用于活细胞和非活细胞的实时感测的方法和系统的制作方法
【专利摘要】本文所提供用于识别细胞培养物中的活细胞和非活细胞的技术，其包括测量接近细胞培养物的至少一个谐振器的谐振阻抗谱响应，并且将测量响应与细胞培养物中的活细胞浓度和/或细胞培养物中的非活细胞浓度关联。
【专利说明】用于活细胞和非活细胞的实时感测的方法和系统
[0001 ] 背景
本文所公开的主题涉及细胞培养物中生长的细胞以及细胞培养物中的活细胞与非活细胞的实时区分。
[0002]通过生长产生所关注材料的单独细胞或有机体并且纯化来自细胞培养物的期望产物，生物系统的自我复制性质可用来产生这样的材料。例如，某些药物或化合物可通过细胞作为细胞的自然代谢产物或者经由工程细胞、例如设计成产生重组蛋白的细胞来产生。这些细胞可在大规模反应器中生长，以产生高质量生物药品。在这类反应器中，制造参数使用在线传感器和离线(即，没有在线，但是在实验室中，没有连接到反应器)分析系统来监测。关键制造参数的监测可在上游(在生物反应器之前)、在生物反应器中以及在下游(在生物反应器之后)执行。通常连续被监测的参数包括影响生长条件的参数，例如温度、溶液电导率、压力、PH、葡萄糖浓度、溶解氧和活细胞量，并且在一次性使用中以及在常规不锈钢制造系统两者中类似地监测。其它参数(例如细胞活性、乳酸盐、谷氨酸盐、同渗重摩、丙酮酸盐、氨基酸、产物纯度和微量元素)因使用现有传感器的测量的困难而通常不是在线测量的。而是通常通过从反应器提取样本并且在反应器外部使用实验室分析仪器进一步分析这些样本，“离线”测量这些参数。
[0003]发明简述
在一个实施方案中，提供一种用于分析细胞培养物反应的方法。该方法包括:采用传感器生成多个频率，所述传感器包括与细胞培养物反应流体操作接触的感测区和流体外部的多个调谐电路;从传感器接收信号，其中信号表示与细胞培养物反应流体操作接触的感测区在测量谱频率范围内的阻抗谱;分析阻抗谱；以及基于所分析的阻抗谱来确定细胞培养物反应流体的一个或多个性质。该方法包括:采用传感器(其包括至少一个谐振电路)来生成多个频率，其中传感器与细胞培养物反应流体操作接触;从传感器接收信号，其中信号表示细胞培养物反应在所测量的谱频率范围内的阻抗谱;分析阻抗谱的至少三个谱参数；以及基于谱参数将至少三个谱参数与细胞培养物反应中的活细胞和非活细胞的浓度关联。
[0004]在另一个实施方案中，提供一种用于以增强选择性来分析细胞培养物反应的方法。该方法包括:采用传感器生成多个频率，其中传感器与细胞培养物反应相接触，所述传感器包括与细胞培养物反应流体操作接触的感测区和细胞培养物反应流体外部的多个调谐电路，所述调谐电路在细胞培养物的谱β分散(spectral beta_dispers1n)的频率范围内提供谐振;从传感器接收信号，其中信号表示细胞培养物反应在所测量的谱频率范围内的谐振阻抗谱;分析谐振阻抗谱的至少六个谱参数；以及基于谱参数将谱参数的线性组合与细胞培养物反应中的活细胞和非活细胞的浓度关联。
[0005]在另一个实施方案中，提供一种用于分析细胞培养物反应的方法。该方法包括:采用包括感测区和细胞培养物反应流体外部的多个调谐电路的传感器生成多个频率，通过使用介电共形层或介电保护层(例如，在非限制性示例中为10纳米至10毫米厚)来保护所述感测区以免与被分析流体直接接触，所述调谐电路在细胞培养物的谱分散的频率范围内提供谐振，其中具有介电共形保护层的传感器与细胞培养物反应接触;从传感器接收信号，其中信号表示细胞培养物反应在所测量的谱频率范围内的谐振阻抗谱;分析谐振阻抗谱的至少六个谱参数；以及基于谱参数将谱参数的线性组合与细胞培养物反应中的活细胞和非活细胞的浓度关联。包括感测区和至少一个调谐电路的传感器形成谐振电路结构或谐振器。介电共形层与细胞培养物反应的流体和细胞培养物是生物相容的。还可评估其它参数，例如细胞活性、乳酸盐、谷氨酸盐、同渗重摩、丙酮酸盐、氨基酸、产物纯度和微量元素。例如，在抗体产生反应中，在降低的细胞生长的背景下，在增加的抗体产生期间发生增加的同渗重摩。
[0006]在另一个实施方案中，提供一种用于采用一次性使用传感器来分析一次性使用容器中的细胞培养物反应的方法。该方法包括使用已知校准标准来校准来自传感器制造批次的至少一个传感器，基于传感器制造的制造容差来建立制造批次中的传感器之间的校准传递关系，将校准系数记录到制造批次的各传感器的存储器中，将传感器集成到一次性使用容器中，对具有集成传感器的容器应用消毒步骤，操作容器以用于细胞培养物，并且使用集成传感器来监测细胞培养物反应中的活细胞和非活细胞的浓度。在其它实施方案中，传感器可以是多次使用的，并且还可根据其期望用途来调谐到一个或多个生长培养基。
[0007]在另一个实施方案中，提供一种用于分析细胞培养物反应的方法。该方法包括:提供包括至少一个谐振电路的传感器;将传感器暴露于细胞培养物反应;采用传感器所生成的至少一个谐振来探测细胞培养物反应;在传感器的所测量谱频率范围内确定传感器响应的至少一个谐振阻抗谱;将多变元统计分析应用于传感器响应的至少一个谐振阻抗谱，以得到多变元响应因子；以及将多变元响应因子与细胞培养物反应中的活细胞和非活细胞浓度关联。
[0008]在另一个实施方案中，提供一种用于分析细胞培养物反应的方法。该方法包括:提供包括至少一个谐振电路的传感器;将传感器暴露于细胞培养物反应;采用传感器所生成的至少一个谐振来探测细胞培养物反应;在传感器的所测量谱频率范围内确定传感器响应的至少一个谐振阻抗谱;将多变元统计分析应用于传感器响应的至少一个谐振阻抗谱，以得到多变元响应因子；以及将多变元响应因子与细胞培养物反应中的活细胞浓度、活细胞大小和非活细胞浓度关联。
[0009]在另一个实施方案中，提供一种系统，该系统包括:包括至少一个谐振电路和至少两个电极的传感器，其中传感器配置为生成表示在所测量的谱频率范围内的阻抗谱的信号。至少两个电极形成感测电极结构。感测电极结构可以是裸露的并且与细胞培养物反应流体直接接触，或者感测电极结构可共形地涂敷有介电保护涂层。包括感测区和至少一个调谐电路的传感器形成谐振电路结构。该系统还包括:存储用于活细胞和非活细胞的量化的传感器的校准系数的存储器和存储用于执行下列步骤的指令的存储器:从传感器接收信号;基于信号分析阻抗谱的两个或更多个谱参数;并且基于谱参数将两个或更多个谱参数与细胞培养物反应中的活细胞和非活细胞的浓度关联；以及配置为运行指令的处理器。
