用于器官保藏的组合物的制作方法
本发明涉及保存器官或组织活性的领域，所述器官或组织待移植到需要这种移植的接受者中。特别地，本发明涉及sigma1受体激动剂化合物在保藏溶液中的用途以及包含sigma1受体激动剂化合物的保藏溶液。
背景技术：
器官移植是引起最终状态器官衰竭的几种慢性疾病的仅有的或主要的治疗，例如，终末期肾脏疾病(endstagerenaldisease,esrd)。在这些情况下器官移植与改善的生存率和生存质量相关。
器官从体循环分离、保存和移植引起器官的稳态和新陈代谢的深刻改变。改变的稳态和新陈代谢引起损伤，该损伤可能导致器官的恶化、其之后与接受者的不相容性，或-在为肾脏的情况下-移植物功能延迟恢复。
器官在移植(tx)之前通常被保存，并且在保存和运输期间必须保持活性。器官一旦从循环系统中分离，则缺血性损伤是不可避免的。炎症过程立即发生并导致结构损伤和代谢损伤，最终导致细胞死亡。在分离之后短至数小时之内发生的细胞能量贮备的耗尽导致离子泵功能缺陷、水肿、细胞的肿胀。
由于在细胞内环境和细胞外环境之间缺乏平衡的损伤或多或少通过使用保藏溶液来解决。保藏溶液在组成方面不同，然而，所有目的在于防止细胞水肿、延迟细胞破坏和最大化重构之后的器官功能。保藏溶液的组成比对可以在guibertetalorganpreservation:currentconceptsandnewstrategiesforthenextdecadetransfusmedhemother2011；38:125-142中找到。
威斯康星大学溶液(theuniversityofwisconsinsolution，uw)和组氨酸-色氨酸-酮戊二酸(histidine-tryptophane-ketoglutaratesolution,htk或康斯特(custodiol)溶液)是在胰腺、心脏、肾脏和肺的具有可比效果的保藏中最广泛使用的保藏溶液。二者都已被证明在肝脏和肾脏保藏中是可比较的，在心脏外科手术中也是有效的。htk保藏与伴有超过8小时冷局部缺血的移植物损失的增加的风险相关联(stewartza,cameronam,singeral,montgomeryra,segevdl:histidine-tryptophan-ketoglutarate(htk)isassociatedwithreducedgraftsurvivalindeceaseddonorlivers,especiallythosedonatedaftercardiacdeath.amjtransplant2009；9:286-293.)。
为了延长器官的活性，氧气和能量需求要保持在最小。低温保存是当前保持活性的主要手段。然而由于例如氧化应激和炎症，冷却本身对组织具有不利影响。冷缺血(或冷保存)时间是移植物功能延迟恢复和主要器官功能障碍的独立风险因素(erkasaps,atese.l-arginine-enrichedpreservationsolutiondecreasesischaemia/reperfusioninjuryincaninekidneysafterlongtermcoldstorage.nephrologydialysistransplant2000；15:1224-7)。castaneda等人已经证明与活体相关移植相比，人类尸体肾脏移植显著具有更多的凋亡细胞。凋亡的程度与冷缺血的持续时间显著相关(castanedamp,swiatecka-urbana,mitsnefesmmetal.activationofmitochondrialapoptoticpathwaysinhumanrenalallograftsafterischemiareperfusioninjury.transplantation2003；76:50-54)。jani等人在猪模型中证明，在dcd肾脏中，热局部缺血优先地活化半胱天冬酶(caspase)-1，而冷局部缺血活化半胱天冬酶-3(jania,zimmermanm,martinj,lul,turkmenk,ravichandrank,pacica,ljubanovicd,edelsteincl.perfusionstoragereducesapoptosisinaporcinekidneymodelofdonationaftercardiacdeath.transplantation.2011；91:169-175)。几位作者已经展示了来自扩展指标供体和无心跳供体的器官特别容易受到低温保藏期间的损伤的影响，并且可能受益于保藏的替代方法(stubenitskyetal.kidneypreservationinthenextmilleniumtransplint(1999)12:83-91)。一些人建议改用常温保藏，以不仅防止额外的冷保存损伤，还维持细胞修复机制。提出了热激蛋白(heatshockproteins)在防止缺血结果方面起到关键(moersetal.non-heartbeatingorgandonation:overviewandfutureperspectivestransplantinternationaldoi:10.1111/j.1432-2277.2007.00455.x)
esrd的主要肾脏替换治疗选择是肾移植(ktx)；这与改善的存活率和生存质量有关联。在包括近200万肾功能衰竭的参与者的最近的110项研究回顾中，与长期透析相比，ktx与降低死亡和心血管事件的风险以及更好的生存质量相关。
虽然肾脏移植的数量在过去十年没有变化，但是利用运行的肾脏移植生活的患者的总数持续增长(usrenaldatasystemannualreport2015)。对于活体供体，一年移植存活率是97％，而对于死亡供体移植物接受者，一年移植物存活率是92％。
活体供体移植具有优越的结果，因为这些供体通常是更年轻和更健康的。冷缺血时间可能显著地降低，也是因为这些txs可以预先规划。通过执行预先占有tx，当接受者处于最佳的医学条件和社会条件下时进行移植，能够进一步改善移植物存活率。在活体供体tx的明显优势之外，还应始终考虑健康人可能造成的伤害。
在美国大约三分之一的肾脏移植物来自活体供体，而这一数量在匈牙利仅约12％。匈牙利于2012年加入欧洲移植基金会(eurotransplantfoundation)。这是一个8个国家的网络，旨在调整和改进用于tx的供体器官的安置和分配。
在过去数十年，虽然由于外科手术技术和免疫抑制的进展，ktx的短期效果已经实质地改善了，但长期效果很大程度上保持不变。影响长期效果的因素可能是同种抗原依赖性(alloantigen-dependent)(例如，hla匹配、hla免疫，等)或同种抗原独立性(例如，供体类型以及供体和接受者两者的年龄)、疾病复发、并发症或透析时间。在同种抗原独立因素之中，缺血/再灌注损伤(ischemia/reperfusioninjury,iri)是主要的并发症，其对ktx之后的长期存活率具有特定的影响。iri是不可避免的，保存时间和冷缺血时间与移植物功能延迟恢复相关。
治疗：虽然有效的免疫抑制疗法是成功的tx的关键，免疫抑制剂还对肾脏具有几种不良作用。它们可能激起或再激活感染(例如，引起间质性肾炎的炎症多瘤bk病毒、巨细胞病毒和疱疹病毒，或尿路感染，等)。钙调磷酸酶-抑制物(他克莫司(tacrolimus)和环孢菌素a)通过引起持续性血管收缩、间质纤维化和肾小管萎缩而有肾毒性，最终可导致慢性移植物功能障碍。主要由于类固醇他克莫司和雷帕霉素靶蛋白(mtor)抑制物，四分之一的ktx患者发生“新生的(denovo)”移植后糖尿病(post-transplantdm)，其可能导致dnp和移植物功能障碍。由于所有这些原因，在移植后肾病护理期间，对免疫抑制方案的持续和严格控制具有特殊意义。
安全保存可移植器官活性的时间取决于器官、保存方法和使用的溶液以及器官的状况。无论是热的还是冷的，延长保藏时间都至关重要。
klouz等人已经发现，bhdp(n-苄基-n'-(2-羟基-3,4-二甲氧基苄基)-哌嗪)，一种sigma1配体，当给大鼠施药或当在隔离肝脏的保藏液中使用时保护了线粒体功能(kloutzetal.protectionofcellularandmitochondrialfunctionsagainstliverischemiabyn-benzyl-n'-(2-hydroxy-3,4-dimethoxybenzyl)-piperazine(bhdp),asigmalligand.eurjpharmacol578(2008)292-299.)。没有研究bhdp是作用激动剂还是拮抗剂。作者提出bhdp保护肝细胞并且特别是线粒体，假设这可能与bhdp对线粒体sigma1受体的作用相关，然而作者承认需要进一步的研究来验证或排除这种假设。该作者没有提出bhdp应当用于器官保藏溶液，而是详尽的研究规划来验证或排除他们的假说。此外，klouz等人没有进行移植。
令人惊讶地发现，当在可移植器官的保藏溶液中体外使用时，s1r激动剂化合物延长器官的保存时间并使得所述器官免受功能损伤和细胞损伤，正如通过所述器官的自体移植后改善的功能和细胞完整性所表明的。
技术实现要素：
本发明通过以下的段落和权利要求限定。
sigma1受体(s1r)激动剂化合物的体外用途，所述sigma1受体(s1r)激动剂化合物用于在保藏溶液中保存的可移植的整体或部分器官、或者组织的保存期间降低、延迟或防止细胞损伤，其中，所述s1r激动剂化合物被包含在所述保藏溶液中。
在优选的实施方式中，与检测的、测量的、预计的或预测的在相同条件下和在不包含所述s1r激动剂化合物的相同保藏溶液中保存的所述整体或部分器官、或者所述组织的结构损伤和/或功能损伤相比，所述整体或部分器官、或者组织的结构损伤和/或功能损伤被改善，其中，所述整体或部分器官、或者组织的结构损伤和/或功能损伤与由体外保存引起的细胞损伤相关联。在优选的实施方式中，所述整体或部分器官、或者组织的所述结构损伤和/或功能损伤被改善至少15％、至少25％、至少50％。通过结构损伤和/或功能损伤的标志物特性的改变来测量改善，优选以定量的方式。
