用快速分离测定相互作用动力学的方法

用快速分离测定相互作用动力学的方法
【专利摘要】本发明涉及一种测定分析物相互作用动力学的方法。所述方法包括首先将包含分析物的溶液与固定的配体，或其类似物接触，所述配体或其类似物固定在光学传感器表面上；检测分析物与固定的配体或类似物的结合，其中测量所述结合作为表面特性的结果变化；和自动测定相互作用动力学，所述测定步骤包括首先定义包括用于拟合的动力学信息的分解期的部分。本发明进一步涉及研究分子相互作用的分析系统，所述系统能够实施该新方法，以及实施所述方法的步骤的计算机程序产品。
【专利说明】用快速分离测定相互作用动力学的方法 发明领域
[0001] 本发明涉及一种测定分析物的相互作用动力学的方法。更特别地，本发明涉及一 种自动测定相互作用动力学的方法，其包括首先定义包括动力学信息的分解期的部分。本 发明还涉及一种实施所述方法的步骤的分析系统和计算机程序产品。
[0002] 发明背景
[0003] 多种分析技术被用于表征分子间的相互作用，特别在针对生物分子的检测和相互 作用的分析的背景中。例如，抗体-抗原相互作用在许多领域具有根本的重要性，包括生物 学、免疫学和药理学。在这种背景下，许多分析技术涉及"配体"，例如抗体，结合到固体支撑 体上，随后让配体接触"分析物"，如抗原。在配体和分析物接触之后，测量一些指示相互作 用的特征，例如配体与分析物结合的能力。经常期望在测量相互作用之后，应该有可能分离 (dissociate)配体-分析物对以"重新产生"自由配体，借此能够重新使用配体的表面以进 行进一步的分析测量。
[0004] 能够实时监测这样的分子相互作用的分析传感器系统正获得越来越多的关注。这 些系统通常基于光学生物传感器并且通常被称为相互作用分析传感器或生物特异性相互 作用分析传感器。典型的生物传感器系统是通用电气医疗集团生命科学部(GE Healthcare Life Sciences)售出的Biacore?设备，其使用表面等离子共振(SPR)检测样品中分子间的 相互作用和固定在感应表面上的分子结构。使用Biacore?系统在不使用标记的情况下有可 能实时测定不只是样品中特定分子的存在和浓度，而且还有额外的相互作用参数，例如，分 子相互作用的结合(association)速率和分离速率常数。装置和理论背景全部在文献(见例 如Jonsson，U.等，BioTechniques 11:620-627(1991))中记载。根本上，该技术涉及将配体 固定在传感器芯片的特定表面上，将传感器芯片与包含感兴趣的分析物的样品流接触，和 然后测量产生于感兴趣的结合的传感器芯片的表面光学特征的变化。对于SPR的进一步的 细节，还参考美国专利号5,313,264、美国专利号5,573,956和美国专利号5,641，640。
[0005] 往往在SPR分析中，产生动力学数据集，其中分离数据收集时间相对于相互作用物 (即配体和分析物）的分离是过多的。过多的数据不包含任何动力学信息，但是可以干扰拟 合过程，使得动力学速率常数无法测定或不那么准确。如果该拟合被限定于包括传感图的 部分的信息，该失败在许多情况下可以被避免。这在Biacore?系统的BIAeval软件中被容易 地实现，其中对于每个数据集合，拟合范围由操作者手动设置。然而对于实施全自动动力学 评价的需求，手动过程是不相容的。
[0006] 因此，需要实现识别和清除过多的数据的自动化过程，由此能够对配体和分析物 之间的相互作用进行全自动动力学评价。
[0007] 发明概述
[0008] 本文公开的是使用将从拟合中自动排除过多数据的算法补充拟合过程的新方法。 所述方法和算法自动地从拟合过程中排除分解期的部分，其跟随完全的分离回到基线。该 方法提高了快速相互作用动力学的拟合成功率，并且进一步促进采用许多数据集的大动力 学运行（big kinetic runs) 〇
[0009] 由此，本发明的第一方面是提供了测定分析物与固定于固体支撑体表面的结合剂 的相互作用动力学的方法，即通过将所述表面与含有分析物的流体样品接触，监测所述分 析物与固定的配体或类似物的结合，其中测量结合作为表面的特性的结果变化;和自动测 定相互作用动力学，所述测定步骤包括首先定义包括用于拟合的动力学信息的分解期的部 分。在某些实施方案中，所述测定步骤进一步包括对于偏移、干扰或单偏离曲线的调整。
[0010] 在某些实施方案中，配体或它的类似物，被固定到一系列表面上并且所述分析物 与各表面平行接触。