[0010]在另一个实施方案中，提供一种系统，该系统包括传感器，所述传感器包括至少一个感测区和在细胞培养物的谱分散的频率范围内提供至少三个谐振的多个调谐电路，其中传感器与细胞培养物反应接触。该系统还包括:存储用于执行下列步骤的指令的存储器:采用传感器来生成多个频率;从传感器接收信号，其中信号表示细胞培养物反应在所测量谱频率范围内的响应阻抗谱;分析谐振阻抗谱的至少六个谱参数;并且基于谱参数将谱参数的线性组合与细胞培养物反应中的活细胞和非活细胞的浓度关联；以及配置为运行指令的处理器。
[0011]在另一个实施方案中，提供一种系统，该系统包括:传感器，所述传感器包括至少一个感测区和多个调谐电路，所述感测区通过使用介电共形层(其与反应中的细胞生物相容)来保护以免与被分析流体直接接触，所述调谐电路在细胞培养物的谱分散的频率范围内提供至少三个响应;传感器读取器，读取跨预定谐振频率范围的传感器响应；以及处理器，用于分析谐振阻抗谱的至少六个谱参数，并且基于谱参数将谱参数的线性组合与细胞培养物反应中的活细胞和非活细胞的浓度关联。
[0012]在另一个实施方案中，提供一种用于分析细胞培养物反应的系统，该系统包括一次性使用传感器，所述传感器包括至少一个谐振电路和至少两个电极，其中传感器配置为生成表示在所测量的谱频率范围内的阻抗谱的信号。该系统还包括存储用于活细胞和非活细胞的量化的传感器的校准系数的存储器和存储用于执行下列步骤的指令的存储器:从传感器接收信号;基于信号来分析阻抗谱的两个或更多个谱参数;并且基于谱参数将两个或更多个谱参数与细胞培养物反应中的活细胞和非活细胞的浓度关联；以及配置为运行指令的处理器。
[0013]在另一个实施方案中，提供一种用于采用一次性使用传感器来分析一次性使用容器(例如烧瓶、微量滴定板等)中的细胞培养物反应的系统，其包括介电基材上具有感测区的谐振传感器组合件。该传感器组合件还包括操作上耦合到感测区的多个调谐元件，其中感测区耦合到多个调谐元件以定义多个谐振电路。该系统可用于药物筛选或毒性筛选应用中。
【附图说明】
[0014]通过参照附图阅读以下详细描述，将会更好地了解本发明的这些及其它特征、方面和优点，附图中，相似标号在附图中通篇表示相似部件，其中:
图1是按照本公开的一个实施方案、用于执行离线和在线测量的一般示意图；
图2是按照本公开的一个实施方案、用于确定细胞培养物中的活细胞和非活细胞的系统的框图；
图3是按照本公开的一个实施方案的谐振传感器的示意图；
图4是按照本公开的实施方案、采用配置用于使用多个频率的细胞培养物反应流体的在线感测的传感器组合件的示例传感器系统的一部分的示意图；
图5A是用于检测活细胞和非活细胞的传感器的感测区，其中感测区是具有2 mm的电极宽度以及电极之间的间距和2X1 cm的感测面积的叉指电极结构；
图5B是用于检测活细胞和非活细胞的传感器的感测区，其中感测区是具有0.45 mm的电极宽度以及电极之间的间距和2X1 cm的感测面积的叉指电极结构；
图5C是用于检测活细胞和非活细胞的传感器的感测区，其中感测区是具有0.30 mm的电极宽度以及电极之间的间距和2X1 cm的感测面积的叉指电极结构；
图6A是按照本公开的一个实施方案、用于检测活细胞和非活细胞的生物反应器-集成传感器的示例；
图6B是按照本公开的一个实施方案、用于检测活细胞和非活细胞的生物反应器-集成传感器的示例；
图6C是按照本公开的一个实施方案、用于检测活细胞和非活细胞的生物反应器-集成传感器的示例；
图6D是按照本公开的一个实施方案、用于检测活细胞和非活细胞的生物反应器-集成传感器的示例；
图7是按照本公开的一个实施方案的细胞培养物中的活细胞和非活细胞的在线测定方法的流程图；
图8示出在五个不同谐振频率的传感器操作的图表的示例，其中具有在两个最高谐振频率的传感器操作的图表的插图；
图9是按照本发明技术的实施方案，谐振传感器的一个实施方案的测量阻抗参数的图表；
图1OA是采用线性垂直轴的常规和谐振阻抗检测的比较的图表；
图1OB是采用对数垂直轴的常规和谐振阻抗检测的比较的图表；
图11是细胞培养物的离线分析的图表；
图12是按照本公开的一实施方案、图11的细胞培养物的在线分析的图表；
图13A示出在传感器暴露于四个溶液并且执行常规阻抗测量时的PCl与PC2的PCA得分图表；
图13B示出在传感器暴露于四个溶液并且执行谐振阻抗测量时的PCl与PC2的PCA得分图表；
图14A显示用于使用常规阻抗来测量四个溶液的各因子(主成分)的估算信号:噪声的图表；
图14B显示用于使用谐振阻抗来测量四个溶液的各因子(主成分)的估算信号:噪声的图表；
图15示出当溶液性质的变化使用常规阻抗(两条虚线)和使用采用四个谐振器的谐振阻抗(每个谐振器两条实线)来测量时，随时间的溶液动态测量结果；
图16A示出如采用常规阻抗所测量、在使用具有叉指电极结构(其中电极宽度以及电极之间的间距为0.45 mm,没有介电保护涂层)的传感器来测量四个溶液时的PCl相对PC2的PCA得分图表；
图16B示出如采用常规阻抗所测量、在使用具有叉指电极结构(其中电极宽度以及电极之间的间距为0.45 mm，具有0.25微米厚的介电保护涂层)的传感器来测量四个溶液时的PCl相对PC2的PCA得分图表；
图16C示出如采用常规阻抗所测量、在使用具有叉指电极结构(其中电极宽度以及电极之间的间距为0.45 mm，具有0.5微米厚的介电保护涂层)的传感器来测量四个溶液时的PCl相对PC2的PCA得分图表；
图16D示出如采用谐振阻抗所测量、在使用具有叉指电极结构(其中电极宽度以及电极之间的间距为0.45 mm,没有介电保护涂层)的传感器来测量四个溶液时的PCl相对PC2的PCA得分图表；
图16E示出如采用谐振阻抗所测量、在使用具有叉指电极结构(其中电极宽度以及电极之间的间距为0.45 mm，具有0.25微米厚的介电保护涂层)的传感器来测量四个溶液时的PCl相对PC2的PCA得分图表；
图16F示出如采用谐振阻抗所测量、在使用具有叉指电极结构(其中电极宽度以及电极之间的间距为0.45 mm，具有0.5微米厚的介电保护涂层)的传感器来测量四个溶液时的PCl相对PC2的PCA得分图表；
图17A示出如采用常规阻抗所测量、在使用具有叉指电极结构(其中电极宽度以及电极之间的间距为0.3 mm，没有介电保护涂层)的传感器来测量四个溶液时的PCl相对PC2的PCA得分图表；