在优选的实施方式中，所述细胞损伤与改变的器官特异性生物标记物水平相关，或与选自功能缺陷和结构损伤的所述整体或部分器官、或者组织的状况相关联。
在优选的实施方式中，所述细胞损伤由体外保存引起，且与选自以下改变的一种或多种标记物水平相关联：伴侣蛋白、血管活性剂、凋亡途径标记物、坏死途径标记物、炎症标记物、免疫系统活化标记物、内质网应激标记物、氧化应激标记物、血管生成标记物、重塑标记物、再生标记物。
由保存引起的细胞损伤促进移植物排斥、移植物功能延迟恢复、移植物损失、降低的移植物功能和降低的移植后存活率。
保存温度可以是近似器官或组织所属的物种温度特性的温度，即，正常体温保存。保存温度可以是低于或至少5℃、低于或至少10℃、低于器官或组织所属物种体心温度特性，优选是从0℃到10℃、更优选从0℃到4℃、高度优选4℃。在优选的实施方式中，所述整体或部分器官或组织保存在0到10℃的温度下。
与在相同条件下和在不包含所述s1r激动剂化合物的相同保藏溶液中保存的整体或部分器官、或者组织的预测的或普遍接受的或统计学评估的最大保存时间分别相比，所述整体或部分器官、或者组织的最大保藏时间优选提高了。最大保藏时间可以提高，特别是提高至少15％、至少25％、优选至少50％，高度优选至少100％。
所述保存时间可以是，特别地，至少1小时、或至少3小时或至少6小时，或者优选所述保存时间可以是几天(例如，3天或2天)。
所述器官或组织可以是任何可移植的器官或组织，包括人造的组织或器官以及通过基于方法的细胞培养生产的组织或器官。器官可以选自心脏，肺，和包括肝脏、胰腺、肠、肾脏的腹部器官；皮肤、眼睛、骨髓。所述组织可以是皮肤组织、血管组织、胰岛(isletsoflangerhans)、肾脏组织、肺组织、心脏组织、角膜等。器官可以是部分器官，例如肝叶、肺叶。优选地，所述器官是腹部器官。高度优选地，所述器官是肾脏或肝脏。
1.在一实施方式中，所述化合物是s1r激动剂化合物，其中，所述化合物是相对于s2r(sigma2受体)对s1r的选择性激动剂，即，所述化合物是选择性s1r激动剂。如果化合物具有与对s2r相比对s1r的更高亲和性、优选更高至少5倍、或至少更高20倍、或至少更高50倍、或优选地、至少更高102倍、或至少更高103倍、或至少更高104倍的亲和性，则化合物是相对于s2r对s1r是选择性的。
2.在一实施方式中，化合物是s1r激动剂，其作用可以与例如ne-100的特定s1r拮抗剂选择性拮抗。
3.在本发明一实施方式中，s1r激动剂化合物是如本文的限定的或如上文限定的用途的s1r激动剂化合物，所述s1r激动剂化合物具有以下的式i'：
其中
q1是h、卤素、拟卤素(pseudo-halogen)、可选地用1个、2个、3个或4个卤素取代的c(1-4)烷基、c(1-3)烷氧基、c(6-10)芳基，可选地用1个、2个、3个或4个卤素取代，
q2是h、卤素、拟卤素或c(1-3)烷氧基，
x是o、ch2、亚乙基或羰基(co)、酰胺或不存在，
或x具有式
其中r6选自由羟基，取代的或未取代的c(1-6)烷基、优选c(1-3)烷基、和c(1-6)烷氧基、优选c(1-3)烷氧基，c(1-2)烷氧基c(1-6)烷基或c(1-6)烷氧基烷基、优选c(1-4)烷氧基烷基，c(5-10)芳基、优选c(5-6)芳基组成的组，
或x具有式
r6和r6'是独立取代的或未取代的c(1-6)烷基、优选c(1-3)烷基，c(1-6)烷氧基、优选c(1-3)烷氧基，c(1-6)烷氧基烷基、优选c(1-4)烷氧基烷基，c(1-6)烷氧基糖基、优选c(1-4)烷氧基糖基，或者r6与r6'的至少一个，优选r6'是c(5-10)芳基、优选c(5-6)芳基，
或者r6和r6'一起形成c(4-7)环烷基，优选环戊基或环己基
或x具有式
其中r6选自取代的或未取代的c(1-6)烷基、优选c(1-3)烷基，c(1-6)烷氧基、优选c(1-3)烷氧基，c(1-6)烷氧基c(1-6)烷基或c(1-2)烷氧基c(1-6)烷氧基或c(1-6)烷氧基烷基，或c(5-10)芳基、优选c(5-6)芳基，
y是ch、n，或o、-o-ch2-ch2-o-，或不存在
其中
如果y是o，则r4不存在，
如果y是n，则r4是h、或c(1-3)烷基或c(1-3)烯基、优选乙基或丙烯基，或者r4和r1与y、n以及它们之间的碳原子一起形成c(5-7)杂环，
如果y是ch，则r4选自h、取代的或未取代的c(1-4)烷基、c(1-4)烷氧基和c(5-10)芳基，或者r4和r1与y、n和它们之间的碳原子一起形成c(5-7)杂环，
r3选自h，取代的或未取代的c(1-6)烷基、优选c(1-4)烷基，c(1-6)烷氧基、优选c(1-4)烷氧基，c(1-2)烷氧基c(1-6)烷基或c(1-6)烷氧基烷基，c(5-10)芳基，或者
r3和r6与它们附接的-x-y-c2烷基部分一起可以形成饱和的或部分不饱和的6到8元环烷基、或包含0到3个杂原子的6到8元杂环烷基，或者
r3和r6与它们附接的-x-y-c2烷基部分一起可以形成取代的或未取代的c(7-14)多环芳基、或c(7-14)多环杂芳基、或c(7-14)环烷基芳基，或者
r3和r4与它们附接的-x-y-c2烷基部分一起可以形成饱和的或部分不饱和的6到8元环烷基、或包含0到3个杂原子的6到8元杂环烷基、或烷基芳基，优选包含取代的或未取代的苯基，
r5是c(1-3)烷基或c(1-3)烷氧基或者
r5和r6与它们附接的碳原子一起形成3、4、5或6元饱和的或不饱和的、优选饱和的环，所述环可选地包含杂原子、优选o，其中所述环优选是呋喃基、二氢呋喃基或四氢呋喃基，其中优选y不存在，
r1和r2独立地是h或c(1-6)烷基，优选甲基或乙基，
或者r1和r2形成5或6元饱和的或不饱和的，优选饱和的环，
所述环可选地包含杂原子，优选o、优选是噁嗪或吗啉，或作为选择地为n、优选是二嗪或哌嗪环，或者
所述环可选地是取代的或未取代的哌啶环、优选是用oh和甲氧基的一个或两个取代的哌啶环，和苯基、优选在对位用卤素取代的苯基，所述取代基优选处在所述哌啶环的对位，
或者r1是c(2-4)亚烷基、优选c(2-3)亚烷基或c(3-4)亚烷基，且与y和n以及y和n之间的碳原子一起形成杂环、优选哌嗪，并且r2是c(1-6)烷基、优选c(1-4)烷基，c(5-10)芳基、优选c(5-6)芳基或c(7-10)芳烷基，
或者r2是c(2-4)亚烷基、优选(c2-3)亚烷基或c(3-4)亚烷基，并且与n一起形成杂环，优选四氢-四唑，
或其药学可接受盐。
4.在本发明的实施方式中，s1r激动剂化合物是如本文的定义的或如上文限定的s1r激动剂化合物，所述s1r激动剂化合物具有以下的式i'：
其中
q1是h、卤素、拟卤素、可选地用1个、2个、3个或4个卤素取代的c(1-4)烷基、c(1-3)烷氧基、c(6-10)芳基，可选地用1个、2个、3个或4个卤素取代，
q2是h、卤素、拟卤素或c(1-3)烷氧基，
x是o、ch2、亚乙基或羰基(co)、酰胺，或者不存在，
或x具有式
w是-ch-或羰基(-co-)，和
r6和r6'是独立取代的或未取代的c(1-6)烷基、优选c(1-3)烷基，c(1-6)烷氧基、优选c(1-3)烷氧基，c(1-6)烷氧基c(1-6)烷基、优选c(1-2)烷氧基c(1-6)烷基，c(1-6)烷氧基羰基、优选c(1-4)烷氧基羰基，或者r6和r6'的至少一个，优选r6'是c(5-10)芳基、优选c(5-6)芳基，
或者r6和r6'一起形成c(4-7)环烷基、优选环戊基或环己基，
或x具有式
其中r6选自取代的或未取代的c(1-6)烷基、优选c(1-3)烷基，c(1-6)烷氧基、优选c(1-3)烷氧基，c(1-6)烷氧基c(1-6)烷基或c(1-2)烷氧基c(1-6)烷基或c(1-6)烷氧基烷基，c(1-6)烷氧基羰基、优选c(1-4)烷氧基羰基，或c(5-10)芳基、优选c(5-6)芳基，
y是ch、n，或o、-o-ch2-ch2-o-，或者不存在
其中
如果y是o，则r4不存在，
如果y是n，则r4是h，或c(1-3)烷基或c(1-3)烯基，优选乙基或丙烯基，
如果y是ch，则r4选自h、取代的或未取代的c(1-4)烷基、c(1-4)烷氧基和c(5-10)芳基，
r3选自h、取代的或未取代的c(1-6)烷基、优选c(1-4)烷基，c(1-6)烷氧基、优选c(1-4)烷氧基，c(1-2)烷氧基c(1-6)烷基或c(1-6)烷氧基烷基，c(5-10)芳基
r5是h、c(1-3)烷基或c(1-3)烷氧基
r1和r2独立地是h或c(1-6)烷基，优选甲基或乙基，或者
r1和r2形成5或6元饱和的或不饱和的，优选饱和的环，所述环可选地包含杂原子，优选o、优选是噁嗪或吗啉，或作为选择地是n、优选是二嗪或哌嗪环，或
所述环可选地是取代的或未取代的哌啶环、优选是用oh和甲氧基的一个或两个取代的哌啶环，和苯基、优选在对位用卤素取代的苯基，所述取代基优选处在所述哌啶环的对位，
或其药学可接受盐。
5.在优选的实施方式中，所述s1r激动剂化合物是如本文的定义的或如上文限定的s1r激动剂化合物，所述s1r激动剂化合物具有以下的式i'：
其中
q1是h、卤素、拟卤素、可选地用1个、2个、3个或4个卤素取代的c(1-2)烷基、c(1-2)烷氧基、c(5-6)芳基，可选地用1个、2个、3个或4个卤素取代，
q2是h、卤素或拟卤素，
x是o，或
x具有式
w是-ch-或羰基(-co-)，和
r6和r6'是独立取代的或未取代的c(1-3)烷基，c(1-3)烷氧基、优选c(1-2)烷氧基c(1-6)烷基，c(1-4)烷氧基羰基，或者r6和r6'的至少一个、优选r6'是c(5-6)芳基，
或r6和r6'一起形成c(4-6)环烷基，优选环戊基或环己基
或x具有式
