呈现阴性，同时间充质干细胞表面标记物CD73、CD90、CD105均呈现阳性。说明复苏后牙髓间充质干细胞依然保持间充质干细胞的生物学特征。

(五)冻存复苏后细胞诱导成骨分化鉴定

待复苏后细胞汇合度达到80％-90％，用0.25％胰酶消化离心细胞，按照1×10³细胞/cm²接种于六孔板中，加入完全培养基培养24h后，加入成骨诱导培养基进行诱导培养，每隔2天换液，28天后进行茜素红染色，结果与图2相似。

可见，复苏后的间充质干细胞经过成骨诱导3周后，由茜素红染色可见钙化结节，说明经过条件培养基冻存复苏后的牙髓间充质干细胞仍然保持向成骨分化的潜能。

(六)冻存复苏后间充质干细胞诱导成脂分化鉴定

待复苏后细胞汇合度达到80％-90％，用0.25％胰酶消化离心细胞，收集细胞后，并按照1×10³细胞/cm²接种于六孔板中，加入完全培养基，24h后，加入成脂诱导培养基进行培养。成脂诱导培养基包括基础培养基DMEM、10％胎牛血清、0.5mM IBMX、1μM地塞米松、100μM吲哚美辛、5μg/mL胰岛素、2mm/L谷氨酰胺等。每三天换液。3周后进行油红O染色，鉴定脂滴形成情况，结果与图3相似。

可见，复苏后的间充质干细胞经过成脂诱导3周后，由油红O染色可见红色油滴，说明经过条件培养基冻存复苏后的牙髓间充质干细胞仍然保持向脂肪分化的潜能。

对比例1

对照组(DMSO培养基组)：取汇合度达到80-90％的牙髓间充质干细胞，用PBS清洗2次，加入0.25％胰酶消化细胞2min，细胞变圆后，加入含血清的培养基终止消化，以1000-1500rpm离心5-10min，去上清，加入FBS重悬细胞沉淀，取20-50μL细胞悬液进行细胞计数，每(1-2)×10⁶细胞用1mL标准冻存液进行冻存。细胞置于冻存管加入标准冻存液，放于含异丙醇的程序降温盒中，放入-80℃过夜后，即可转入液氮中进行长期冻存。半年后取出复苏，计算细胞活力。其中标准冻存液为：每1mL标准冻存液含0.1mL DMSO、0.9mL FBS。

实验组(实施例1冻存液组)：试验方法同实施例1操作步骤。

对照组和实验组的细胞活力结果见图6。由图6结果可见，牙髓间充质干细胞经过本发明实施例1牙髓间充质干细胞的冻存液(实验组)冻存后的细胞复苏活力明显高于标准冻存液(对照组)冻存后的细胞活力。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。