图17B示出如采用常规阻抗所测量、在使用具有叉指电极结构(其中电极宽度以及电极之间的间距为0.3 mm，具有0.25微米厚的介电保护涂层)的传感器来测量四个溶液时的PCl相对PC2的PCA得分图表；
图17C示出如采用常规阻抗所测量、在使用具有叉指电极结构(其中电极宽度以及电极之间的间距为0.3 mm，具有0.5微米厚的介电保护涂层)的传感器来测量四个溶液时的PCl相对PC2的PCA得分图表；
图17D示出如采用谐振阻抗所测量、在使用具有叉指电极结构(其中电极宽度以及电极之间的间距为0.3 mm，没有介电保护涂层)的传感器来测量四个溶液时的PCl相对PC2的PCA得分图表；
图17E示出如采用谐振阻抗所测量、在使用具有叉指电极结构(其中电极宽度以及电极之间的间距为0.3 mm，具有0.25微米厚的介电保护涂层)的传感器来测量四个溶液时的PCl相对PC2的PCA得分图表；以及
图17F示出如采用谐振阻抗所测量、在使用具有叉指电极结构(其中电极宽度以及电极之间的间距为0.3 mm，具有0.5微米厚的介电保护涂层)的传感器来测量四个溶液时的PCl相对PC2的PCA得分图表。
[0015]详述
本发明感测技术促进在细胞培养物中直接使用传感器对活细胞和非活细胞的同时独立和实时的测定。在无需生物反应器的周期取样的情况下使用在线传感器对生物反应器中的活细胞和非活细胞两者的实时识别和量化对生物制药过程操作是有益的。当前，评估参数，例如细胞量，采用细胞量传感器来执行，其提供仅与活细胞有关的信息，而没有提供与细胞培养物中的活细胞以及非活细胞的群体和浓度有关的附加信息。此外，将增加的功能性与在线传感器相集成提供用于取样的反应容器的增加无菌度和减少开启的有益效果。如图1所示，当执行从反应容器(生物反应器)的取样时，样本进一步传递给独立传感器供离线分析。离线分析因周期取样而具有反应容器污染的风险。离线分析还要求从反应容器中移出一定流体体积以供离线分析。与离线分析的这些问题不同，在线分析没有这些局限性，消除因周期取样引起的培养物污染的风险，并且促进增加无菌度。
[0016]活细胞的浓度(又称作细胞生物量)的常规测量依靠在给定频率的电容测量，或者依靠扫描介电谱或扫描射频谱。活细胞具有完整质膜，并且促成细胞的β分散频率范围的细胞培养物相对电容率的变化。相比之下，非活细胞具有泄漏性膜，其没有促成细胞的β分散频率范围的细胞培养物相对电容率的变化，并且因而没有产生电容信号的变化。
[0017]用于评估活细胞浓度的一种技术是电容或相对电容率的变化。相对电容率从考虑传感器的电极的物理常数的电容测量来计算。另一种技术是电感介电谱，其中电极组装为环形线圈，并且通过液体相互分隔。环形线圈的几何参数是线圈内径和外径、线圈厚度和线圈-线圈分隔距离。样本的介电性质的测量的又一种技术涉及谐振器方法。但是，这类技术无法量化活细胞和非活细胞的浓度。当活细胞的浓度达到饱和时，细胞培养物的体电导率甚至在活细胞的恒定浓度也取决于许多发酵因素。
[0018]本文所提供的是用于培养物中的活细胞和非活细胞的识别和量化的技术，其包括:测量接近细胞培养物的至少一个谐振器的谐振阻抗谱响应，并且将第一测量谐振阻抗传感器响应与细胞培养物中的活细胞的浓度关联；以及将第二测量传感器谐振阻抗响应与细胞培养物中的非活细胞的浓度关联。
[0019]所公开的实施方案可用于任何规模的细胞培养物中的活细胞和非活细胞的同时原位独立测定。细胞培养物反应可表示经历形成细胞培养物过程的流体，使得如所公开的传感器可与经历反应过程的流体接触。细胞培养物可在工业或实验室规模反应器中，或者备选地可在小规模反应器或者微量滴定孔板中发生。细胞培养物流体可包括培养基(例如，包含诸如氨基酸、葡萄糖、盐等的适当营养源的液体或凝胶)和细胞。细胞培养物流体可与不同细胞的发酵相关。细胞发酵的非限制性示例包括动物细胞、哺乳动物细胞、植物细胞、细菌、酵母、真菌。发酵按分批或者按连续模式来执行。按照本发明技术，得到与活细胞和非活细胞的浓度有关的信息，而不干扰发酵过程并且不获取样本供细胞的离线分析。例如，实施方案可与包括生物反应器、至少一个谐振传感器、传感器读取器和数据处理器的系统结合使用。为此，图2示出用于评估细胞的系统10，其包括生物反应器12和在线谐振传感器14。谐振传感器14可设置在生物反应器12之中或之上，或者可耦合到与生物反应器12流体连通的在线医药导管或连接器。在具体实施方案中，谐振传感器14配置成提供生物反应器中的细胞生长的连续或间歇监测。生物反应器12可以是促进细胞生长的任何适当细胞培养物反应容器。例如，生物反应器可以是大规模或小规模反应器、袋式反应器、釜式反应器等。
[0020]谐振传感器14配置成经由至少一个谐振器或谐振电路的谐振阻抗谱响应来检测样本的化学、物理或生物参数。如与简单谐振阻抗测量相反，所公开的实施方案使用将要采用至少一个谐振电路来探测的样本。接近样本的传感器(与细胞培养物反应流体操作接触的传感器)的谐振阻抗谱基于样本组成变化。测量谐振阻抗值Z’(其为阻抗的实部ZreWPZ"(其为阻抗的虚部Zim)反映细胞培养物样本(例如，接近传感器14的细胞培养物的部分)对谐振电路的电场激励的响应。电场可由传感器14经由电极(其可与样本直接或间接电接触)来施加。例如，谐振传感器可以是感测区和调谐电路的组合。感测区是裸露的或者涂敷有保护介电层(例如，如图3的实施方案所示)。在这两种情况下，感测区可被认为与细胞培养物流体“操作接触”。在这类实施方案中，调谐电路没有与细胞培养物流体操作接触。与样本的间接电接触是当感测电极结构共形地涂敷有介电保护涂层时并且当电极之间所生成的电场在穿透介电保护涂层之后与细胞培养物反应流体相互作用时。
[0021 ] 谐振传感器14可如授予Potyrai 1等人并且于2012年12月28日所提交的的美国专利申请号13/729800和13/729851所公开来配置，通过引用将其完整地结合到本文中以用于全部目的。在一个实施方案中，谐振传感器14可以是一次性使用传感器，其在反应或过程的全部或部分期间使用。例如，在单一反应中，谐振传感器14可开始与细胞培养物操作接触，并且因此不适合用于其它反应中。此外，谐振传感器14可与特定反应器关联，并且可按照维护计划来清洁和消毒或更换。例如，谐振传感器14可包括一个或多个电极对和一个或多个调谐元件，例如电阻器、电容器、电感器、谐振器、阻抗变压器或者它们的组合，以形成在至少一个谐振频率工作的电感器-电容器-电阻器(LCR)谐振电路。在某些实施方案中，谐振传感器14的多个谐振电路的不同谐振电路可配置成在不同频率下谐振。
