本发明属于低温生物学中鱼类胚胎低温保存技术领域，具体涉及一种高浓度渗透和非渗透性玻璃化液及石斑鱼胚胎超低温冷冻保存方法。
背景技术：
胚胎冷冻保存对于长期保存鱼类全基因组遗传信息具有重要的意义，但是自从20世纪70年代Blaxter’s(1975)首次进行鱼类配子冷冻保存实验至今，60多年来鱼类胚胎冷冻保存技术进展缓慢，主要由于鱼卵体积大，具有双层卵膜结构，大的卵间隙，含有大量水分，丰富的卵黄和脂肪滴等特点，在-196℃冷冻保存鱼类胚胎很难成活，迄今，国际上尚未建立鱼类胚胎超低温冷冻保存的有效技术。在美国路易斯安娜州立大学农业中心的Tiersch T和Mazik PM博士(2000)合著的《Cryopreservation in Aquatic Species》这本权威专著中，将鱼类胚胎冷冻保存列为迄今世界上尚未攻克的难题之一。
美国国家动物园和保护研究中心的Hagedorn等(1997,2004)及伦敦大学自然科学与应用研究学院的Zhang T等(2005)以模式动物斑马鱼(Danio rerio)为研究材料，针对鱼类胚胎对水和抗冻剂的渗透性、抗冻剂毒性、不同时期胚胎对冷冻的敏感性、以及胚胎渗透动力学等进行了研究，但至目前在-196℃也未获得冷冻保存成活的完整胚胎。在国内上海理工大学低温生物工程室的Zhang X.S.等(1989)利用慢速降温方法对鲤鱼(Cyprinus carpio)胚胎进行冷冻保存，从液氮中保存20min的16粒胚胎中获得了3粒复活胚胎。长江水产研究所的章龙珍等(2002)对泥鳅胚孔封闭期胚胎利用玻璃化冷冻获得4粒复活胚，发育至肌节期后停止发育，但以上研究都未获得重复成活的胚胎。中国水产科学研究院黄海水产研究所的田永胜等(2005)和Chen等(2005)对牙鲆、鲈鱼、大菱鲆等海水鱼类胚胎超低温冷冻保存技术进行研究，获得了冷冻成活的胚胎，但成活率相当低、很难重复，几种海水鱼类冷冻成活胚胎总计99粒。近年来国内外对鱼类胚胎超低温保存技术进行了大量的研究，但始终未形成可靠的冷冻保存技术方法，特别是对名贵鱼类品种―石斑鱼胚胎冷冻保存，国际上未有其他研究者的相关报导。
技术实现要素：
本发明的目的是解决鱼类胚胎中水分含量高、卵膜厚、抗冻剂难以渗透、在冷冻中易造成冰晶损伤的问题，以及高浓度、高渗透性抗冻剂造成的渗透损伤问题，以及冷冻保存后胚胎中抗冻剂的洗脱问题，提出了一种高浓度渗透和非渗透性玻璃化液，并同时提出了石斑鱼胚胎超低温冷冻保存方法。
为了实现上述目的，本发明采用下述技术方案予以实现：
本发明提供了一种高浓度渗透和非渗透性玻璃化液，均为体积或质量百分数，包括基础稀释液60％、渗透性抗冻剂35％和非渗透性抗冻剂5％；其中所述基础稀释液包括NaCl24.72g/L，CaCl2·2H2O 1.46g/L，KCl 0.865g/L，MgCl2·6H2O 4.86g/L和NaHCO30.19g/L，溶解在蒸馏水中；所述渗透性抗冻剂包括1,2-丙二醇15.75％、甲醇10.5％和甘油8.75％；所述非渗透性抗冻剂是蔗糖或海藻糖。
本发明还提供了一种石斑鱼胚胎超低温冷冻保存方法，步骤为：
1)配制玻璃化液：采用权利要求1或2的配方配制高浓度渗透和非渗透性玻璃化液，将所述玻璃化液采用基础稀释液分别稀释成1/4、1/3、1/2、2/3和1倍的梯度溶液；
2)配制洗脱液：在所述基础稀释液中加入蔗糖，配制成蔗糖洗脱液；
3)筛选冷冻胚胎时期：将胚胎在22-24℃海水培养，利用显微镜观察，等发育至胚体形成期、肌节期、尾芽期进行冷冻保存；
4)胚胎五步渗透平衡：将发育到步骤3)所述时期的胚胎分别在1/4、1/3、1/2、2/3和1倍的玻璃化液梯度溶液中进行五步渗透平衡，在每一梯度液中平衡6min，共30min；