[0011] 在某些实施方案中，所述分析物以一系列浓度提供，并且相互作用动力学从系列 分析物和表面固定的配体或类似物之间的相互作用计算。
[0012] 在某些实施方案中，光学传感器表面是基于瞬逝波感应的检测器的一部分。优选 地，所述光学传感器表面是基于表面等离子共振的检测器的一部分。
[0013] 在某些实施方案中，所述定义包括用于拟合的动力学信息的分解期的部分的方法 通过排除小于以下的响应数据来完成：
[0014] R = Y^/X
[0015] 其中R是响应，以RU计，低于它时算法将分解期数据从拟合中排除
[0016] Y高是在各曲线上的分解期期间的相对于基线的最高响应
[0017] X是在软件程序中编码的或由用户设置的任意数集。
[0018] 在其它实施方案中，所述定义包括用于拟合的动力学信息的分解期的部分的方法 通过排除小于R=〇(基线）的响应数据来完成。
[0019] 在进一步的其它实施方案中，所述定义包括用于拟合的动力学信息的分解期的部 分的方法通过排除小于R=X的响应数据来完成(X是用户在程序中设置或编码的数值）。
[0020] 在另一方面，本发明提供了研究分子相互作用的分析系统，其包括包含实施所述 方法的步骤的程序编码方法的计算机处理装置(coumputer processing means)。
[0021] 在仍另一方面，本发明提供了计算机程序产品，其包括存储在计算机可读介质上 或携带在电子或光学信号上的用来实施所述方法的步骤的程序编码方法。
[0022] 本发明的进一步的细节和益处将从以下的说明书和权利要求书中显现出来。
[0023]附图的简要说明
[0024]图1(a)上方面板:数据集在运行方法中使用整个分解期集合以1:1-结合模型拟 合。(b)下方面板:拟合仅用包括的分解期的相关部分重复。
[0025]图2(a)上方面板:在1400秒内收集的完整的数据集；（b)中部面板:显示了（a)的数 据集，但是其限于在应用算法时用于拟合的部分；（c)下方面板:在1400秒内缓慢分离的数 据集。
[0026] 发明详述
[0027] 本发明涉及测定分析物的相互作用动力学的新方法，以及实施所述方法的步骤的 分析系统和计算机程序产品。由此，在一个方面，本发明涉及测定分析物相互作用动力学的 方法，包括：
[0028] (a)将含有所述分析物的溶液与固定的配体或其类似物接触，其固定在光学传感 器表面上；
[0029] (b)监测溶液中的所述分析物和所述固定的配体或类似物的结合，其中测量结合 作为表面的特性的结果变化;和
[0030] (C)自动测定相互作用动力学，所述测定步骤包括首先定义包括用于拟合的动力 学信息的分解期的部分。
[0031] 表面结合相互作用可以使用多种不同相互作用分析技术来表征。商业可获得的生 物传感器包括以上提到的Biacore?系统设备，其基于表面等离子共振(SPR)并允许实时监 测表面相互作用。
[0032] SPR现象是公知的。当光在某些条件下在具有不同折射率的两者介质之间的界面 上被反射，并且所述界面被金属膜(通常为金或银)涂层时，产生SPR。在Biacore?设备中，介 质为样品和通过微流动系统与所述样品接触的传感器芯片的玻璃。金属膜为芯片表面上的 金的薄层。SPR引起反射光在特定的反射角度上的强度的减少。该最小反射光密度的角度随 着接近反射光相反侧，在Biaeore?系统中样品侧，的表面的折射率而变化。
[0033] 当样品中的分子结合传感器芯片表面的捕获分子时，浓度，由此的表面的折射率 发生改变并且检测到SPR响应。将相互作用过程期间的响应相对于时间作图，这将提供相互 作用进程的定量测量。这样的图通常称为传感图。在Biacore?系统中，SPR响应值用共振单 位(RU)表示。一个RU表示最小反射光强度的角的0.00001°的变化，其对于多数蛋白质来说 大约等于传感器表面的大约lpg/mm 2的浓度变化。当包含分析物的样品接触传感器表面时， 结合到传感器表面上的捕获分子(配体)与分析物在称为"结合"的步骤中相互作用。当开始 时让样品接触传感器表面时，该步骤在传感图中通过RU的增加标示。相反地，当样品流被例 如，缓冲液流替换时，"分离"通常发生。当分析物从表面结合的配体分离时，该步骤在传感 图中通过RU随时间的下降标示。