r6选自c(1-3)烷基、c(1-3)烷氧基、c(1-4)烷氧基c(1-6)烷基或c(1-6)烷氧基烷基、c(1-4)烷氧基羰基或c(5-6)芳基，
y是o或-o-ch2-ch2-o-
其中
r4不存在，
r3选自h、c(1-4)烷基、c(1-4)烷氧基、c(1-2)烷氧基(1-6)烷基、c(1-6)烷氧基烷基、或c(5-6)芳基
r5是h、c(1-3)烷基或c(1-3)烷氧基
r1和r2独立地是h或甲基或乙基，或
r1和r2形成5或6元饱和的或不饱和的、优选饱和的环，所述环可选地包含杂原子，优选o、优选是噁嗪或吗啉，或作为选择地是n、优选是二嗪或哌嗪环，或者
所述环可选地是取代的或未取代的哌啶环、优选是用oh和甲氧基的一个或两个取代的哌啶环，和苯基、优选在对位用卤素取代的苯基，所述取代基优选处在所述哌啶环的对位，
或其药学可接受盐。
6.在进一步优选的实施方式中，所述s1r激动剂化合物具有以下的式ii：
其中
q1是cl或f或选自ch2f、chf2、cf3、ch2cl、chcl2、ccl3的用卤素取代的甲基、或甲氧基
q2是h、cl或f，
r6选自取代的或未取代的c(1-3)烷基、c(1-3)烷氧基、c(1-2)烷氧基c(1-6)烷基、c(5-6)芳基，
y是o
r4不存在，
r3是h、甲基或乙基，
r5是h、甲基或乙基，
r1和r2独立地是h、甲基或乙基，
或其药学可接受盐。
7.在优选的实施方式中，在式ii中
q1是选自chf2、cf3、chcl2和ccl3的用卤素取代的甲基，
q2是h，
r6选自取代的或未取代的c(1-2)烷氧基c(2-5)烷基，
y是o，
r4不存在，
r3是h或甲基，
r5是h、甲基或乙基，
r1和r2独立地是h、甲基或乙基，
或其药学可接受盐。
8.在高度优选的实施方式中，所述化合物是氟伏沙明。
9.在优选的实施方式中，所述s1r激动剂化合物具有以下的式iv
其中q1和q2相互独立地是h或c(1-2)烷基，
r6和r6’一起形成c(4-6)环烷基，优选环戊基或环己基
y是o或o-ch2-ch2-o，
r3是h、甲基或乙基，
r5是h、甲基或乙基，
以及r1和r2独立地是h或、甲基或乙基，或
r1和r2形成5或6元环，其是饱和的或不饱和、优选饱和的，
所述环任选地包含杂原子，优选
-o，优选所述环是噁嗪或吗啉，或
-n，优选所述环是二嗪或哌嗪环。
10.在优选的实施方式中，所述化合物选自pre-084和喷托维林(pentoxyverine)(维静宁(carbetapentane))。
11.在高度优选的实施方式中，所述化合物是pre-084。
优选为s1r激动剂化合物的体外用途，该s1r激动剂化合物用于在保藏溶液中保存的整体或部分器官、或者组织的保存期间降低、延迟或防止细胞损伤，其中所述s1r激动剂化合物是氟伏沙明(fluvoxamine)或pre-084，特别是氟伏沙明，并且所述器官是肾脏或肝脏。
用于可移植的整体或部分器官、或者组织的体外保存的保藏溶液，所述溶液包括sigma1受体(s1r)激动剂化合物。
用于可移植的整体或部分器官、或者组织的体外保存的保藏溶液，所述溶液包含sigma1受体(s1r)激动剂化合物，其中所述整体或部分器官选自心脏、肺、包括肝脏、胰腺、肠、肾脏的腹部器官；皮肤。
用于可移植的整体或部分器官、或者组织的体外保存的保藏溶液，所述溶液包含sigma1受体(s1r)激动剂化合物，并且所述溶液适合于肾脏和/或肝脏的保存。
一种用于整体或部分器官、或者组织的保存的器官或组织保藏溶液，所述溶液包含s1r激动剂化合物。所述s1r激动剂化合物优选是编号段落1-11中定义的化合物。在更优选的实施方式中，所述s1r激动剂化合物是氟伏沙明或pre-084。氟伏沙明是高度优选的。在优选的实施方式中，所述器官选自心脏，肺，和包括肝脏、胰腺、肠、肾脏的腹部器官；皮肤、眼睛、骨髓。在更优选的实施方式中，所述器官是肾脏或肝脏。
一种用于可移植的整体或部分器官、或者组织的冷保存的器官或组织保藏溶液，所述溶液包含s1r激动剂化合物。一种用于整体或部分器官、或者组织的保藏的方法，所述方法包括在如上文和权利要求中限定的保藏溶液中维持、或维持并灌注所述器官或组织。在优选的实施方式中，所述器官或组织被保存在0℃-10℃的温度下、更优选0℃-4℃的温度下、高度优选约4℃的温度下的保藏溶液中。所述s1r激动剂化合物优选选自编号段落1-11中定义的化合物。在优选的实施方式中，所述s1r激动剂化合物是氟伏沙明或pre-084。氟伏沙明是高度优选的。保藏溶液当在准备分离/分离期间用于灌注器官/组织时可以具有更高的温度(例如，4℃)，当用于保存时可以具有更低的温度(例如，约0℃)。在优选的实施方式中，所述器官或组织已经从活的或死亡的供体受试者的身体分离。
附图说明
附图1.sigma-1受体(s1r)激动剂改善肾脏自体移植(autotransplantation,atx)诱导的肾脏功能
(a)在假手术的(sham-operated,sham)，或者载体处理的自体移植的(atxveh)、s1r激动剂氟伏沙明处理的自体移植的(atxflu)和s1r激动剂sa-4503处理的(atxsa)大鼠中再灌注24小时之后的血清肌酸酐水平。(b)再灌注24小时之后的血脲素氮(bloodureanitrogen,bun)水平。(c)再灌注24小时之后的血清天冬氨酸转氨酶(aspartateaminotransferase,ast)水平。与sham相比，+++p<0.05；与atxveh相比，*p<0.05；与atxveh相比**p<0.01；n＝6-8每组。
附图2.s1r激动降低atx诱导的小管损伤。
(a)在假手术的(sham)大鼠中，或者在载体处理的自体移植的(atxveh)、氟伏沙明处理的自体移植的(atxflu)和sa-4503处理的(atxsa)大鼠中再灌注24小时之后的正常化至β-肌动蛋白(actin,actb)表达的肾脏的肾损伤分子-1(kim1)的mrna表达。(b)正常化至β-肌动蛋白表达的肾脏嗜中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白(neutrophilgelatinase-associatedlipocalin(ngal)，lcn2)的mrna表达。(c)肾脏中的小管扩张。(d)对氨基水杨酸(para-aminosailcylicacid,pas)染色的肾脏切片上管腔(tubularlumen)扩张的代表性图像。红线显示小管直径，200×放大率，比例尺＝500μm。与sham相比，+++p<0.001；与atxveh相比，**p<0.01；与atxveh相比，***p<0.001；n＝6-8每组。
附图3.s1r激动降低肾脏中atx诱导的凋亡。
(a)在假手术(sham)的大鼠中，或者在载体处理的自体移植(atxveh)、氟伏沙明处理的自体移植的(atxflu)大鼠中再灌注24小时之后肾脏中tunel阳性凋亡细胞的比例。(b)正常化至18s核糖体rna(rn18s)表达的促凋亡bax的肾脏mrna表达。(c)正常化至18srrna表达的抗凋亡bcl2的肾脏mrna表达。(d)tunel染色的肾脏切片的代表性的图像。核的tunel阳性棕色染色显示凋亡细胞，200×放大率，比例尺＝100μm。与sham相比，+++p<0.001；与atxveh相比，*p<0.05；n＝6-8每组。
附图4.s1r激动对肾脏中atx诱导的炎性反应的影响。
(a)在假手术(sham)的大鼠中，或者在载体处理的自体移植的(atxveh)、氟伏沙明处理的自体移植的(atxflu)大鼠中在灌注24小时之后浸润到肾脏的皮质髓质区的cd45+淋巴细胞的数量。(b)浸润到皮质髓质区的cd45+淋巴细胞的代表性的免疫组织化学图像。棕色染色显示cd45+淋巴细胞，200×放大率，比例尺＝100μm。与sham相比，+++p<0.001；与atxveh相比，**p<0.01；n＝6-8每组。
附图5.s1r激动对肾脏中atx诱导的炎性反应的影响。
(a)假手术的(sham)大鼠中、或者在载体处理的自体移植的(atxveh)、氟伏沙明处理的自体移植的(atxflu)大鼠中再灌注24小时之后，正常化至18srrna表达的肾脏单核细胞化学吸引蛋白-1(monocytechemoattractantprotein-1,mcp1)mrna表达。(b)正常化至18srrna表达的，肾脏白细胞介素-6(il6)mrna表达。(c)正常化至18srrna表达的肾脏白细胞介素-1α(il1α)mrna表达。(d)正常化至18srrna表达的肾脏肿瘤坏死因子-α(tnf)mrna表达。(e)正常化至18srrna表达的肾脏白细胞介素-10(il10)mrna表达。(f)il-1α(细胞介白素-1α，cellintereukin-1α)的肾脏蛋白表达。(g)tnf-α(肿瘤坏死因子-α，tumornecrosisfactor-α)的肾脏蛋白表达。(h)il-10的肾脏蛋白表达。与sham相比+p<0.05；与sham相比，++p<0.01；与sham相比，+++p<0.001；与atxveh相比，*p<0.05；与atxveh相比，**p<0.01；n＝6-8每组。
附图6.含有s1r激动剂的保藏溶液改善冷缺血诱导的小管损伤。
(a)在以下的组中正常化至18srrna表达的肾脏kim1mrna表达：经历2小时冷灌注(2hcp)的肾脏；用含有氟伏沙明的保藏溶液2小时冷灌注(2hcp+flu)的肾脏；用含有sa-4503的保藏溶液2小时冷灌注(2hcp+sa)的肾脏；用含有s1r激动剂pre-084的保藏溶液2小时冷灌注(2hcp+pre)的肾脏；用含有flu和s1r激动剂ne100的保藏溶液2小时冷灌注(2hcp+flu+ne100)的肾脏；用含有ne100的保藏溶液2小时冷灌注(2hcp+ne100)的肾脏，以及用含有flu的保藏溶液3小时冷灌注(3hcp+flu)的肾脏。与2hcp相比，+p<0.05；与2hcp相比，*p<0.001(b)肾脏中的小管扩张。与2hcpcustodiol相比，*p<0.05；与2hcpcustodiol相比，**0.01；与2hcpcustodiol相比，***0.001；与3hcpcustodiol相比，#p<0.05；与3hcpcustodiol相比，###p<0.001；与8hcpcustodiol相比，$$$p<0.001；与24hcpcustodiol相比，$$p<0.01；n＝6每组。