5)胚胎快速冷冻保存：将上述平衡处理后的胚胎连通玻璃化液一起吸入麦管中，热压封口，将麦管直接、快速投入液氮中冷冻保存；
6)胚胎解冻、洗脱和培养：将麦管从液氮中取出，直接浸入水浴中解冻，然后打开麦管封口，利用步骤2)中配制的洗脱液将麦管中的胚胎冲洗到培养皿中进行洗脱；之后添加22-24℃灭菌海水冲洗1次，再加入灭菌海水在恒温下进行培养。
为了缓解胚胎从高浓度的玻璃化进入海水导致渗透压突然降低对胚胎的损害，防止胚胎突然吸水膨胀产生的伤害，所述步骤2)中蔗糖洗脱液的浓度为4.278％。
进一步的，所述步骤5)中液氮的温度为-196℃。
进一步的，所述步骤6)中解冻是在37℃水浴中，解冻时间30-50s。
进一步的，所述步骤6)中洗脱时间为10min。
与现有技术相比，本发明的优点和积极效果是：本发明首先研制了高浓度的渗透性和非渗透性抗冻剂相结合的玻璃化液，一方面提高了玻璃化液胚胎外渗透力和脱出胚胎中水分的能力，防止了胚胎冷冻中过多水份生成冰晶对胚胎细胞的损伤；另一方面降低了单独使用高浓度渗透性抗冻剂对胚胎产生的毒性作用。
渗透性抗冻剂1,2-丙二醇(PG)、甲醇(MeOH)、甘油(Gly)的分子量较小，可以通过卵膜渗透进入胚胎内部，提高细胞溶质浓度，降低细胞质结冰的冰点，达到在低温下保护细胞的目的，但是高浓度的渗透性抗冻剂对细胞具有极强毒性作用，易导致胚胎死亡。为了降低渗透性抗冻剂的毒性，对单一抗冻剂毒性进行了筛选，筛选了毒性较低的抗冻剂1,2-丙二醇。但是单一抗冻剂1,2-丙二醇的渗透力较低，于是将1,2-丙二醇与以上其它小分子渗透性抗冻剂以3：2的比例配制成两种抗冻剂相结合的玻璃化液，筛选出了毒性较低的渗透性较强的玻璃化液40％PM(PG:MeOH＝3:2)。为了进一步降低PM对胚胎的毒性作用，又在PM中以不同的比例(1:1，2:1，3:1，4:1)加入了甘油(Gly)，发现PMG3能够提高胚胎的成活率，说明多种渗透性抗冻剂相结合的玻璃化液能够降低对胚胎的毒性。
非渗透性抗冻剂蔗糖(S)和海藻糖(T)具有较大的分子量，难于通过卵膜渗透进入胚胎，但其具有较强的脱水能力。由于鱼类胚胎中含有大量的水份，为了进一步提高玻璃化对胚胎的脱水能力，防止在冷冻中生成冰晶对胚胎的损伤，因此在以上筛选出的渗透性玻璃化液中加入了5％的非渗透性抗冻剂，筛选出了PMG3T和PMG3S两种多成份的渗透性和非渗透性抗冻剂组成的玻璃化液，既提高了玻璃化液胚胎外渗透力和脱出胚胎中水分的能力，防止了胚胎中过多水份在冷冻时生成冰晶对胚胎细胞的损伤，又降低了单独使用高浓度渗透性抗冻剂对胚胎产生的毒性作用；从而达到了对胚胎在超低温冷冻下的保护作用，实现了石斑鱼胚胎超低温冷冻保存的成活。
在得到上述新型的玻璃化液的基础上，本发明采用胚胎五步渗透平衡方法，胚胎由低浓度玻璃化液逐次进入高浓度玻璃化液，既提高了胚胎对玻璃化液的适应能力，又能够逐次有效的脱去胚胎中过多的水份，同时降低了高浓度玻璃化液对胚胎的损伤，提高了胚胎在玻璃化液中处理的成活率。在解冻后利用4.278％的蔗糖液洗脱胚胎可以有效的缓解胚胎从高浓度的玻璃化进入海水导致渗透压突然降低对胚胎的损害，防止了胚胎突然吸水膨胀产生的伤害；通过以上技术方法的使用从而达到在超低温下冷冻保存胚胎的目的。利用本发明冷冻保存七带石斑鱼和云纹石斑鱼各期胚胎，重复获得了248粒成活的胚胎，复活率可达9.93％，并且孵化出鱼苗206尾，胚胎孵化率达83.06％。
具体实施方式
下面结合具体实施方式对本发明的技术方案作进一步详细的说明。本发明所提到的比例、“份”，如果没有特别的标记，均以体积百分数为准。