[0034] 图1中提供了传感器芯片表面处的六种不同分析物浓度的可逆相互作用的典型的 传感图集合(结合曲线），所述传感表面具有固定的分子(配体），例如抗体，其与样品中的分 析物相互作用。垂直轴(y轴)表示响应值(这里以共振单位，RU计），且水平轴(X轴)表示时间 (这里以秒，s计）。开始时，缓冲液经过传感表面，给出传感图的基线响应。在样品注入期间， 由于分析物的结合，观察到信号的增加。该部分结合曲线通常称为"结合期"。最后，达到稳 定态条件，此时共振信号处于平稳状态。在样品注入的末期，样品被缓冲液的连续流代替并 且信号的下降反映了分析物从表面的分离或释放。该部分结合曲线通常称为"分解期"。结 合/分离曲线的形状提供了关于相互作用动力学的有价值的信息，并且共振信号的高度表 示表面浓度(即，相互作用得到的响应与表面上的物质浓度的改变相关）。
[0035] 存在多种对于动力学评价的有用模型。最简单的是1:1结合模型。其它模型包括例 如，1:1分离模型、二价分析物模型、异质分析物模型、异质配体模型、二态反应模型和具有 质量转移的1:1模型。参见例如Biacore T200软件手册28-9768-78版AA。本发明的实施方案 适用于所有的动力学模型。
[0036] 对于1:1结合模型，假定存在分析物A和表面结合(固定)的捕获分子B之间（一级动 力学)的可逆相互作用(其不是受质量转移限制的）：
[0037]
[0038] 在分析物注入期间A的表面浓度的变化率为
[0039]
[0040] 其中Γ为结合分析物的浓度，rmax为表面的最大结合容量，kass为结合速率常数， kdiss为分离速率常数，且C为主体分析物浓度(bulk analyte consentration)。方程经重排 得到：
[0041]
[0042] 如果所有的浓度询以相同的单份测量，方程可以重新写为：
[0043]
[0044] 其中R为响应，以RU计。以积分形式的方程为：
[0045]
[0046] 分离速率可以表示为：
[0047]
[0048]
[0049]
[0050] 亲合力由结合平衡常数KA=kass/kdissS分离平衡常数KD = kdiss/Kass表示。
[0051] 对于使用质量转移的1:1结合模型（其被用于更新版本的软件)来说，整个抑制剂 浓度系列数据集的曲线拟合(全局拟合(globalfit))可以使用方程系统的数值计算来进 行：
[0052] A[0]=0
[0053] dA/dt = kt*(Conc-A)-(ka*A*B_kd*AB)
[0054] 其中A为传感器表面的分析物浓度，
[0055] B为固定的相互作用物和
[0056] Conc是注入的分析物浓度
[0057] [0] =Rmax
[0058] dB/dt = -(ka*A*B_kd*AB)
[0059] ΑΒ[0]=0
[0060] dAB/t = (ka*a*B_kd*AB)
[0061] 总响应：
[0062] AB+RI
[0063] 其中RI为样品和运行的缓冲液之间的折射率错配。
[0064] 对于分子相互作用动力学测定的更详细的说明，可以参考例如KarIsson，R.和 FSlt5A(IggT)Journal of Immunological Methods，200,121-133。也参见Nordin等，（2005) Analytical Biochemistry,340,359-368〇
[0065] 一旦生成了速率方程，需要确定与实验数据最匹配(fit)的速率方程中的参数值。 这通常称为曲线拟合。一种用于曲线拟合的方法依赖于Marquardt-Levenberg算法，其通过 将残差平方和(the sum of squared residual)最小化来优化参数值。残差为计算曲线和 实验曲线在各点上的差，使用残差平方，以便高于或低于实验曲线的偏差被平等地加权：
[0066]
[0067]其中S为残差平方和 [0068] ；Tf为给定点的拟合值 [0069] rx为相同点的实验值 [0070]并且η为数据点的数量
[0071] 拟合的近似倌通过卡方的统计学值来描述：
[0072]
[0073] 兵甲打73钳疋点的似贫值 [0074] rx为相同点的实验值 [0075] η为数据点的数量 [0076]并且ρ为拟合参数的数量
[0077] 对于传感图数据，数据点的数量远远大于模型中的拟合参数的数量，因此
[0078] η-ρ * η
[0079] 并且卡方减小到每个数据点的平均残差平方。