[0022]不同谐振电路可配置成采用多个频率来探测生物反应器12中的生长细胞。此外，不同频率可用来探测在不同深度的流体样本，从而允许用于粘附或悬浮细胞培养物系统中。在某些实施方案中，集成电路存储器芯片可电流耦合到谐振传感器14。集成电路存储器芯片可包含不同类型的信息。集成电路芯片的存储器中的这种信息的非限制性示例包括传感器的校准系数、传感器批号、生产日期、最终用户信息。在另一个实施方案中，谐振传感器14是叉指结构，其是谐振器的一部分，并且具有用于检测培养物中的细胞的感测区。回到图2，来自谐振传感器14的数据可经由数据获取电路16来获取，数据获取电路16可与传感器14关联或者可与控制系统(例如包括数据处理电路的监视器或工作站22，其中可执行附加处理和分析)关联。数据获取电路16能够处于如图2所示的生物反应器12中，或者能够处于工作站22中。此外，工作站22能够采用整个生物过程工厂(图2中未示出)的控制系统来替代，其中谐振传感器14及其数据获取电路16连接到整个生物过程工厂的控制系统。数据获取电路16可采取传感器读取器的形式，其可配置成与生物反应器12和/或工作站22无线通信。例如，传感器读取器可以是电池操作的装置。
[0023]另外，数据获取电路16可接收一个或多个谐振传感器14的数据(例如，按照阵列形成的多个传感器或者定位在生物反应器12之中或周围的不同位置的多个传感器)。数据可存储在短期或长期存储装置中(例如存档通信系统，其可位于系统10中或者远离系统10，和/或被重构并且例如在操作员工作站22为操作员显示)。本发明技术的传感器和传感器系统的定位和安装的非限制性示例包括生物反应器、微量滴定板的单独孔、连接器、流通组件以及任何其它相关生物过程组件。
[0024]除了显示数据之外，操作员工作站22还可控制系统10的上述操作和功能。操作员工作站22可包括一个或多个基于处理器的组件，例如通用或专用计算机24。除了基于处理器的组件之外，计算机24还可包括各种存储器和/或存储组件，其包括磁和光大容量存储装置、内部存储器(例如RAM芯片)。存储器和/或存储组件可用于存储执行本文所述技术的程序和例程，其由操作员工作站22或者由系统10的关联组件来运行。备选地，程序和例程可存储在远离操作员工作站22、但是通过网络和/或存在于计算机24的通信接口可访问的计算机可访问存储装置和/或存储器上。计算机24还可包括各种输入/输出(I/O)接口以及各种网络或通信接口。各种I/O接口可允许与诸如显示器26、键盘28、鼠标30和打印机32之类的用户接口装置(其可用于查看和输入配置信息和/或用于操作成像系统10)进行通信。各种网络和通信接口可允许到局域、广域内联网和存储网络以及因特网的连接。各种I/O和通信接口可适当地或者根据需要利用导线、线路或者适当的无线接口。
[0025]图3示出谐振传感器14的设计的非限制性示例。传感器的感测电极结构34连接到调谐电路(参见图4)和数据获取电路16。感测电极结构34可以是裸露的，并且与细胞培养物反应流体直接接触。感测电极结构可共形地涂敷有介电保护涂层36。没有或具有共形介电保护涂层36的感测电极结构34形成感测区38。没有或具有共形介电保护涂层36的感测电极结构34 (其形成感测区38)与细胞培养物反应流体操作接触。感测电极与细胞培养物反应流体的“操作接触”可涉及感测电极结构34没有(裸露)或者具有共形介电保护涂层36的实施方案。
[0026]当感测电极结构34为裸露时，在电极之间所生成的电场与细胞培养物反应流体直接相互作用。当感测电极结构共形地涂敷有介电保护涂层36时，电极之间所生成的电场在穿透介电保护涂层36之后与细胞培养物反应流体相互作用。
[0027]图4示出采用配置成使用多个频率来探测流体样本(例如细胞培养物反应流体)的传感器组合件40的谐振传感器系统的一部分。谐振传感器组合件40包括谐振传感器14。传感器包括单个感测区38。感测区38可设置在基材上。在一些实施方案中，传感器14的基材可以是介电基材。基材可以是微量滴定板。在这个实施方案中，电极可沉积在微量滴定板上。微量滴定板的孔是开口样本容器或开口流道的非限制性示例。
[0028]在某些实施方案中，传感器组合件40还包括多个调谐元件42。多个调谐元件可在操作上耦合到单个感测区38，以定义多个谐振电路。调谐元件42连同单个感测区38—起可定义多个谐振电路。多个谐振电路的各谐振电路可包括多个调谐元件中的一个或多个调谐元件。
[0029]在所示实施方案中，多个调谐元件42是传感器14外部的。但是，在一个实施方案中，调谐元件42可设置在传感器14的基材上。在另一个实施方案中，多个调谐元件42中的一些可以是传感器基材外部的，而其它调谐元件42可设置在基材上。调谐元件42可包括电阻器、电容器、电感器、谐振器、阻抗变压器或者它们的组合。
[0030]各谐振电路可配置成在特定频率谐振。至少一个谐振电路可配置成在与其它谐振电路的谐振频率不同的频率谐振。作为举例，如果感测区38包括一对电极，则调谐元件42可以是电阻器、电容器和电感器，以形成电感器-电容器-电阻器(LCR)谐振电路。调谐元件42可以电耦合到感测区38。在一个实施方案中，调谐元件42可与感测区38并联连接。在某些实施方案中，多个谐振电路中的不同谐振电路可配置成在不同频率谐振。不同谐振电路可配置成以多个谐振频率来探测流体样本。不同的谐振频率可用来在细胞培养物的谱分散的频率范围内探测流体样本。采用本公开的传感器来监测的细胞培养物的谱分散是在从0.1 Hz至100 GHz的频率范围内，并且包括α、β、γ和δ谱分散。
[0031]在所示实施方案中，传感器组合件10还可包括多路复用器44。多路复用器44可配置成促进多个调谐元件42之间的电子切换。多路复用器44可配置成选择与探测频率关联的一个或多个信号，将所选信号转发到输出装置或读取器。在一个实施方案中，多路复用器44可配置成有选择地将信号发送给输出装置或读取器。多路复用器44可配置成将多个信号同时发送给传感器读取器。