本实施例为了解决鱼类胚胎超低温冷冻保存中冰晶损伤和渗透损伤的问题，首先提出了一种高浓度渗透和非渗透性玻璃化液的配方，在此基础上提出了石斑鱼胚胎冷冻保存方法，包括：玻璃化液的配制，洗脱液配制，冷冻胚胎时期的筛选，胚胎五步渗透平衡，胚胎快速冷冻保存，胚胎解冻、洗脱和培养。如下以七带石斑鱼和云纹石斑鱼胚胎冷冻保存为例进行描述：
1、渗透性和非渗透性玻璃化液的配制和筛选
(1)不同组合玻璃化液的配制：
首先配制基础稀释液(DS)：包括NaCl 24.72g/L，CaCl2·2H2O 1.46g/L，KCl 0.865g/L，MgCl2·6H2O 4.86g/L和NaHCO30.19g/L；
选择渗透性抗冻剂：1,2-丙二醇(PG)、甲醇(MeOH)、甘油(Gly)、二甲基甲酰胺(DMF)、二甲基亚砜(DMSO)、乙二醇(EG)中的一种或几种混合物；
选择非渗透性抗冻剂：葡萄糖(G)、蔗糖(S)、果糖(F)或海藻糖(T)在基础稀释液中配制不同组合的玻璃化液，如表1所示，均为体积或质量百分数。
表1不同组合的玻璃化液配方
(2)单一抗冻剂的筛选：
分别用40％PG、MeOH、Gly、DMF、DMSO和EG 6种抗冻剂(如表1中序号1-6)对七带石斑鱼肌节期胚胎进行五步平衡处理，具体方法是：将胚胎分别在1/4、1/3、1/2、2/3和1倍的PG(MeOH、Gly、DMF、DMSO和EG)梯度液中分别平衡6min，共计30min，直接利用4.278％蔗糖洗脱后，加入22℃海水冲洗，再加入海水培养，待孵化后统计各组孵化率。结果表明，利用40％PG处理胚胎的孵化率最高，MeOH次之，EG最低，但各组与对照组相比孵化率显著降低(P<0.05)，对照组为未经抗冻剂或玻璃化液处理的胚胎孵化率(下同)，如表2所示。
表2单一抗冻剂处理七带石斑鱼肌节期胚胎的孵化率
(3)两种渗透性抗冻剂组合及筛选：
利用MeOH、Gly、DMF、DMSO和EG 5种抗冻剂分别与PG组合配制成的五种混合抗冻剂PM、PGly、PDF、PDO和PE(如表1中序号7-11)，对七带石斑鱼肌节期胚胎进行五步平衡处理，具体步骤是：将胚胎分别在1/4、1/3、1/2、2/3和1倍的PM(PGly、PDF、PDO和PE)梯度液中分别平衡6min，共计30min。然后利用4.278％蔗糖洗脱后，加入22℃海水冲洗，再加入海水培养，统计孵化率。结果表明，利用PM处理胚胎的孵化率最高，PE最低。但各组与对照组相比，孵化率显著降低(P<0.05)，如表3所示。
表3两种渗透性抗冻剂处理胚胎的孵化率
(4)三种渗透性抗冻剂组合及筛选
利用两种组合抗冻剂PM(PG:MeOH＝3:2)与甘油(Gly)以1:1，2:1，3:1，4:1比例配制成四种混合抗冻剂PMG1、PMG2、PMG3和PMG4(如表1中序号12-15)，采用五步法平衡处理七带石斑鱼肌节期胚胎。具体步骤是：将胚胎分别在1/4、1/3、1/2、2/3和1倍的PMG1(PMG2、PMG3和PMG4)梯度液中分别平衡6min,共计30min。然后利用4.278％蔗糖洗脱后，加入22℃海水冲洗，再加入海水培养并统计孵化率。结果显示，PMG3处理后孵化率为最高，PMG1最低(P<0.05)，处理后胚胎孵化率与对照组比较显著(P<0.05)或极显著降低(P<0.01)，如表4所示，但PMG3处理后胚胎的孵化率显著高于两种抗冻剂(PM)和单一抗冻剂处理胚胎的孵化率。
表4三种渗透性抗冻剂处理胚胎孵化率
(5)渗透性与非渗透性抗冻剂组合及筛选
利用35％PMG3与5％非渗透性抗冻剂葡萄糖(G)、蔗糖(S)、果糖(F)和海藻糖(T)混合配制四种玻璃化液PMG3G、PMG3S、PMG3F、PMG3T(如表1中序号16-19)，采用五步法渗透平衡处理七带石斑鱼肌节期胚胎。具体步骤是：将胚胎分别在1/4、1/3、1/2、2/3和1倍的PMG3G(PMG3S、PMG3F、PMG3T)梯度液中分别平衡6min,共计30min。然后利用4.278％蔗糖洗脱后，加入22℃海水冲洗，再加入海水培养统计胚胎孵化率，结果显示PMG3S和PMG3T中孵化率较高(表5)，因此选择利用这两种玻璃化液进行胚胎的冷冻保存。