[0080] 如果模型准确地拟合实验数据，卡方表示信号噪声的均方（因为这是来自拟合的 曲线的唯一的偏差）。
[0081] 如以上讨论的，当相同运行中将具有一个或几个相互作用对的动力学与未知相互 作用动力学一起运行时，需要设置接触时间和分离时间以适应预期最慢的相互作用物，并 且这些时间在整个运行中保持类似。对于具有快速分离的数据集，这意味着在完全分离之 后，当响应已经回到基线时数据仍然作为分离数据被记录(图la)。当将1:1相互作用模型拟 合至这样的数据集时，整个分解期被通常用于拟合，这意味着非动力学部分将对拟合具有 同动力学部分一样多的影响。这有时引起算法找到没有拟合到曲线的动力学形状的chi 2最 小值，即动力学测定错误（图la，将彩色数据曲线与黑色拟合曲线进行比较）。然而，当被用 于拟合的分离部分被手动限定到动力学部分(在该情况下240秒），算法找到曲线的形状(图 lb，将彩色数据曲线与黑色拟合曲线进行比较）。动力学速率常数现在被确定。这归因于不 相关的和干扰的数据不支配chi2的计算。
[0082] 在一种实施方案中，加入算法以定义包含动力学信息的分解期的部分。对于如图2 (a)所示的数据集来说，用于拟合的标准算法会将整个分解期用于拟合(例如400-1400S)。 在一种本发明的实施中，用于拟合的部分通过以下算法划定：
[0083] R = YS/X
[0084] 其中R为响应，以RU计，在低于其时算法将分离期数据从拟合中排除
[0085] Y高是在每个曲线上的分解期期间的相对于基线的最高响应
[0086] X可以为程序软件中编码的或由使用者设定任意数集。因此，当x = 20,具有小于最 高响应5 %的R的数据将在拟合期间被排除。在设定合适的X数值时应小心。当数值太高时， 如果曲线中存在偏移，结果可被影响；当数值太低时，有用的数据会被疏忽地排除。
[0087]对于数据集内的每条曲线，仅包括被算法确定的部分的信息被用于拟合(图2(b)， 假定x = 20)。算法不会影响具有缓慢分离的数据集，这是有益的（图2(c))。
[0088] 在另一实施中，用于拟合的部分通过更简单的算法划定，例如R = 0(基线)或R = x (程序软件编码的或由用户设定的任意数）。这些更简单的算法的任一种都不影响具有缓慢 分离的数据集，这是有益的，但是它们可能对噪音或偏移数据不那么有效。
[0089] 任选地，在某些应用中，也会考虑偏移、干扰和单偏离曲线等。
[0090] 该方法简化并使得动力学数据的动力学评价更简单，且提高了包含许多动力学数 据集的大运行的动力学评估。
[0091 ]在本实施方案的变型中，当分离完成时，可以执行类似的算法以使得受控制的软 件停止产生数据。或者，可以执行类似的算法以使得评估软件去除数据的干扰部分。
[0092] 尽管以上说明一定程度上关于；Biacore?:系统作出，但应理解的是本发明可以与用 于在固体支撑体表面检测结合相互作用的多种其它技术结合使用，包括例如依赖于标记的 那些，如放射性标记、发色团、焚光团、散射光的标志物、电化学活性标志物(例如，基于电势 测定法的电场作用晶体管）、电场活性标志物(电刺激发射）、磁活性标志物、热活性标志物、 化学发光部分或过渡金属，以及所谓的无标记检测系统。然而实时检测系统是优选的，特别 是那些基于化学传感器或生物传感器技术的那些。
[0093] 生物传感器被广泛地定义为使用用于分子识别组分(例如带有固定的抗体的层） 的设备，其既可以与固态物理化学转换器直接结合，也可以和可移动的载体小珠/颗粒一起 与转换器结合。虽然这样的传感器通常基于检测例如固定层的厚度或折射率、质量变化的 无标记技术，但也存在依赖于某种标记的传感器。典型的传感器检测技术包括，但是不限于 质量检测方法，例如光学、热 -光学和压电或声波(包括例如表面声波(SAW)和石英晶体微量 天平(QCM))方法、和电化学方法，例如电势测定、电导测定、安培测定和电容/阻抗法。关于 光学检测方法，典型方法包括检测质量表面浓度的那些，例如反射-光学法，包括外或内反 射法，其可以为角度，波长，偏振或相位解析的，例如瞬逝波椭圆偏光法和瞬逝波光谱法 (EWS，或Internal Reflection Spectroscopy)，两者均可以包括经由表面等离子共振 (SPR)的瞬逝场增强，Brewster角折射法，临界角折射法，受抑全反射(FTR)，散射全内反射 (STIR)，其可以包括散射增强标记，光波导传感器;外反射成像，基于瞬逝波的成像例如临 界角解析成像，Brewster角解析成像，SPR角解析成像等。另外，光度测定和成像/显微术方 法，其"自身"或与反射方法组合，基于例如表面增强拉曼光谱法(SERS)，表面增强共振拉曼 光谱(SERRS)、瞬逝波荧光(TIRF)和磷光可以被提及，以及波导干涉仪，波导漏模光谱法，反 射干涉光谱法，透射干涉法、全息照相光谱法和原子力显微术(AFR)。