[0032]图5Α、图5Β和图5C示出电极设计的非限制性示例。这些电极是具有相等电极宽度以及电极之间的间距(间隙)的叉指(交指)电极结构，其中电极之间的间距沿不同方向可以是相同或不同的，正如本领域众所周知。图5Α示出用于检测活细胞和非活细胞的传感器的感测区，其中感测区是具有2 mm的电极宽度以及电极之间的间距和2X1 cm的感测面积的叉指二电极结构。图5B示出用于检测活细胞和非活细胞的传感器的感测区，其中感测区是具有0.45 mm的电极宽度以及电极之间的间距和2X I cm的感测面积的叉指二电极结构。图5C示出用于检测活细胞和非活细胞的传感器的感测区，其中感测区是具有0.3 _的电极宽度以及电极之间的间距和2X1 cm的感测面积的叉指二电极结构。
[0033]能够使用的叉指电极的其它已知示例包括具有可变电极宽度和电极之间的间距的电极结构、锥形电极、圆电极和本领域已知的其它电极。所提供的传感器可具有至少两个电极，但是也可具有四个电极或者更多电极。
[0034]谐振传感器14定位成与细胞培养物反应流体操作接触。生成多个频率的至少一个传感器经由至少一个软管宝塔接头孔口(hose barb port)或者任何其它安装装置来插入或安装到非刚性的柔性容器上，使得传感器无菌地保持在容器的内空间中，并且与容器中的流体操作接触。传感器14还通过直接电连接或远程手段来连接到非刚性的柔性容器外部的读取器装置。在一个实施方案中，非刚性的柔性容器是生物反应器。在另一个实施方案中，生物反应器是刚性的非柔性容器。
[0035]图6A-D示出用于检测活细胞和非活细胞的生物反应器-集成传感器的示例。在图6A所示的一个实施方案中，谐振传感器14组装到插入件中。谐振传感器与插入件的组合件使用软管宝塔接头孔口进一步集成到生物反应器中。这个传感器的感测区合乎需要地延伸到生物反应器中至少10毫米。
[0036]在图6B所示的另一个实施方案中，谐振传感器组装到插入件中。谐振传感器与插入件的组合件使用软管宝塔接头孔口进一步集成到生物反应器中。这个传感器的感测区合乎需要地延伸到生物反应器中最多2毫米。
[0037]在图6C所示的另一个实施方案中，谐振传感器组装到插入件中。谐振传感器与插入件的组合件是贴片组合件。这个传感器的感测区合乎需要地延伸到生物反应器中至少10毫米。
[0038]在图6D所示的另一个实施方案中，谐振传感器组装到插入件中。谐振传感器与插入件的组合件是贴片组合件。这个传感器的感测区合乎需要地延伸到生物反应器中最多2毫米。在另一个实施方案中，谐振传感器组装到插入件中以形成贴片，其中贴片具有其直径与其厚度的至少10: 1、在一个实施方案中至少20:1以及在另一个实施方案中至少50:1的比率。在授予Potyrailo等人的美国专利8508368 “Disposable sensing device havingrad1 frequency based sensor”中公开了传感器集成到生物反应器中的一些附加非限制性示例，通过引用将其完整地结合到本文中以用于全部目的。
[0039]在所公开实施方案的任一个中，传感器信号按照适当方式从传感器传递出去。例如，在一种方式中，传感器信号经由有线链路来传递给传感器读取器，然后经由有线链路或无线链路来传递给工作站。在另一种方式中，传感器信号经由有线链路或无线链路来传递给传感器读取器，并且然后经由有线链路或无线链路来传递给工作站。“无线链路”可表示使用从大约30 kHz至300 GHz的射频范围中的无线电波经由电感耦合、电容耦合或电磁耦合来传递模拟或数字信号。
[0040]图7是用于细胞培养物中的活细胞和非活细胞的同时独立确定和量化的方法50的流程图50。在步骤52，传感器14测量耦合到细胞培养物(例如与生物反应器12关联)的至少一个谐振器的谐振阻抗谱响应。谐振器是包括感测区和至少一个调谐电路的传感器，其形成谐振电路结构或谐振器。因此，耦合到细胞培养物的谐振器是感测区与细胞培养物反应流体操作接触的谐振电路结构。
[0041 ]在步骤54，方法50执行所测量阻抗谱响应的特征选择以及在步骤56执行所选特征的分析。阻抗谱响应可包括细胞培养物流体中的细胞的α、β、γ和δ谱分散。基于该分析，传感器响应与非活细胞的浓度(步骤58)和活细胞(步骤60)的浓度关联。方法50可配置成还提供与活细胞的大小有关的信息。与活细胞的大小有关的信息对不同应用、例如在用于疫苗的蛋白质生产中是重要的。
[0042]方法50可配置成向下游装置或者系统10的操作员提供输出。例如，基于方法50的结果，系统10可向最终用户提供细胞总数、活细胞的数量或百分比、非活细胞的数量或百分比、非活细胞与活细胞的比率的视觉指示或读数、活细胞和非活细胞对时间的图表或者它们的任何组合。
[0043]在另一个实施方案中，方法50的结果可用来控制生物反应器12中的反应条件。例如，如果非活细胞的数量高于预定阈值，则方法50还可包括用于触发报警的步骤。在其它实施方案中，如果细胞的总数和活细胞的数量均高于阈值，则系统10可配置成提供用于采集细胞培养物反应的指令。此外，结果可用来控制反应条件(例如改变气体和/或进料混合物、温度、其它条件)，以利于非活细胞与活细胞的期望比率。
[0044]具体来说，从谐振传感器所获取的信号可包括来自各谐振电路的传感器的谐振阻抗响应谱(例如，如果传感器14仅包括或操作单个电路，则所产生信号包括一个谱)。多个这类阻抗响应谱可通过多个谐振电路来生成。在一个实施方案中，活细胞可呈现特性谐振响应，其可基于可包括细胞培养物流体中细胞的α、β、γ和δ谱分散的阻抗谱响应来与非活细胞的谐振响应区分开。相应地，对于特性模式的所获取的(一个或多个)阻抗谱可与细胞的特定百分比活性相对非活性关联。
[0045]图8示出包括感测区和多个调谐电路(其在细胞培养物的谱分散的频率范围内提供五个谐振)的传感器的操作。在非限制性示例中，单个感测区的五个谐振通过传感器的电子电路(其具有100、10、1、0.1和0.01 mH的五个调谐电感器值)来提供。这些电感器值提供单个感测区在图8所示的频率范围内的谐振。
[0046]如图9所示，在一个实施方案中，系统10可配置成测量传感器的谐振阻抗2(f)(通过式(I)所表示)。
[0047]Z (f) = Zre(f) + j Zim(f)式(I)