附图7.含有s1r激动剂的保藏溶液改善肾脏中冷缺血诱导的凋亡。
(a)在经历了custodiol溶液的2小时冷灌注(2hcpcust)；含有氟伏沙明的custodiol溶液2小时冷灌注(2hcpcust+flu)；生理盐水的2小时冷灌注(2hcpsaline)；含有flu的生理盐水的2小时冷灌注(2hcpsaline+flu)；hypothermosol溶液的2小时冷灌注(2hcpht)；含有flu的ht溶液的2小时冷灌注(2hcpht+flu)的肾脏中的裂解的半胱天冬酶3的蛋白质水平。(b)正常化至18srrna表达的肾脏抗凋亡的bcl2mrna表达。与2hcp相比，+p<0.05；与2hcpsaline相比，$p<0.05,n＝6只每组。
附图8.肾脏自体移植的实验设计
附图9.8h冷缺血之后he染色的肝脏切片。黑色箭头指向细胞质液泡。400×放大率，比例尺＝50μm。(a)custodiol，(b)含有0.003mg/mlsa4503的custodiol，(c)含有0.003mg/mlflu的custodiol，以及(d)含有0.003mg/mlpre-084的custodiol。
具体实施方式
在大多数移植病例中，器官保藏是必要的，以在恢复期间保持供体器官活力，且直到移植时间。保存的特征在于氧化应激、降低的no水平并产生血管收缩，提高的血小板聚集、单核细胞粘附、白细胞活化、水肿、膜降解的趋势并最终以坏死和凋亡形式的细胞死亡。发现凋亡是保存、特别是冷保存时间的重要限制因素。凋亡包括不同的形态改变，如膜质出泡(blebbing)、细胞皱缩、核碎裂、染色质凝缩、染色体dna段裂、以及全局的mrna衰变。ph调节被干扰，氧衍生的自由基的生成增加，其反过来削弱细胞性和系统性防御机制。公认的是冷却更进一步增加已经被热缺血损伤的细胞易感性以生成自由基，并且减弱天然防御机制，细胞通常通过该天然机制处理新陈代谢中的低水平自由基产生。
从循环以及随后的冷保存分离的热冲击诱导应激蛋白。已经显示冷保藏提高半胱天冬酶-3蛋白活性、半胱天冬酶-3活性和肾脏中的小管细胞的凋亡(janietal.caspaseinhibitionpreventstheincreaseincaspase-3,-2,-8and-9activityandapoptosisinthecoldischemicmousekidneyamjtransplant4(8)1246-1254,2004)，而在冷保藏之前的热缺血提高半胱天冬酶-1活性(janietal.perfusionstoragereducesapoptosisinaporcinekidneymodelofdonationaftercardiacdeath.transplantation.2011jan27；91(2):169-75.)。
保藏增强已经在热缺血期间存在的炎症反应。
来自扩展标准供体的器官对于保藏和缺血更为敏感的。约80％的移植来自死亡供体，在此情况下冷缺血时间对于移植物功能延迟恢复是更显著的风险因素。因而冷保存的持续时间应当保持最小。
在人类移植中，器官通常用冷的(例如，4℃)保藏溶液灌注，并在冰上保存和运输，即，在温度0-10℃、4-10℃或2-10℃或在4℃下的保藏溶液中冲洗和保存(浸没)。分离的器官被浸没在冷的溶液中，并置于通过在冰上保存来保持冷却的无菌的袋或容器中。
本发明的目的是提供延长保藏时间、降低由保藏和保存引起的器官损伤、凋亡、细胞应激和炎症损伤的方法。特别地，通过本文提供的溶液，冷保存时间被延迟，冷保存诱导损伤被延迟或降低。
“最大保藏时间”(或“最大保存时间”)是指在此期间器官保持活力和适合于移植的时期。这一时期必须考虑器官类型、保藏方法、器官的状态来确定。在器官移植领域工作的技术人员知晓确定器官活力和器官的移植风险的可接受性的指南和方法。虽然保藏时间可以根据具体情况具体确定，但是也可以基于器官类型、保藏方法、供体状态等的可用数据进行预测和计算(“预测的保藏时间”)。移植之前进行的移植物评估提供了关于保存的器官的状态的可靠数据。(器官为肾的情况下，可以评估肾脏功能和小管细胞功能[例如，肌酸酐清除、酸碱平衡、滤过分数、总蛋白排出]、灌注参数[例如，溶血作用、肾血流量]和肾脏重量的改变、测量胞内酶或损伤生物标记物[ast、alt、ldh、凋亡标记物]的灌注液分析)。
在本公开内容的上下文中，“可移植的器官”或“可移植的组织”分别是在从供体分离之后可以保持活力、并可以被移植给接受者的指器官或组织，在该接受者中所述器官或组织保持功能性。可移植的器官或组织可以指人造器官或组织，这些人造器官和组织在被移植给接受者时变为并保持功能性。可移植器官的实例为：肾脏、心脏、胰腺、肝脏、肠、血管、皮肤、眼睛等。通过移植器官的一部分(“部分器官”)或组织而不是完整器官，也有可能改善器官的状况。例如，可以移植肝叶或肺叶、角膜、部分皮肤。本文提供的保藏方法可以用于组织和细胞的保存，因为相同的保藏原理适用。在本发明的优选的实施方式中，器官是实体器官。“实体器官”是一种可移植的器官，其具有明确定义的组织一致性或结构，并且不是液体(例如，血液、骨髓、细胞悬浮液等)。这样的器官包括，例如，心脏、肾脏、肝脏、肺和胰腺。
“保存或保藏”是指通过用所述保藏溶液冲洗、浸没或其他方式处理器官将所述器官维持在保藏溶液中。保存包括静态保存和连续(机械的)灌注。保存或保藏是指体外保存或保藏，也就是说，在体外执行用s1r化合物或用含有保藏溶液的s1r化合物处理。提供了s1r激动剂化合物的体外用途，即，所述化合物与待保存在在活体或尸体供体身体之外的器官接触。
“冷保存或冷保藏”是指保存或保藏温度低于或至少5℃、低于或至少10℃低于该器官或组织所属物种的正常核心温度特性，特别是低于10℃的温度。
“冷缺血”是指缺血状态，在该状态中器官从循环中分离。因而冷缺血可以指正常体温的或亚正常体温的状况。
“保藏溶液”要被理解为适合于保持分离的或人造的器官或组织的活力直到所述器官或组织被移植到接受者中的水性溶液。该术语还指在分离或保准备存期间用于灌注器官或组织的灌注液。
本文使用的“改善的”是指防止或延迟由保存引起的结构或功能损伤。它还可以指受保存诱导损伤影响的结构或功能的部分或完全恢复。改善可以通过分析已经施用了试剂以改善损伤的样品(“改善的样品”)中所述损伤的标记物，并通过将该结果与预测的或测量的同样情况下缺少被施用以改善所述损伤的试剂样品(“未改善的样品”)中的损伤的标记物相比较来测量。改善可以意味着改善样品的测量参数与非改善样品的预测或测量参数之间统计学上显著的差异。
(生物)标记物的“改变的水平”是-由于保存引起的损伤-不同于未经历保存时所述生物标记物的健康、正常水平的所述生物标记物的水平。标记物的健康(正常、标准)水平可以根据公知的指南和一般实验室实践来确定。
s1r激动剂化合物
期待的是，在原理上任何s1r受体激动剂可以适用于本发明。优选的是相对于s2r是高度选择性的s1r激动剂。还优选的是对s1r受体具有强亲和性并且具有较少副作用的s1r激动剂。
如果化合物对于s1r具有比s2r更高的亲和性、优选更高5倍、或更高20倍，或更高50倍、或至少更高102倍、或至少更高103倍、或至少更高104倍的亲和性，那么化合物是相对于s2r对s1r为选择性的。
s1r激动剂属于化合物的各种结构基团。在本发明中，在发明的简要说明中定义的化合物是优选的。
在实验部分中，以三种s1r激动剂化合物：氟伏沙明、sa-4503(奎特美辛cutamesine)和pre-84显示了说明性的实验。已经发现氟伏沙明对于降低、延迟或防止保存在保藏溶液中要移植的器官或组织的功能损伤和/或结构损伤是三种化合物中最成功的。式i′的化合物是优选的。式ii的化合物是高度优选的。实际上，已经发现氟伏沙明比sa4503出人意料地更为有效。氟伏沙明和pre-084是特别优选的。氟伏沙明是高度优选的。
s1r激动剂化合物可以具有以下的式i，
以及如上文的编号段落3中定义的取代基，
优选
q1是卤素、拟卤素、甲基-卤素或乙基-卤素，
q2是h、卤素或拟卤素，
x是o、ch2，或者x具有式
其中r6选自由取代的或未取代的c(1-6)烷基、优选c(1-4)烷基，c(1-6)烷氧基、优选(1-4)烷氧基，c(1-6)烷氧基烷基，c(5-10)芳基、优选c(5-6)芳基构成的组，
或x具有式
其中r6选自取代的或未取代的c(1-6)烷基、优选c(1-4)烷基，c(1-6)烷氧基、优选(1-4)烷氧基，c(1-6)烷氧基烷基，c(5-10)芳基、优选c(5-6)烷基，
y是ch、n或o，其中
如果y是o，则r4不存在，
如果y是n，则r4是h、甲基或乙基，
如果y是ch，则r4选自取代的或未取代的c(1-4)烷基，c(1-4)烷氧基，c(5-10)芳基、优选c(5-6)芳基，
r3选自h、取代的或未取代的c(1-6)烷基、优选c(1-4)烷基，c(1-6)烷氧基、优选c(1-4)烷氧基，1-6)烷氧基烷，c(5-10)芳基、优选c(5-6)芳基，或
r3和r6与它们附接的-x-y-c2烷基部分一起可以形成饱和的或部分不饱和的6到8元环烷基或包含0到3个杂原子的6到8元杂环烷基，或
r3和r6与它们附接的-x-y-c2烷基部分一起可以形成取代的或未取代的c(7-14)多环芳基或多环杂芳基，或
r3和r4与它们附接的-x-y-c2烷基部分一起可以形成饱和的或部分不饱和的6到8元环烷基或包含0到3个杂原子的6到8元杂环烷基，或烷基芳基、优选包含取代的或未取代的苯基，
