一种高浓度玻璃化液及石斑鱼胚胎超低温冷冻保存方法与流程

文档序号:12199885阅读:来源:国知局

技术特征:

1.一种高浓度渗透和非渗透性玻璃化液,其特征在于,均为体积或质量百分数,

包括基础稀释液60%、渗透性抗冻剂35%和非渗透性抗冻剂5%;

其中所述基础稀释液包括NaCl2 4.72 g/L,CaCl2·2H2O 1.46 g/L,KCl 0.865 g/L, MgCl2·6H2O 4.86 g/L 和 NaHCO3 0.19 g/L,溶解在蒸馏水中;

所述渗透性抗冻剂包括1,2-丙二醇 15.75%、 甲醇 10.5%和甘油 8.75%;

所述非渗透性抗冻剂是蔗糖或海藻糖。

2.一种石斑鱼胚胎超低温冷冻保存方法,其技术特征,步骤为:

1)配制玻璃化液:采用权利要求1的配方配制高浓度渗透和非渗透性玻璃化液,将所述玻璃化液采用基础稀释液分别稀释成1/4、1/3、1/2、2/3和1倍的梯度溶液;

2)配制洗脱液:在所述基础稀释液中加入蔗糖,配制成蔗糖洗脱液;

3)筛选冷冻胚胎时期:将胚胎在22-24℃海水培养,利用显微镜观察,等发育至胚体形成期、肌节期、尾芽期进行冷冻保存;

4)胚胎五步渗透平衡:将发育到步骤3)所述时期的胚胎分别在1/4、1/3、1/2、2/3和1倍的玻璃化液梯度溶液中进行五步渗透平衡,在每一梯度液中平衡6min,共30min;

5)胚胎快速冷冻保存:将上述平衡处理后的胚胎连通玻璃化液一起吸入麦管中,热压封口,将麦管直接、快速投入液氮中冷冻保存;

6)胚胎解冻、洗脱和培养:将麦管从液氮中取出,直接浸入水浴中解冻,然后打开麦管封口,利用步骤2)中配制的洗脱液将麦管中的胚胎冲洗到培养皿中进行洗脱;之后添加22-24℃灭菌海水冲洗1次,再加入灭菌海水在恒温下进行培养。

3.根据权利要求2所述的石斑鱼胚胎超低温冷冻保存方法,其技术特征,所述步骤2)中蔗糖洗脱液的质量百分浓度为4.278%。

4.根据权利要求2所述的石斑鱼胚胎超低温冷冻保存方法,其技术特征,所述步骤5)中液氮的温度为-196℃。

5.根据权利要求2所述的石斑鱼胚胎超低温冷冻保存方法,其技术特征,所述步骤6)中解冻是在37℃水浴中,解冻时间30-50s。

6.根据权利要求2所述的石斑鱼胚胎超低温冷冻保存方法,其技术特征,所述步骤6)中洗脱时间为10 min。

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