其中zre(f)是谐振阻抗的实部，以及Zim(f)是谐振阻抗的虚部。在某些实施方案中，传感器的阻抗响应可以是多变量响应，因为多于一个频率可用来测量跨传感器谐振的传感器响应。在某些实施方案中，传感器的阻抗响应可以是多变量响应，因为多于一个频率可用来测量传感器的谐振峰以外的传感器响应。在一些实施方案中，在跨传感器谐振的多个频率下测量传感器响应。例如，如果传感器在大约I MHz谐振，则从大约0.25 MHz至大约2 MHz测量所测量频率和关联传感器响应。这个多变量响应通过多变元分析来分析。传感器的多变量响应包括传感器的完全阻抗谱和/或数个单独测量的性质，非限制性地例如FpZhFuFhF2、ZjPZ2。图9示出按照本发明技术的实施方案，谐振传感器的一个实施方案的测量阻抗参数的图表。这些和其它测量性质是“谱参数”。这些性质包括阻抗的实部的最大值的频率(Fp，谐振峰位置)、阻抗的实部的幅值(ZP，峰高度)、零电抗频率(Fz，阻抗的虚部为零的频率)、阻抗的虚部的谐振频率(F1)以及阻抗的虚部的反谐振频率(F2)、在阻抗的虚部的谐振频率(F1)的信号幅值(Z1)和在阻抗的虚部的反谐振频率(F2)的信号幅值(Z2)。其它参数可使用整个阻抗谱、例如谐振的质量因子、相位角和阻抗幅值来测量。在标题为“Methods andsystems for calibrat1n of RFID sensors” 的美国专利N0.7911345中描述了多变量响应谱参数，通过引用将其完整地结合到本文中以用于全部目的。
[0048]通过使用全谱的多变元分析和/或?α)谱的计算参数，执行活细胞和非活细胞的浓度的量化。还通过使用全谱的多变元分析和/或?α)谱的计算参数，执行活细胞的大小的确定以及活细胞和非活细胞的浓度的量化。
[0049]图1OA和图1OB是培养物中的细胞的变化浓度的在线测量期间的常规和谐振阻抗检测的比较的图表。在这些测量的过程中，按快速序列收集常规和谐振阻抗谱。谐振阻抗谱使用四个不同电感器1_4(其分别提供范围从最小频率到最大频率响应的传感器谐振)来生成。在这个实验的时间内，收集许多谱。在图1OA和图1OB中，选择五个时间点以示出培养物中的细胞的变化浓度的监测期间的常规和谐振阻抗谱的谱特征。为了清楚起见，仅对阻抗的实部Ζ’(或Zre3)示出结果。图1OA采用线性垂直轴来示出数据，而图1OB采用对数垂直轴来示出数据，以用于更好地示出谐振器3和4的响应。来自常规阻抗检测的谱标记为L0。来自使用电感器1-4的谐振阻抗检测的谱标记为L1、L2、L3和L4。五个响应谱的单独编组L0、L1、L2、L3和L4在培养物中的细胞的浓度增加时表明其谱强度(或阻抗)的增加。
[0050]谐振阻抗检测提供细胞培养物中的测量的增强信号多样性和灵敏度。首先，谐振响应L1、L2、L3和L4的信号变化(表示为数据曲线)相对于常规阻抗数据LO曲线在任何特定频率更为显著。其次，谐振响应在曲线中更为多样化，如谐振L1、L2、L3和L4的形状变化所不O
[0051]图11示出典型细胞培养物试验中的细胞生长的离线分析的结果。这个细胞培养物试验中的细胞是哺乳动物细胞。离线分析使用NucleoCounter NC-100来执行，并且用作用于评估所开发的在线传感器的参考数据。通过细胞培养物的周期取样并且执行活细胞的浓度、非活细胞的浓度、细胞的总数(活细胞和非活细胞之和)和细胞的百分比存活率(作为活细胞与细胞总数的比率乘以100%)的测量，来执行离线分析。谐振传感器还直接定位在该细胞培养物中，并且采用该传感器来执行在线测量。图12示出如采用谐振传感器所收集的细胞生长的在线分析的结果。活细胞的浓度、非活细胞的浓度、细胞的总数和细胞的百分比活性的量化使用众所周知的谱分析的偏最小二乘(PLS)技术来执行。PLS通过查找仪器响应的多维空间中说明独立变量的最大方差的方向，来确定独立变量与仪器响应之间的相关性。离线测量(图11)和在线测量(图12)结果的比较说明离线和在线仪器所进行的测量(例如活细胞的浓度、非活细胞的浓度、细胞的总数和细胞的百分比活性的测量)之间的期望相关性。
[0052]在过去，PLS成功地用于来自用于采用扫描介电谱监测细胞培养物的生物质的在线传感器的数据的多变元分析。但是，使用早期报导的传感器以及数据的单变元和多变元分析，仅定量地确定活细胞的浓度。然而，使用早期报导的传感器以及数据的单变元和多变元分析，没有定量地确定非活细胞的浓度。只有定性信息有可能使用早期报导的传感器和数据的多变元分析来得到，因为所收集的谱数据仅具有最多两个多变量因子。当扫描介电谱数据拟合到测量培养物的电容变化时，仅量化活细胞，而没有量化非活细胞的能力。与那些早期结果形成对照，按照本发明技术的传感器和数据的多变元分析不仅提供活细胞而且还提供非活细胞的定量信息。
[0053]在一个实施方案中，谐振传感器14可基于离线参数的分析或者对具有活细胞的已知百分比的生物反应器12的暴露，基于对没有细胞的细胞培养介质的暴露，和基于对具有活细胞的已知浓度的细胞培养介质的暴露来校准。测量一个或多个传感器14的响应，并且建立环境参数与传感器响应之间的分析关系。分析拟合系数可使用多变元校准来计算。在多变元校准中，将传感器响应的多于一个性质与关注的环境参数的值关联。多变元校准将全阻抗谱用于校准，或者利用单独测量参数(Zp、Fp、Fz、Fl、F2、Zl、Z2)中的至少两个，或者能够从传感器14的谐振电路的响应来提取的任何其它参数中的至少两个。这些额外参数的非限制性示例是谐振的质量因子、相位角和谐振电路响应传感器14的阻抗的幅值。多变量分析工具的非限制性示例是规范相关性分析、回归分析、非线性回归分析、主成分分析、区别函数分析、多维定标、线性区别分析、对数回归、模式匹配和/或神经网络分析。多变元校准可使用来自常规阻抗测量的谱、使用来自谐振阻抗测量的谱和/或其组合来执行。来自谐振阻抗测量的谱可包括全部所利用的谐振器响应或者只有这些响应的子集。
[0054]常规和谐振阻抗测量通过测量具有不同溶液电导率和介电常数的模型溶液中的传感器响应来比较。这类测量提供定量比较在常规阻抗测量模式和谐振阻抗模式的传感器响应的机会。对于这些测量，制备四种模型溶液，各具有200 mL的容积，以用于测试传感器响应。溶液I具有电导率为2 mS/cm的200 mL的水。溶液2具有电导率为15 mS/cm的200 mL的水。溶液3具有电导率为2 mS/cm的180 mL的水和20 mL的乙醇。溶液4具有电导率为15 mS/cm的180 mL的水和20 mL的乙醇。室温(20 °C )下的纯水和纯乙醇的介电常数分别为80.1和24.5。水/乙醇混合物的介电常数分别具有变化的介电常数。因此，这四种模型溶液提供测试传感器对溶液电导率和介电常数的变化的响应的能力。全部阻抗测量在1000 Hz至10000000 Hz的范围内进行。四种溶液中的传感器响应的常规阻抗和谐振阻抗谱的实部和虚部使用众所周知的多变元分析工具(例如主成分分析(PCA))进一步处理，以确定这些谱之间的相似性和差异。多变元分析使用与Matlab软件(The Mathworks Inc.，Natick，MA)配合操作的通用PLS_Toolbox软件(Eigenvector Research, Inc.,Wenatchee，WA)来执行。PCA模式识别方法说明作为称作主成分(PC)或因子的原始变量的加权和的数据的方差。在过去，PCA成功地用于来自用于采用扫描介电谱监测细胞培养物的生物质的在线传感器的数据的多变元分析，其中从所测量谱仅观测到两个PC。