表5渗透性和非渗透性抗冻剂配制玻璃化液处理胚胎孵化率
2、胚胎冷冻时期的筛选
分别利用PMG3S和PMG3T两种玻璃化液五步法处理七带石斑鱼胚体形成期、肌节期和尾芽期胚胎；具体步骤是：将胚胎分别在1/4、1/3、1/2、2/3和1倍的PMG3S和PMG3T梯度液中分别平衡6min，共计30min。然后利用4.278％蔗糖洗脱后，加入22℃海水冲洗，再加入海水培养后的孵化率，结果显示尾芽期胚胎成活较高，胚体形成期和肌节期较低，但与对照组相比处理后孵化率显著降低(P<0.05)，因此主要选择尾芽期胚胎进行冷冻保存(表6)。
表6玻璃化液处理不同时期胚胎的成活率
3、胚胎五步渗透平衡
选择七带石斑鱼肌节期、尾芽期和胚体形成期胚胎分别在PMG3T和PMG3S两种玻璃化液中利用五步法平衡处理，具体步骤是：胚胎依次浸入1/4、1/3、1/2、2/3和1倍的PMG3T(或PMG3S)梯度玻璃化液中渗透平衡，每一梯度液中平衡6min，共计30min。
选择云纹石斑鱼20对肌节期和尾芽期胚胎，在PMG3T梯度玻璃化液中五步渗透平衡处理30min，处理方法同上。
4、胚胎快速冷冻保存
当以上七带石斑鱼和云纹石斑鱼胚胎平衡到第五步，即胚胎浸入1倍的PMG3T(或PMG3S)中后，利用移液枪将胚胎和玻璃化液一起吸入250μl塑料麦管中，每管中吸入胚胎数量15-20粒左右，利用热压封口，等胚胎整体平衡时间达到30min时，将麦管直接投入到液氮中(-196℃)冷冻保存，事先将液氮盛入1L的保温盒中备用，麦管在液氮中冷冻保存3小时以上。
5、胚胎解冻、洗脱和培养
将冷冻胚胎的麦管从液氮中取出，迅速插入37℃水浴中解冻，解冻时间30-50秒左右，在麦管即将变透明时从水浴中取出，剪去封口，将胚胎注入到培养皿中，培养皿中事先加入4.278％的蔗糖洗脱液2mL，胚胎在蔗糖液中洗脱10min后，加入22-24℃灭菌海水(七带石鱼胚胎在22℃培养，云纹石斑鱼胚胎在24℃培养)，将培养皿放置在相应的恒温箱中培养。培养4-5小时后统计胚胎的成活率，待胚胎孵化后再统计孵化率。
利用以上方法冷冻保存七带石斑鱼胚体形成期、肌节期和尾芽期胚胎共472粒，解冻后有82粒胚胎上浮，其中继续发育的胚胎14粒，分别发育到肌节期、孵化前期和出苗期，成活时间7-13小时(表7)。
利用PMG3T冷冻保存云纹石斑鱼20对肌节期和尾芽期胚胎2445粒，解冻后成活胚胎达到234粒，解冻后27小时，孵化出鱼苗193尾，48小时后成活鱼苗180尾(表8)。
表7七带石斑鱼胚胎冷冻保存结果
表8云纹石斑鱼胚胎冷冻保存结果
通过本实施例研制出石斑鱼胚胎冷冻保存的玻璃化液PMG2T和PMG3S，冷冻保存七带石斑鱼胚体形成期、肌节期和尾芽期胚胎，获得了14粒成活胚胎，孵化出2尾鱼苗，冷冻保存云纹石斑鱼肌节期和尾芽期胚胎2400粒，获得234粒成活胚胎，孵化出193尾鱼苗。通过此方法的使用说明可重复实现石斑鱼胚胎超低温冷冻保存成活。
以上实施例仅是本发明若干种优选实施方式中的几种，应当指出，本发明不限于上述实施例；对于本领域的普通技术人员来说，依然可以对前述实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换；而这些修改或替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明所要求保护的技术方案的精神和范围。