[0094]目前商业可获得的，特别地（inter alia)，为基于SPR的生物传感器系统。示例性 的所述SPR生物传感器包括上面提及的Biacore?设备。Biacore?设备和SPR现象的技术方面 的详细讨论可以在美国专利号5,313,264中找到。关于生物传感器传感表面的基质涂层的 更详细的信息在例如美国专利号5,242,828和5,436，161中给出。另外与放&(；01^设备联用 的生物传感器芯片的技术方面的详细讨论可以在美国专利号5,492,840中找到。上述提及 的美国专利的全部公开内容通过引用并入本文中。
[0095]可以多次方便地在流动池 (flow cel 1)内实施本发明的方法，所述流动池例如在 上述的Biacore?设备中使用的类型的流动池。可以用于本发明的其它流动池对于本领域技 术人员来说也是公知的，不需要在本文中描述。
[0096]应注意的是本文中使用的术语"固体支撑体"应广义理解，并且其意在包括任何固 体(弹性的或刚性的）基底，在其上可以固定一种或多种结合剂，并且其间的分子相互作用 通过选定的特定检测系统检测。基底可以为生物的、非生物的，有机的，无机的，或它们的组 合，并且形式可以呈颗粒、线、沉积物、凝胶、片、管、球、容器、毛细管、垫、薄片、膜、盘、载玻 片等，其具有任何合宜形状，包括圆盘、球、环等。基底表面可以具有任何二维配置并且可以 包括例如台阶（steps)、脊(ridges)、结(kinks)、台地(terraces)等，并且可以是与其余基 底的材料不同的材料的层的表面。
[0097]虽然已经描述和展示了本发明的具体实施方案，对于本领域技术人员来说会明显 的是在不偏离本发明的教导的前提下可以做出改变和修饰。前面的说明书和附图提及的物 质通过说明的方式提供但并非作为限制。当基于现有技术从其正确的角度上审视时，本发 明的实质范围意图由所附的权利要求书来界定。
【主权项】
1. 一种测定分析物的相互作用动力学的方法，所述方法包括 a) 将含有所述分析物的溶液与固定的配体或其类似物接触，所述配体或其类似物固定 在光学传感器表面上； b) 监测所述溶液中的所述分析物与所述固定的配体或类似物的结合，其中测量所述结 合作为所述表面的特性的结果变化;和 c) 自动测定所述相互作用动力学，所述测定步骤包括首先定义包括用于拟合的动力学 信息的分解期的部分。2. 根据权利要求1的方法，其中所述配体或其类似物被固定在一系列表面上。3. 根据权利要求1的方法，其中所述光学传感器表面是基于瞬逝波传感的检测器的一 部分。4. 根据权利要求1的方法，其中所述瞬逝波传感基于表面等离子共振。5. 根据权利要求1的方法，其中定义包括用于拟合的动力学信息的分解期的部分通过 排除小于以下的响应数据来完成： R=Y高/x 其中R是响应，以RU计，低于它时所述算法将所述分解期数据从拟合中排除 Y高是在各曲线上的所述分解期期间的相对于基线的最高响应 X是在所述软件程序中编码的或由用户设置的任意数集。6. 根据权利要求5的方法，其中X是20。7. 根据权利要求1的方法，其中定义包括用于拟合的动力学信息的所述分解期的部分 通过排除小于R=〇(基线）的响应数据来完成。8. 根据权利要求1的方法，其中定义包括用于拟合的动力学信息的所述分解期的部分 通过排除小于R = x(x是在软件程序中编码的或由用户设置的任意数值）的响应数据来完 成。9. 根据权利要求1的方法，其中所述测定步骤进一步包括对于偏移、干扰或单偏离曲线 的调整。10. -种用于研究分子相互作用的分析系统，所述系统包括包含实施权利要求1的方法 的步骤的程序编码方法的计算机处理设备。11. 一种计算机程序产品，其包括存储在计算机可读介质上或携带在电子或光学信号 中的用来实施权利要求1的方法的步骤的程序编码方法。
【文档编号】G01N21/552GK105849529SQ201480063097
【公开日】2016年8月10日
【申请日】2014年11月12日
【发明人】O·卡尔森
【申请人】通用电气健康护理生物科学股份公司