[0055]图13A和图13B分别示出在传感器暴露于四个溶液并且执行常规和谐振阻抗测量时的PCl相对PC2的PCA得分图表。图13A和图13B示出对四种溶液的传感器响应的四个集群。集群标记为1、2、3和4，对应于所测量溶液。各集群具有两个数据点，其是一式两份的谱测量结果(n=2)。
[0056]图13A表明，使用常规阻抗的四种溶液的测量给出低与高电导率的溶液之间的良好辨别能力(溶液I和2与溶液3和4之间的辨别)。另外，当溶液的电导率低(溶液I和3)时，观测到不同介电常数之间的良好辨别能力。然而，当溶液的电导率高(溶液2和4)时，不同介电常数之间的辨别显著下降。与其它集群相比，集群2和4中的数据点在PCA图表中更为靠近。相比之下，使用谐振阻抗的四种溶液的测量给出全部四种溶液之间的良好辨别能力，如图13B所示。对全部测量的谐振峰执行谐振阻抗的谱分析。重要的是，当溶液具有低介电常数(溶液I和3)和高介电常数(溶液2和4)时，如通过相应集群1、2、3和4(图13B)之间的大距离所证明，具有不同介电常数的溶液之间的辨别质量是相似的。
[0057]来自常规和谐振阻抗测量的多变元数据中的重要因子(主成分)的数量使用与Matlab软件(The Mathworks Inc.，Natick，MA)配合操作的PLS_Toolbox软件(EigenvectorResearch, Inc.,Wenatchee，WA)中的通用算法进一步确定。这个通用算法基于其信号:噪声来提供所测量数据的重要PCA因子的数量的估算，并且显示各主成分(因子)的信号:噪声的估算的图表。PC的2或以下的信号:噪声已知为通过噪声来主导，而PC的高于3的信号:噪声是可接受的。描述数据所需的因子的数量是信号:噪声为3或以上的本征向量的数量。
[0058]图14A显示用于使用常规阻抗来测量溶液1-4的各因子(主成分)的信号:噪声的估算的图表。这个图表表明，只有前三个因子(主成分)具有对可靠的多变元分析和量化可接受的3或以上的信号:噪声，。
[0059]图14B显示用于使用谐振阻抗来测量溶液1-4的各因子(主成分)的信号:噪声的估算的图表。这个图表表明，前五个因子(主成分)具有对可靠的多变元分析和量化可接受的3或以上的信号:噪声。此外，附加因子(主成分)、例如PC6和PC7也可用于多变元分析和量化，因为其信号:噪声为3。
[0060]因此，来自使用常规阻抗(图14A)和谐振阻抗(图14B)所执行的测量的不同PC的信号:噪声的比较表明与常规阻抗测量相比的谐振阻抗测量的多变元响应的更高维度。与具有多变量响应的较低维度的传感器相比，传感器的多变量响应的更高维度与传感器的更高选择性以及更有选择地确定影响传感器的较大数量的独立环境条件的传感器能力相关。
[0061]在过去，PCA成功地用于来自用于采用扫描介电谱监测细胞培养物的生物量的在线传感器的数据的多变元分析，其中从所测量谱仅观测到两个PC。与那些早期结果不同，传感器可具有可用于使用按照所公开实施方案的传感器所收集的频谱数据的多变量分析的三个(图14A)和甚至高达七个(图14B)PC。
[0062]活细胞和非活细胞的检测也可通过使用传感器的等效电路模型来描述，其包括细胞电阻和电容、双层电阻和电容、溶液体电阻以及初始传感器电阻、电容和电感。等效电路的组件的准确值关于电极结构的设计和感测区上分隔传感器电极以免与溶液直接接触的保护层的存在及类型而变化。等效电路通过分析表达式来描述，其包括传感器的至少一个谐振阻抗谱的实部和虚部的项。所导出的分析表达式中的项与总细胞浓度并且与活细胞浓度关联。所导出的分析表达式中的项能够与在0.1 Hz至100 GHz的频率范围内的细胞培养物谱分散相关，并且可包括α、β、γ和δ谱分散。
[0063]本公开中已经证明了谐振阻抗测量的高检测灵敏度。与常规阻抗测量的检测灵敏度相比时，取决于用于感测的谐振器，取得45 - 74倍的灵敏度增强。图15示出当溶液性质的变化使用常规阻抗(两条虚线)和使用采用四个谐振器的谐振阻抗(每个谐振器两条虚线)来测量时随时间的溶液动态测量的结果。比起常规阻抗，使用谐振阻抗的测量灵敏度的增强计算为使用特定谐振器所测量的响应之间的阻抗响应Zre差除以在与谐振器相同频率范围下使用常规阻抗所测量的响应之间的差。例如，以最小谐振频率来操作的谐振器在实验时间内具有范围从58000欧姆至12500欧姆的Zre响应，而使用常规阻抗所测量的Zre响应在相同实验时间内处于从1800至800欧姆的范围中。因此，比起常规阻抗测量，谐振阻抗的灵敏度的增强计算为(58000 - 12500)/(1800 - 800) = 45。对其它谐振器2、3和4，谐振阻抗比起常规阻抗测量类似计算的灵敏度增强分别为62、74和46倍。因此，谐振阻抗测量的使用提供在细胞的β分散频率范围的范围内测量灵敏度的极显著增强。谐振阻抗测量的使用还可提供在α、β、γ和料普分散范围内测量灵敏度的显著增强。这个实验中使用的传感器是涂敷有介电保护层的叉指电极结构。电极结构的非限制性示例包括二和四电极结构。叉指电极结构的非限制性示例包括二和四电极结构。用于电极的材料的非限制性示例包括不锈钢、铂、金、贵金属等。介电保护层的材料的非限制性示例包括二氧化硅、氮化硅、聚对二甲苯、硅酮、氟化聚合物、陶瓷等。电极的制造方法的非限制性示例包括金属蚀刻和基于掩模的金属沉积。基材上的制造电极的厚度处于从1纳米至100微米的范围中。