r1和r2独立地是h、甲基或乙基，
或其药学可接受盐。
所述s1r激动剂化合物可以具有以下的式ii：
其中
q1是cl或f、或选自ch2f、chf2、cf3、ch2cl、chcl2、ccl3的甲基-卤素，或可选地是甲氧基
q2是h、cl或f，
r6选自取代的或未取代的c(1-6)烷基、优选c(1-4)烷基，c(1-6)烷氧基、优选(1-4)烷氧基，c(1-6)烷氧基烷基(或c(1-6)二烷基-醚)，c(5-10)芳基优选c(5-6)芳基，
y是ch或o，其中
如果y是o，则r4不存在，
如果y是ch，则r4是h、甲基或乙基，
r3是h、甲基或乙基，或r3和r4与它们附接的-y-c2烷基部分一起可以形成包含0到2个杂原子的饱和的或部分不饱和的环基团，或r4和r3一起形成c2-4烷基桥，
r1和r2独立地是h、甲基或乙基，
或其药学可接受盐。
在某些实施方式中，在式ii中
q1是选自chf2、cf3、chcl2和ccl3的甲基-卤素，
q2是h，
x具有式
其中r6选自取代的或未取代的c(1-6)烷氧基烷基(或c(1-6)二烷基-醚)或c(1-2)烷氧基c(2-5)烷基，
y是ch或o，其中
如果y是o，则r4不存在，
如果y是ch，则r4是h、甲基或乙基，
r3是h或甲基，
r1和r2独立地是h、甲基或乙基，
或其药学可接受盐。
s1r拮抗剂化合物可以具有以下的式i”
其中q1和q2相互独立地选自由卤素、优选i、cl和f，以及c(1-3)烷氧基，优选甲氧基构成的组，
y是-ch-或n，
x是亚乙基或酰胺，
或x具有式
其中w是-ch-或羰基(-co-)，和
r6和r6'是独立取代的或未取代的c(1-3)烷基、c(1-3)烷氧基，或者r6和r6'之一是苯基，
r4是c(2-3)烷基，或r4是c(2-3)亚烷基或c(2-4)烯基，
r1和r2形成5或6元环，该5或6元环是饱和的或不饱和的，优选是饱和的，
所述环可选地包含杂原子，优选
-o，优选所述环是噁嗪或吗啉，或
-n，优选所述环是二嗪或哌嗪环
r1是c(2-3)亚烷基并且与r4、y和n以及y与n之间的碳原子一起形成杂环，优选哌嗪或哌啶；和
r2是c(1-6)烷基、c(6-10)芳基或c(7-10)芳烷基，
或r2是c(3-6)亚烷基并且与所述n一起形成杂环，优选四氢-四唑，
或r2与r1、r4、y和n以及y与n之间的碳原子一起形成二环杂环，优选八氢吡咯并[1,2-a]吡嗪。
根据式i”的化合物的实施方式是根据式iii'的化合物：
且取代基是式i”加以必要的变更所定义的，
其中
r6是c(1-3)烷基、c(1-3)烷氧基，或r6是苯基。
s1r激动剂化合物可以具有以下式(iii)
q1和q2相互独立地选自由i、cl和f、c(1-3)烷氧基、优选甲氧基构成的组，
y是n，
r4是c(2-3)烷基，或r4是c(2-3)亚烷基或c(2-4)烯基
r1和r2形成5或6元环，该5或6元环是饱和的或不饱和，优选饱和的，
所述环可选地包含杂原子，优选为
-o，优选所述环是噁嗪或吗啉，或
-n，优选所述环是二嗪或哌嗪环
或r1是c(2-3)亚烷基并且与r4、y和n以及y与n之间的碳原子一起形成杂环，优选哌嗪或哌啶；和
r2是c(1-6)烷基、c(6-10)芳基或c(7-10)芳烷基，
或r2是c(3-6)亚烷基并且与所述n一起形成杂环，优选四氢-四唑，
或r2与r1、r4、y和n以及y与n之间的碳原子一起形成二环杂环，优选八氢吡咯并[1,2-a]吡嗪。
在式iii的某些实施方式中
q1和q2相互独立地选自由cl、f和甲氧基构成的组，
y是n，
r4是c(2-3)烷基，或r4是c(2-3)亚烷基或c(2-4)烯基，
r1和r2形成5元环，所述环包含n，
或r1是c(2-3)亚烷基并且与r4、y和n以及y与n之间的碳原子一起形成杂环，优选哌嗪或哌啶；和
r2是c(1-6)烷基、c(6-10)芳基或c(7-10)芳烷基，
式iii的化合物的一实施方式是sa4503(奎特美辛)。
s1r激动剂化合物可以具有以下的式iv
其中q1和q2相互独立地是h或c(1-2)烷基，
r6和r6'一起形成c(4-7)环烷基，优选环戊基或环己基
y是o或o-ch2-ch2-o或nh，
并且r1和r2独立地是h或、甲基或乙基，或
r1和r2形成5或6元环，该5或6元环是饱和的或不饱和，优选饱和的，
所述环可选地包含杂原子，优选
-o，优选所述环是噁嗪或吗啉，或
-n，优选所述环是二嗪或哌嗪环。
s1r激动剂化合物可以具有以下式v
其中q1是卤素、苯基或h，
r3是h或甲基(me)，
r5是h、c(1-3)甲基或c(1-3)烷氧基，
x具有式
其中w是亚甲基或不存在，和
r6是h或甲基，
r6'是c(1-6)烷基、c(1-10)烷氧基或c(6-10)芳基，优选苯基，
或r5和r6与它们附接的碳原子一起形成3、4、5或6元环(饱和的或不饱和的，优选饱和的)，所述环可选地包含杂原子，优选o，其中所述环优选是呋喃基、二氢呋喃基或四氢呋喃基，更优选四氢呋喃基，其中优选所述化合物是anavex2-73，
或x具有式
其中r6选自取代的或未取代的c(1-2)烷基和c(1-2)烷氧基和c(6-10)芳基，优选(1-2)烷基，优选甲基，
其中优选所述化合物是rc-33。
s1r激动剂化合物可以具有以下式(vi)
其中q1和q2相互独立地选自由卤素、优选cl和f，以及c(1-3)烷氧基、优选甲氧基构成的组，
r1和r2独立地是h、甲基或乙基，
在式ii中，q1和q2可以是相同的，并且可以选自由cl、f和甲氧基构成的组，
r1和r2独立地是h、甲基或乙基。
如本文使用的，术语“烷基”单独地或在组合中意味着直链或支链的烃基基团，该烃基基团优选含有1到6个、优选1到4个或1到3个碳原子、或1到2个碳原子(即，分别为“c(1-6)”“c(1-4)”或“c(1-3)”或“c(1-2)”烷基基团)，例如，甲基、乙基、丙基、异丙基、丁基、仲丁基和叔丁基。
如本文使用的，术语“烷氧基”意味着烷基-o-基团，其中烷基基团是如先前描述的。适合的烷氧基基团的非限制性实施例包括甲氧基、乙氧基、正丙氧基、异丙氧基和正丁氧基，优选甲氧基。与母体部分的键合是通过氧(如果与碳原子键合，则为醚氧)。
术语“烷氧基烷基”意味着被烷氧基基团取代的烷基基团，即先前描述的烷基-o-基团。与烷基部分的键合是通过氧，即它是醚氧。
如本文单独或组合地使用的，“烯基”意味着直链或支链的不饱和烃基团，该烃基基团含有至少一个碳-碳双键，所述烃基团优选含有2到6个、优选2到4个或2到3个或2个碳原子(即，“c(2-6)”“c(2-4)”或“c(2-3)”或“c(2-2)”烷基基团)。
本文使用的术语“环烷基”是由至少三个碳原子组成的非芳香族碳基烷基环。
本文使用的“杂环的”环是环部分，除了碳原子之外该环部分具有至少一个非碳元素作为它的环的成员。优选地，该杂环部分的环是5到6元环。
术语“杂环烷基”是指可衍生自上文定义的环烷基团的“杂环的”环，其中环的至少一个碳原子被替换为杂原子，例如但不限于氮或氧、硫。
本文使用的术语“芳基”是含有任何碳基芳香环的基团，其优选是单环基团或双环基团。术语芳基还可选地包括“杂芳基”，该“杂芳基”被定义为含有芳香基团的基团，所述芳香基团在所述芳香基团的环内掺有至少一个杂原子。杂原子的实施例包括但不限于氮和氧。可选地，术语“芳基”限于非杂芳基，其也被包括在术语芳基之中，定义了含有不含杂原子的芳香基团的基团。优选地，术语“芳基”是指5或6元单环的、或8到12元双环的芳香环或杂芳香环。更优选地，术语“芳基”是指苯基或萘基
本文使用的术语“芳烷基”是指芳基烷基基团，其通过烷基基团连接到母体分子，该烷基基团可选地还可以用一个或多个、优选一个到三个或一个到两个取代基取代。
术语“环烷基芳基”是指包含稠合(fused)环烷基和环芳基环的基团。优选地，“环烷基芳基”部分通过该基团的环烷基部分附接至本发明的化合物。
如本文所使用的，术语“稠合环”意味着该环与至少一个其他环稠合以形成包含两个或更多个环的化合物基团，在该环中环的两个成员原子之间的单键与所述两个成员一起在所述两个环中是共同的，即，由两个环共享。稠合环的实施例是多环芳基。多环芳基在本文中理解为含有碳基基团的多个环的基团，在这些碳基基团的多个环中至少一个环是芳基并且其可选地还可以包含环烷基和/或杂环烷基。
“取代的”部分包含选自本文定义的基团和部分的取代基；然而，取代基比由此取代的部分更小，即更短，即由不是更多、优选更少的原子组成。
当式中所表明的部分“不存在”时，它意味着在由该式说明的结构中具有单键(共价键)，该式连接不存在的该部分附近所表明的原子。
虽然以冷保存方法证明了s1r激动剂化合物的示例性用途，但是也考虑了正常体温方法。
与保存在没有s1r激动剂化合物的常规灌注溶液中的肾脏移植物相比，在含有s1r受体激动剂化合物的灌注溶液中的肾脏移植物的保存显露出显著的肾脏保护作用，该显著的肾脏保护作用在(i)保存和(ii)保存及随后的自体移植的肾脏中，通过改善功能参数和组织学参数所标记。在s1r激动剂化合物处理的组中，还更多地保持了肾脏的健康结构。由于以含有s1r激动剂化合物的灌注溶液灌注并保存在该s1r激动剂化合物的灌注溶液中的肾脏比载体(即，没有s1r激动剂化合物的相同灌注溶液)处理的移植物显示了显著更好的功能参数和组织学参数，合理假定的是，当s1r激动剂化合物预处理的肾脏被移植到接受者中时，s1r激动剂化合物预处理的肾脏已经处于更好的总体状况下，因而此后在肾脏移植期间对缺血/再灌注损伤更有抗性。
虽然本文呈现的大部分数据涉及custodiol(franzkohlerchemiegmbh，bensheim，germany)，使用生理盐水和ht溶液(
保藏溶液可以包含防止细胞肿胀的渗透活性剂(例如，柠檬酸盐、乳糖醛酸盐)、用于渗透作用的电解质(na+、k+、ca2+、mg+)、调节h+浓度的质子缓冲剂(例如，磷酸盐、组氨酸)、用于最初的血管冲洗和灌注的胶体(例如，白蛋白、羟乙基淀粉(hydroxyethylstarch,hes))、抑制细胞成分降解的代谢抑制剂(例如，别嘌呤醇)、促进新陈代谢恢复的代谢物(例如，谷胱甘肽)以及自由基清除剂(例如维，生素e)。
custodiol和ht的组合物在方法章节作为示例性的保藏液给出。
考虑到相似的组合物和保藏液的目标，本文呈现的结果表明，在可移植分离的或人造的器官和组织的保藏中使用的任何保藏溶液中s1r激动剂化合物的适用性。
通过例如增加的凋亡细胞的数量、增加的细胞凋亡标记物bax表达和/或裂解半胱天冬酶表达、减少的和/或抗细胞凋亡标记物bcl-2表达表明保存期间器官的细胞损伤。s1r激动剂化合物显露了显著的抗细胞凋亡效应，该抗细胞凋亡效应通过由末端标记法(terminal-deoxynucleoitidyltransferasemediatednickendlabeling,tunel)染色确定的减少的凋亡细胞数量、减少的细胞凋亡标记物bax表达、减少的细胞凋亡标记物裂解半胱天冬酶(319kda形式)水平，增加的以及抗细胞凋亡标记物bcl-2表达所表明。因此，在一实施方式中，细胞损伤与增加的凋亡细胞数量、增加的细胞凋亡标记物bax表达和裂解半胱天冬酶表达、以及减少的抗细胞凋亡标记物bcl-2表达中的任意一项或多项相关联。在保存期间降低、延迟或防止细胞损伤包括，与在相同条件下并且在具有相同组成但不包含s1r激动剂化合物的保藏溶液中保存的器官中的相应细胞数量或表达水平分别相比，降低的细胞凋亡细胞数量、降低的细胞凋亡标记物bax表达水平和降低的裂解的半胱天冬酶水平、提高的以及抗细胞凋亡标记物bcl-2表达水平中的任意一项或多项。技术人员将认识到这些和其他已知的细胞凋亡或抗细胞凋亡标记物可以通过本领域公知的方法在任何可移植的器官中测量。在几种组织，例如，中枢神经系统、肺、胰腺、心脏、脾脏、肾脏、内分泌组织、免疫组织和生殖组织之中，显示了s1r的存在。技术人员还将认识到，s1r激动剂化合物可以用于展现s1受体的器官的保藏。
s1r激动剂化合物显露了本文通过几种促炎性细胞因子证明的抗炎作用。炎症的标记物以及检测它们的方法是本领域公知的。在保存期间的细胞缺陷和/或功能缺陷与il-6、il-1α、tnf1的任意一种或多种的提高表达水平(例如通过mrna水平测量的)、以及cd45+淋巴细胞的数量提高相关。因此，与在相同条件下并且在具有相同组成但不含所述s1r激动剂化合物的保藏溶液中保存的器官中相应的细胞数量或表达水平相比，降低、延迟或防止细胞损伤和/或功能损伤包括降低的il-6的表达水平、降低的il-1α的表达水平、降低的tnfα的表达水平、以及降低的cd45+淋巴细胞数量的任意一项或多项。
在一实施方式中，与在相同条件下和在具有相同组成但不包含s1r激动剂化合物的保藏溶液中保存的器官中相应的标记物相比，选自凋亡细胞数量、il-6表达水平、il-1α表达水平中的一个或多个标记物水平降低。
s1r激动剂化合物的使用明显地延长了本文描述的实验中的保藏时间。，通过组织学分析证明了，在1.5倍更久或甚至10倍更久的保藏时间之后，在含有氟伏沙明的保藏溶液中保存的器官比在保存在不含有氟伏沙明的相同保藏溶液中的器官显示了少25％的组织损伤。
通过肾脏移植和分离的肾脏和肝脏的保存，举例说明了s1r激动剂化合物的效果。本文所描述的标记物之外的肾脏损伤的功能的、分子的和组织学的标记物以及测量这些标记物的改变的方法是本领域公知的。
在一实施方式中，器官是肾脏、或组织是肾脏组织，且与在相同条件下和在具有相同组成但不包含s1r激动剂化合物的保藏溶液中保存的器官中相应的标记物相比，通过降低的血清肌酸酐水平、降低的血尿素氮水平、降低的血液kim1水平、降低的血液mcp-1水平、降低的血液ngal水平、以及提高的肾小球滤过率的任一项所表明的，功能损伤被降低、延迟或防止。在另一个实施方式中，如管腔面积扩张的降低所表明的，进一步降低、延迟或防止了细胞损伤。
通过测量伴侣蛋白(例如，hsp(热休克蛋白，heatshockproteins)27、hsp72、hsp90)、血管活性剂(例如，前原内皮素、前列环素、血管紧张素)、凋亡途径标记物(例如，膜联蛋白(annexin)-v、bcl-2、半胱天冬酶-3,7)、坏死途径标记物(例如，dna片段)、炎症标记物(例如，tlr(靶病变血运重建，taregtlesionrevascularization)、nf-κβ、il-1、il-6、tnf-g)、免疫系统活化标记物(例如，il-1、il-6)、内切血浆(endoplasmatic)内质网应激标记物(例如，xbpl、黄嘌呤-氧化酶、sod(超氧化物歧化酶，superoxidedismutase))、氧化应激标记物(例如，xbpl、黄嘌呤-氧化酶、sod)、血管生成标记物(例如，vegf(血管内皮生长因子，vascularendothelialgrowthfactor)、sdf(基质细胞衍生因子，stromalcellderivedfactor))、重塑标记物(例如，mmp(基质金属蛋白酶，matrixmetalloproteinase)、timp-1(基质金属蛋白酶抑制剂-1，tissueinhibitorofmetalloproteinase-1)、timp-2)、再生标记物(例如，mmp、timp-1、timp-2)一种或多种的水平，可以分析细胞损伤。这些生物标记物的改变的水平是细胞损伤的表明。在其他器官中，可以检测其他损伤标记物。例如，对于肝脏来说，常规的实验室参数，例如升高的血清alt(丙氨酸转氨酶)、ast(天冬氨酸转氨酶)、gamma-gt和ldh(乳酸脱氢酶)水平是损伤的表明。在一实施方式中，器官是肝脏、或组织是肝脏组织，且与在相同条件下和在具有相同组成但不包含s1r激动剂化合物的保藏溶液中保存的器官中相应的标记物相比，通过降低的血清丙氨酸转氨酶水平、降低的血清天冬氨酸转氨酶水平、降低的血清gamma-gt水平、以及降低的血清乳酸脱氢酶水平的任一项所表明的，功能损伤被降低、延迟或防止。肝脏移植物中炎症性细胞因子例如il-6、tnf-α和ifn-植或抗炎细胞因子il-10的检测是常规操作，肝细胞中的半胱天冬酶-3、bcl-2和bax蛋白质表达(细胞凋亡标记物)的检测也是常规操作。可以测量肝脏移植物损伤特征性的组织学标记物，例如肝细胞肿胀、增加的细胞质空泡化、核固缩、窦状腺(sinusoidal)扩张和局灶坏死。功能参数，例如，胆汁生成、转氨酶水平、胆红素水平和凝血酶原时间也是移植器官的功能性指示。
对于胰腺移植物来说，可以测量胰岛素需求和c肽水平，以及淀粉酶产生。可以组织学评估外分泌胰腺和内分泌胰腺：水肿、嗜中性粒细胞浸润、淋巴细胞浸润、腺泡、出血和脂肪坏死、细胞凋亡和血管栓塞是组织损伤的特征。
移植的肺(组织)的可测量功能参数：血动脉气体(氧张力)、肺血流动力学(肺血管阻力)、肺顺应性，结构参数：干重比、光学显微镜检查、髓过氧化物酶含量。
活性氧产生、氧化损伤、血清肌钙蛋白i、搏动(beating)评分可以是移植心脏功能的可测量标记物。
s1r激动剂化合物氟伏沙明(flu)、sa4503和pre-084与特异性s1r拮抗剂ne100一起测试，进一步确认了这些化合物的保护效果中s1r的作用。ne100拮抗已经在几项实验中显示以强调s1r途径的作用。
我们的实验设置中冷缺血时间根据文献数据被设为2或3小时，甚至达到24小时，并通过显著地受损的肾脏功能参数进行验证。按照本领域和人体移植(分离的器官保持在冰上)中的惯例，保藏溶液的温度对于灌注是4℃，在保存期间约0℃，
该研究旨在模拟死亡供体的最可能的真实生命情景，因此不涉及使用s1r激动剂化合物的供体的预处理。这种处理安排还排除了已知在供体中发生的s1r激动剂化合物的全身性和局部抗炎效果，并且在肾脏分离之前保护肾脏免受iri(缺血再灌注损伤，ischemiareperfusioninjury)。
还避免使用s1r激动剂化合物对接受者的治疗，因此该化合物的全身性保护效果也不会促进所测量的改善的功能和组织学参数。
向保藏溶液中添加s1r激动剂化合物导致与现有技术那些已知情况非常不同的情况，在现有技术中供体或接受者或两者用测试试剂治疗。在目前安排下，仅被移植的肾脏受到影响。此外，仅在保藏溶液中使用的活性剂的效果(即，体外的)肯定不同于向活体全身性施用的相同试剂的效果。
为了测试分离并保存的肾脏的功能性，我们不仅分析了保存之后的肾脏，还使用了大鼠肾脏自体移植模型。这种模型容许免疫抑制相关的免疫反应和毒性的混淆效应的消除防以防止同种异体移植物排斥。
s1r激动剂化合物向保藏溶液中的添加在(i)冷保存和(ii)冷保存和随后移植之后改善肾脏结构。
如方法章节中描述的评估了(i)保存和(ii)保存后移植之后的肾脏结构。通过测量管腔面积来定量小管损伤的程度。管腔的扩张是小管上皮细胞的降解引起，是小管损伤的良好指示剂。
(i)保存。在其中添加了氟伏沙明的保藏溶液中保存的肾脏中，管腔扩张较少。sa4503或pre-084的添加也显示了类似的作用，尽管程度较低。在附图6b中可见提高小管损伤，显示了在冷保存2和3小时之后测量的管腔面积的尺寸。氟伏沙明的添加抑制了这种损伤的增加。同样明显的是，在存在氟伏沙明的情况下在冷缺血3小时、8小时或甚至24小时之后结构损伤比在没有氟伏沙明的较短的2小时缺血后更加不显著。该结果强烈地表明，s1r激动剂化合物且特别是氟伏沙明具有延长保存(冷缺血)时间的潜力。
(ii)保存后移植。与标准的保藏溶液相比，当氟伏沙明或sa4503添加到保藏液中时测量的管腔面积显著更小，显示含有s1r激动剂化合物的溶液更好地保存分离的肾脏的结构(附图2c)
pas染色的肾脏切片图的分析显示，在用常规的保藏液处理的肾脏中小管损伤和小球损伤是严重的。肾小球坍缩(collapsed)，它们的结构受损并降解。在小管上皮细胞中观察到过多坏死和固缩的核的标记。在含有氟伏沙明的保藏溶液中保存的肾脏显示了更轻微的组织学损伤。肾小球是完整的，小管核和血浆显示正常的染色。保留了小管的刷状缘。(附图2)