[0064]进一步评估感测电极和关联保护层的适当几何结构的重要性。叉指电极结构的两个几何结构作为I X 2 cm结构来制造。电极的这些几何结构在图5B和图5C中示出。在这两种类型的结构中，电极宽度与电极之间的间距相同，并且为0.45 mn^P0.30 mm。不同厚度的聚对二甲苯涂层涂敷到电极上。涂层厚度为O微米(没有涂层)、0.25微米和0.5微米。对于这些测量，制备四种模型溶液，各具有200 mL的容积，以用于测试传感器响应。溶液I具有电导率为2 mS/cm的200 mL的水。溶液2具有电导率为15 mS/cm的200 mL的水。溶液3具有电导率为2 mS/cm的180 mL的水和20 mL的乙醇。溶液4具有电导率为15 mS/cm的180 mL的水和20 mL的乙醇。常规阻抗和谐振阻抗的测量使用这些传感器来执行。谱使用PCA来分析。
[0065]图16A-F概括如采用常规阻抗(图16A、B、C)和采用谐振阻抗(图16D、E、F)所测量的叉指电极结构的结果，所述电极结构具有0.45 mm的电极宽度和电极之间的间距。这些叉指电极结构具有0、0.25和0.5微米的三个聚对二甲苯涂层厚度。图16A、图16D示出O微米的聚对二甲苯涂层厚度(没有涂层)的结果。图16B、图16E示出0.25微米的聚对二甲苯涂层厚度的结果。图16C、图16F示出0.5微米的聚对二甲苯涂层厚度的结果。
[0066]类似地，图17A-F概括如采用常规阻抗(图17 A、B、C)和采用谐振阻抗(图17D、E、F)所测量的叉指电极结构的结果，所述电极结构具有0.3 mm的电极宽度和电极之间的间距。这些叉指电极结构具有O、0.25和0.5微米的三个聚对二甲苯涂层厚度。图17A、图17D示出O微米的聚对二甲苯涂层厚度(没有涂层)的结果。图17B、图17E示出0.25微米的聚对二甲苯涂层厚度的结果。图17C、图17F示出0.5微米的聚对二甲苯涂层厚度的结果。
[0067]图16A-F和图17A-F示出施加保护涂层提高与所测量溶液的不同介电常数和电导率相关的谱响应集群之间的分隔。
[0068]所公开实施方案的技术效果包括用于评估细胞培养物中的细胞活性的在线和实时技术。这类技术促进活细胞与非活细胞之间的区分，这提供比起生物质类型传感器(其没有区分活细胞和非活细胞)的有益效果。
[0069]本书面描述使用包括最佳模式的示例，并且还使本领域的技术人员能够实现的实施方案，包括制作和使用任何装置或系统，以及执行任何结合方法。可专利范围由权利要求来限定，并且可包括本领域的技术人员想到的其它示例。如果这样的其它示例具有与权利要求的文字语言无差异的结构要素，或者如果它们包括具有与权利要求的文字语言的非实质差异的等效结构要素，则它们意在落入权利要求的范围之内。
【主权项】
1.一种用于分析细胞培养物反应流体的方法，包括下列步骤: 采用包括与所述细胞培养物反应流体操作接触的感测区和所述流体外部的多个调谐电路的传感器来生成多个频率； 从所述传感器接收信号，其中所述信号表示与所述细胞培养物反应流体操作接触的所述感测区在测量谱频率范围内的阻抗谱； 分析所述阻抗谱；以及 基于所分析的阻抗谱来确定所述细胞培养物反应流体的一个或多个性质。2.如权利要求1所述的方法，其中，所述阻抗谱包括谐振阻抗谱。3.如权利要求1所述的方法，其中，所述调谐电路包括电感器。4.如权利要求1所述的方法，其中，所述多个频率生成在所述细胞培养物反应的谱β分散的频率范围内的阻抗响应。5.如权利要求1所述的方法，其中，所述多个频率生成在所述细胞培养物反应的谱α、β、T和/或δ分散的频率范围内的阻抗响应。6.如权利要求1所述的方法，其中，所述多个频率生成在所述细胞培养物反应的谱β分散的频率范围内的谐振响应。7.如权利要求1所述的方法，其中，所述多个频率包括在所述细胞培养物反应的谱β分散的频率范围内的至少三个频率。8.如权利要求1所述的方法，其中，所述感测区与所述细胞培养物反应流体直接接触。9.如权利要求1所述的方法，其中，所述感测区通过介电保护层与所述细胞培养物反应分隔。10.如权利要求1所述的方法，其中，所述介电保护层具有从10纳米至10毫米的厚度。11.如权利要求1所述的方法，其中，分析所述阻抗谱包括分析每个阻抗谱的至少六个谱参数。12.如权利要求1所述的方法，其中，分析所述阻抗谱包括分析每个阻抗谱的至少六个谱参数，包括谐振参数Fp、Zp、Fl、Zl、F2、Ζ2。13.如权利要求1所述的方法，其中，分析所述阻抗谱包括分析至少所述阻抗的实部和/或所述阻抗的虚部。14.如权利要求1所述的方法，其中，分析所述阻抗谱的步骤还包括确定所测量阻抗谱的谱参数的线性组合的步骤。15.如权利要求1所述的方法，其中，分析所述阻抗谱的步骤还包括将所述阻抗谱与所述等效电路模型拟合的步骤。16.如权利要求1所述的方法，其中，确定所述细胞培养物反应的性质的步骤还包括确定所述细胞培养物反应中的活细胞的浓度和非活细胞的浓度的步骤。17.如权利要求1所述的方法，其中，确定所述细胞培养物反应的性质的步骤还包括确定所述细胞培养物反应中的活细胞的浓度、非活细胞的浓度和活细胞的直径的步骤。18.如权利要求1所述的方法，其中，确定所述细胞培养物反应的性质的步骤还包括确定在测量活细胞的浓度和非活细胞的浓度中的细胞培养物生产率的步骤。19.一种系统，所述系统包括: 传感器，所述传感器包括: 介电基材； 至少一个感测区；以及 在细胞培养物反应的分析的频率范围内的多个调谐电路，其中所述传感器配置成与至少一个多个细胞培养基类型相容；以及 读取器，配置成跨所述分析频率范围从所述传感器接收信号；以及 处理电路，配置成执行下列步骤: 分析所述传感器的阻抗谱；以及 基于所分析的阻抗谱来确定所述细胞培养物反应的一个或多个性质。20.如权利要求19所述的系统，其中，所述系统量化非活细胞的浓度和活细胞的浓度。21.如权利要求19所述的系统，其中，所述系统量化非活细胞的浓度、活细胞的浓度和活细胞的大小。22.如权利要求19所述的系统，其中，所述读取器配置成与控制所述细胞培养物反应的生物过程控制系统无线通信。23.如权利要求19所述的系统，其中，所述感测区经由生物相容介电共形层来保护以免与所述细胞培养物反应直接接触。24.如权利要求19所述的系统，其中，所述传感器经由安装装置来插入或安装到非刚性容器，使得所述传感器无菌地保持在所述容器的内空间中并且与所述容器中的流体操作接触。25.如权利要求19所述的系统，其中，所述安装装置包括软管宝塔接头孔口。
【文档编号】G01N27/02GK105849539SQ201480071660
【公开日】2016年8月10日
【申请日】2014年12月19日
【发明人】R.A.波特赖洛, V.E.科特罗, T.沃特莱, J.A.迪伊林格, T.J.埃登伯格
【申请人】通用电气公司