s1r激动剂化合物向保藏溶液中的添加抑制细胞凋亡
细胞凋亡标记物
(i)保存：氟伏沙明，sa4503和pre-084降低了保存的肾脏中的细胞凋亡激活物蛋白bax的mrna水平，尽管差异不是统计学上显著的。氟伏沙明处理显著地提高了抗细胞凋亡蛋白bcl-2的mrna水平。pre-084具有类似的作用，然而sa4503没有显示这样的作用(附图7c)。
通过custodiol和生理盐水二者中的氟伏沙明降低了裂解半胱天冬酶(319kda形式)水平，在ht中降低的趋势是明显的。
(ii)保存后移植。通过bax表达的显著降低(附图3b)和bcl-2的mrna水平的显著提高(附图3c)清楚地表明了氟伏沙明的作用。
tunel-染色
(ii)保存后移植。在tunel分析中检测了凋亡细胞。载体处理的肾脏显示了扩大的细胞凋亡面积，然而氟伏沙明处理的肾脏的肾小球显示了显著更少的凋亡细胞(附图3a、d1-d3)。
s1r激动剂化合物向保藏溶液中的添加通过热激蛋白诱导提供对细胞应激的保护
由氧化应激诱导了蛋白血红素加氧酶-1(ho-1)、热休克蛋白的表达，该氧化应激是例如不仅在肾脏中，如心脏、肝脏等的其他器官例中的缺血。
(ii)保存后移植。载体处理显著地提高了ho-1表达，氟伏沙明阻止该ho-1表达。
s1r激动剂化合物向保藏溶液中的添加在(i)冷保存和(ii)冷保存和随后移植之后改善肾脏功能。
肾脏损伤的早期标记物
近端小管损伤标记物肾脏损伤分子-1(kim-1)是具有免疫球蛋白和粘蛋白结构域的1型跨膜蛋白，它的表达在缺血后大鼠肾脏中的近端小管中显著地上调。表达kim-1的ptec(近端小管上皮细胞)作为驻留的(residential)吞噬细胞，有助于细胞凋亡细胞的脱除并促进受损小管的再生。近端小管对缺血特别敏感，使得kim-1成为良好的早期标记物。
单核细胞趋化蛋白-1(mcp-1)是在肾脏损伤中已知上调的另一种生物标记物。它是调节单核细胞或巨噬细胞的迁移和浸润的关键趋化因子之一。
肾脏嗜中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白(ngal)是与肾脏损害严重度相关的肾脏损伤特异性指示剂。在急性肾脏损伤的情况下，在损伤的数小时内ngal以高水平分泌到血液和尿液中，但它在慢性肾病中也是可检测的。它是肾脏损伤的存在和严重度的表明。ngal可以从血清或尿液中测量。
(i)保存。与载体处理的相比，在custodiol和氟伏沙明中保存的分离肾脏中显著地降低了kim-1水平(附图6a)。ne100向保藏液中的添加削弱了氟伏沙明的保护效果。sa4503和pre-084都抑制了kim-1的提高，尽管氟伏沙明的效果更为显著。虽然注意到了降低的趋势，单生理盐水中的氟伏沙明的效果更轻微。
与常规的custodiol相比，在含有氟伏沙明的保藏溶液中保存之后测量的，mcp-1水平升高较少。使用pre-084也看到类似的结果。
与载体处理相比，在custodiol中测试的所有三种s1r激动剂都降低了ngalmrna表达。还证明了生理盐水中的氟伏沙明的效力。
(ii)保存后移植。与假手术的动物相比，移植后在载体处理的大鼠中的kim-1表达水平显著提高，表明缺血性损伤。移植后测量的，氟伏沙明和sa4503处理导致显著更低的表达。
在氟伏沙明处理的自体移植的肾脏中，mcp-1的水平也显著提高更少。
与custodiol相比，氟伏沙明和sa4503处理显著降低ngal水平(附图2b)。
功能参数
(ii)保存后移植。与没有s1r激动剂化合物的保藏溶液相比，如通过更低的血清肌酸酐和ast水平所显示的，在氟伏沙明和sa4503处理的大鼠中肾脏功能实质上地改善了。此外，sa4503也显著地降低bun(血脲素氮)水平。
抗炎作用
如通过氟伏沙明处理的肾脏中炎症性细胞因子(il-10、il-1α、tnf1)的降低的mrna水平和蛋白质水平所显示的，在保存的和随后移植的肾脏中s1r激动剂具有抗炎作用。
s1r激动剂化合物向保藏溶液中的添加保护肝细胞在保存期间免受冷缺血
如通过细胞质液泡数量所显示的，通过向保藏溶液中添加s1r激动剂化合物甚至在冷保存8小时之后，保持了分离的肝脏的组织学完整性。(附图9)
用于在本发明中使用的s1r激动剂可以根据本领域的技术人员已知的方法来制备，或者是商业上可获得的，如氟伏沙明、sa4503、pre-084、4-ibp、anavex2-73，等。
例如，可以如美国专利us4,085,225和us6433225b1中描述的制备马来酸氟伏沙明。具有与氟伏沙明类似结构的化合物可以如美国专利us3692835、us4081551a、us4085225a、us4086361a或us4077999中描述的来制备。技术人员知晓基于上述专利和本领域技术人员(his/her)的一般知识的指导合成根据式i′、ii、iii、iv或v的化合物的适当方法。
ep2353598a1公开了包括奎特美辛和相关的化合物的sigma受体配体的合成。
pre--084是高亲和性的s1r激动剂，对s1r亚型是选择性的(对σ1和σσ受体，k分别＝2.2和13,091nm)。它是s1r的强力配体(ic50＝44mm)，对pcp受体没有明显的亲和性(ic50>100,000mm)，例如[griesmaiereetal.experimentalneurology237(2),388-395(2012)]描述了它的可用性。rossidaniela等人描述了基于芳基烷基胺支架(arylalkenylaminicscaffold)的sigma受体配体的合成，尤其是rc-33，参见表a[rossidetal.bioorganic&medicinalchemistry19(21),6210-6224(2011)]。pre-084和结构类似物可以如专利wo1992002481a1中描述的来制备。对于期望化合物的合成的修改是技术人员已知的。
已知大量的化合物都是s1r激动剂。测试结合亲和力和测量解离常数可以通过蛋白质和生物有机化学中的一般方法来进行。
例如，xurong等人公开了对sa4503的醚修饰对于结合亲和性以及对sr和单胺转运体的选择性的影响，以及测量这些参数的方法[rongxuetal.bioorganic&medicinalchemistry23(1),222-230(2015)]。
此外，rossidaniela等人(参见上文)在许多化合物之中选择和鉴定了强力的和选择性的s1r激动剂，并描述了相关的方法。此外，该作者仅使用活性化合物来开发三维的s1r药效基团模型以推导该模型。该模型包括两个疏水基和正氮作为相关的特征，并且该模型能够在对s1r亚型有亲和性和没有亲和性的分子之间进行区分。因而，制备和选择根据本发明的化合物完全在本领域技术人员的技能范围内。
测试潜在的s1r激动剂实际上是否是激动剂完全在本领域技术人员的技能范围内。
测试s1r激动剂是否作用于s1r的一般方法是使用特定的拮抗剂作为对照。这种公认的特定拮抗剂是ne-100，其是强力的和选择性的s1r拮抗剂(ki＝0.86nm)，其相对于s2r展现了>55倍的选择性，以及相对于d1、d2、5-ht1a、5-ht2和pcp受体(4-甲氧基-3-(2-苯基乙氧基)-n，n-二丙基苯乙胺盐酸盐)的>6000倍的选择性。ne-100展现了可逆的结合(kd＝1.2nm)[okuyamasetal.cnsdrugrev.2(2),226-237(1999),berardifetal.bioorg.med.chem.9(5),1325-35(2001)]。
保藏溶液中s1r激动剂化合物的浓度。本文描述的实验中的氟伏沙明浓度被选择为远低于抑郁症治疗中施用的一般日剂量。可以在国际和国家指南中找到计算“人体”剂量和浓度的指南，例如在食品和药物管理局提供的指南中，例如，成年健康志愿者治疗剂的初始临床试验中估计最大安全起始剂量的产业指导(guidanceforindustryestimatingthemaximumsafestartingdoseininitialclinicaltrialsfortherapeuticsinadulthealthyvolunteers)。
实施例
实施例
方法
化合物
氟伏沙明(马来酸氟伏沙明，sigmaaldrich,st.louis,mo,usa)，pre-084(2-吗啉-4-基乙基-1-苯基环己烷-1-羧酸酯，sigmaaldrich,st.louis,mo,usa)，sa4503(1-[2-(3,4-二甲氧基苯基)乙基]-4-(3-苯基丙基)哌嗪；tocrisbioscience,bristol,uk)；ne100(n-二丙基-2-[4-甲氧基-3-(2-苯基乙氧基)-苯基]-乙胺单盐酸盐，tocrisbioscience,bristol,uk)
肾脏同基因移植物自体移植的大鼠模型
动物
动物福利机构委员会批准了所有实验。在体重为205±15g的雄性wistar大鼠(toxi-cooptoxicologicalresearchcenter，dunakeszi，hungary)上执行实验。将动物饲养在温度受控(22±1℃)的具有交替的光照和黑暗循环的房间中，并且可以自由获取标准大鼠食物和水。
在手术前用与合成空气(1l/min)混合的异氟烷(3％vol/vol)麻醉雄性wistar大鼠(n＝8只/组)，并置于温控台上以维持核心体温。用冷的custodiol灌注溶液(na+：15mmol/l；k+：9mmol/l；mg2+：4mmol/l；ca2+：0.015mmol/l；组氨酸：198mmol/l；色氨酸：2mmol/l)l；酮戊二酸：1mmol/l；甘露醇：30mmol/l)(franzkohlerchemiegmbh，bensheim，germany)灌注左肾，然后从动物身上取下：将肾脏放入容器中2小时，该容器中装有(i)冷custodiol灌注液(atx)，或(ii)含有0.003mg/mlflu的冷custodiol灌注液(atxflu)，或(iii)含有0.003mg/mlsa4503的冷custodiol灌注液(atxsa)。2小时后，将肾脏放回大鼠中，并执行肾动脉、静脉和输尿管的端对端吻合术。取出对侧肾脏并观察自体移植的肾脏以确保再灌注。所有动物中总计的热缺血时间是35分钟。假手术的动物作为对照。
再灌注24小时后，从腹主动脉采集血液样品，收集残余肾脏，立即在液氮中快速冷冻，并在-80℃下储存或固定在缓冲的8％福尔马林中以进一步处理。附图9中显示了自体移植的实验设计。
肾脏和肝脏冷缺血的大鼠模型
在手术前用与合成空气(1l/min)混合的异氟烷(3％vol/vol)麻醉雄性wistar大鼠，并置于温控台上以维持核心体温。用5ml冷溶液通过肾动脉洗涤肾脏(n＝6/组)，然后从动物中取出并置于装有相同溶液的容器中2或3小时。使用以下灌注溶液：(i)custodiol，2小时冷灌注(cust.2hcp)；(ii)含有0.003mg/mlflu的custodiol，2小时冷灌注(cust.2hcp+flu)；(iii)含有0.003mg/mlsa4503的custodiol，2小时冷灌注(cust.2hcp+sa)；(iv)含有0.003mg/mlpre-084的custodiol，2小时冷灌注(cust.2hcp+pre)；(v)含有0.003mg/mlflu和0.001mg/mlne100的custodiol，2小时冷灌注(cust.2hcp+flu+ne100)；(vi)含有0.001mg/mlne100的custodiol，2小时冷灌注(cust.2hcp+ne100)；(vii)custodiol，3小时冷灌注(cust.3hcp)；(viii)含有0.003mg/mlflu的custodiol，3小时冷灌注(cust.3hcp+flu)；(ix)生理盐水，2小时冷灌注(saline2hcp)；(x)含有0.003mg/mlflu的生理盐水，2小时冷灌注(saline+flu2hcp)；(xi)
对于肝脏保存实验，将肝脏从动物中取出并置于装有相同溶液的容器中8小时(即含有0.003mg/mlflu的custodiol，含有0.003mg/mlsa4503的custodiol和含有0.003mg/mlpre-084的custodiol)。
代谢和肾脏参数的测量
使用商业上可获得的试剂盒在hitachi912光度化学分析仪上测量来自大鼠血清的代谢参数(葡萄糖、果糖胺、总胆固醇和hdl-胆固醇和甘油三酯)和肾脏功能参数(钠，钾，肌酸酐，血尿素氮(bun)，天冬氨酸转氨酶(ast))。
组织学分析
将肾脏固定在8％福尔马林中，包埋于石蜡中，用希夫氏过碘酸(pas)染色5μm切片来评估小管损伤。图像用panoramicviewer(3dhistechltd.,budapest,hungary)采集。每只小鼠在放大率×200的三个视野中测量管腔面积。在蔡司axiolmageral光学显微镜(carlzeissag，jena，germany)上，使用adobephotoshopcs6(adobesystemscorporation，sanjose，ca，usa)和imagej(nationalinstituteofhealth，bethesda，md，usa)软件使用计算机辅助形态测量法以双盲方式进行分析。
肝脏样品浸没在10％缓冲的福尔马林中。24小时之后，样品包埋在石蜡中，切成5μm切片并用苏木色素和曙红染色。
通过tunel分析的细胞凋亡检测
福尔马林固定的肾脏样品包埋在石蜡中。5μm厚的切片安装在superfrost玻片(thermoshandon,uk)上，手动脱石蜡。使用
免疫组织化学
福尔马林固定的肾脏样品包埋在石蜡中。一到二微米厚的切片安装在superfrost玻片(thermoshandon，runcorn，uk)上，并手动脱石蜡。通过甲醇中3％的h2o2在室温下抑制内源过氧化物酶活性20分钟。玻片浸没在0.05mm柠檬酸盐缓冲液(ph＝6)中，暴露于93℃10分钟(mfx-800-3自动的微波，meditest，budapest,hungary)。首先用稀释到1:100的抗-cd45抗体(abeam，剑桥，uk)处理玻片，在4℃孵育过夜。在洗涤之后，使用二抗biotinylatedlink(dako,glostrup,denmark)，在室温下孵育15分钟。为可视化，使用标准的抗生物素蛋白-生物素过氧化物酶技术(abcsystem，dako，glostrup，丹麦)，氨乙基咔唑作为发色团。
定量实时-pcr
使用geneaidtotalrnaminikit(geneaidbiotechltd.,newtaipeicity,taiwan)从肾脏分离总rna。使用用于rt-qpcr的maxima第一链cdna合成试剂盒(thermoscientific,waltham,ma,usa)逆转录500ngrna进行以产生第一链cdna。使用lightcycler480sybrgreen1master酶混合物在lightcycler系统(rochediagnostics,mannheim,germany)上以实时rt-pcr测定ngal(lcn2)、kim1、mcp1、il-1α、(il1a)、il-6(il6)、il-10(il10)、tnf-α(tnf)、ho-1(hmox1)、bax、bcl-2(bcl2)、18s核糖体rna(rn18s)和β和肌动蛋白(actb)的mrna表达。反应混合物含有10pmol/μl的每种pcr引物(表1；integrateddnatechnologiesinc.，coralville，ia，usa)，10μglightcycler480sybrgreen1master酶混合物和1μlcdna样品。pcr的条件如下：95℃5分钟的1个循环，随后在合适的pcr条件下70个循环。通过检测可以将荧光标记与背景区分开的循环数，使用二阶导数方法进行定量。使用lightcycler480软件版本1.5.0.39(rochediagnostics,mannheim,germany)分析结果。通过与来自相同样品的持家基因的18s核糖体rna比较来确定每个基因的mrna表达。
表1.特异性引物对的核苷酸序列适用于实时检测被测的基因和pcr反应的条件。
蛋白质分离和蛋白印迹(westernblotting)
除非另有说明，用于蛋白印迹的所有试剂均购自bio-radlaboratories，hercules，ca，usa。将组织样品在含有亮抑酶肽、抑肽酶、tritonx-100、tris-hcl、乙二醇-双(2-氨基乙基醚)、n，n，n'，n'-乙二胺四乙酸、naf、苯基甲基氟化磺酰和原钒酸na的缓冲液中细胞溶解(每种物质购自sigma-aldrichco.，st.louis，mo，usa)。使用bradford分析测定蛋白质浓度。在12.5％sds-page凝胶上在200v(～60ma，90分钟)分离50微克蛋白质。预染色的蛋白质混合物用作分子量标记物。分离的蛋白质转移到硝化纤维膜上。在含有5％脱脂奶粉的印迹溶液中抑制非特异性结合位点。用稀释到1:1000的、特异于大鼠裂解的半胱天冬酶-3(asp175)(cellsignalingtechnology,danvers,ma,usa)的单克隆抗体孵育膜。洗涤印迹并用稀释至1：4000的过氧化物酶缀合的山羊抗兔igg二抗(cellsignalingtechnology，danvers，ma，usa)孵育该印迹(1小时，室温)。通过ponceaus染色确认向凝胶加载相等蛋白质，并且也使用内部对照。使用增强的化学发光蛋白印迹检测方案(luminatatmfortewesternhrpsubstrate，millipore，billerica，ma，usa)可视化免疫反应条带。使用quantityone软件版本4.6.9分析条带。蛋白质丰度表示为与对照相比的积分光密度值(integratedopticaldwnsity,iod)/ponceaus。
细胞计微珠阵列(cytometricbeadarray)
用于cba的所有试剂和设备购自bdbiosciences(budapest，hungary)。根据厂家的方案，使用适当的大鼠cbaflexsets测量灌注的肾脏组织匀浆的ifnα、il-1的和il-10肽水平。使用facsverse流式细胞计进行测量，使用fcaparray软件分析数据。
统计分析
使用graphpadprism软件(graphpadsoftware,lajolla,ca,usa)分析数据。在用kolmogorov-smirnov检验测试正态性之后，使用用于两组比较的mann-whitneyu-检验且当当有3组或更多组时的kruskal-wallis检验分析来自所有实验的数值集和。小于0.05的p值被认为表明统计学上显著的差异。所有测量的值表示为平均数±sem。
自体移植之后组织评估的结果
在pas染色的肾切片上执行ktx后的组织学评估。在载体处理的大鼠(cp+t24tx)中观察到严重的小管损伤和小球损伤。肾小球坍缩，它们的结构受损并降解。在小管上皮细胞中观察到过多的坏死和固缩的核的标记。flu处理的肾脏(cp+t24txf)显示了更轻微的组织学损伤。肾小球是完整的，小管的核和血浆显示正常的染色。保留了小管刷状缘。类似地，在用flu灌注的(cpf)、但是在冷缺血2小时之后收获的(cp)肾脏中结构被更好地保留。通过测量管腔面积来定量小管损伤的程度。管腔的扩张由小管上皮细胞的降解引起，是小管损伤的良好指示剂。在flu处理的具有再灌注(cp+t24txf)或没有(cpf)再灌注肾脏中管腔较少扩张。
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