本发明涉及一种环烯醚萜苷在制备农药的应用，属生物农药技术领域。
背景技术：
植物源农药越来越受到人们的关注，现已成为绿色生物源农药的首选。与传统化学合成农药相比具有明显的优势：(1)一般植物源农药在环境中较易降解；(2)具有靶标专一性，使用后对人畜和非靶标生物相对安全；(3)活性成分较多、作用方式独特，害虫难以产生抗药性；(4)某些植物源农药的作用方式是非毒杀性的，方式包括引诱、驱避、拒食、绝育、调节生长发育等，比化学合成农药的作用方式更为广泛。
栀子为茜草科(rubiaccae)植物栀子的干燥成熟果实，又名山栀、黄栀子、白蟾，果实呈椭圆形或长椭圆形，呈红黄色或深红色，是一种常绿灌木。其主产于江西、湖南、湖北、福建、浙江、安徽、四川、贵州等地。其中江西是我国最大的栀子产地，占全国产量的60％。栀子是常用中药材，以果实供药用，具有泻火除烦、清热利湿、凉血解毒等功能。主治热病心烦、肝火目赤、湿热黄疸、小便黄短、尿血、黄疸型肝炎、胆囊炎、肾炎、热毒疮疡等症；外用治扭伤引起的淤血肿痛。栀子也是化工、食品工业的重要原料，栀子色素是天然染料和食品色素。环烯醚萜(iridoid)类成分为栀子属植物的特征性成分。栀子环烯醚苷类占栀子果实的3％–7％，主要富集于种仁中。国内外研究表明，栀子环烯醚萜苷是栀子的主要疗效成分。
肖启明等采用半叶枯斑法和烟草病害分级标准，对抗tmv的活性植物进行筛选，发现栀子粗提取物的综合防治效果较好，有进一步开发和利用的前景。王有年等采用活性跟踪法，对生栀子中的杀螨活性成分进行研究，发现京尼平苷对朱砂叶螨具有触杀活性，lc50值为2.69mg/ml。
以植物源活性成分为先导化合物，通过构效关系研究进行高效杀虫活性成分的筛选和创制近年来已受到极大地关注。该发明制备得到的环烯醚萜苷可作为新型植物源农药进行开发，通过构效关系研究创制环境友好的高活性农药新品种。
技术实现要素：
本发明的目的是，为了从栀子中提取的特征成分环烯醚萜苷作为农药，应用于农作物的病虫害防治，提出一种环烯醚萜苷在制备农药的应用。
实现本发明的技术方案如下，一种环烯醚萜苷在制备农药的应用，所述环烯醚萜苷具有抗植物病毒活性，其100％的活性成份用于制备抗植物病毒剂及杀虫剂农药。
所述环烯醚萜苷的抗植物病毒活性，能够抑制烟草花叶病毒、水稻病毒、辣椒病毒、番茄病毒、甘薯病毒、马铃薯病毒和瓜类病毒及玉米矮花叶病毒，可有效防治烟草、水稻、辣椒、番茄、瓜菜、粮食、蔬菜、豆类多种作物的病毒病，可作为新型植物源抗病毒剂进行开发。
所述环烯醚萜苷对粘虫、棉铃虫、玉米螟、蚜虫、成螨、小菜蛾和尖音库蚊表现出活性，特别是对小菜蛾表现出很好的活性，能作为新型的植物源杀虫剂。
所述环烯醚萜苷可作为抗植物病毒剂及杀虫剂活性先导化合物，通过构效关系创制环境友好的高活性农药新品种。
所述环烯醚萜苷的提取方法按以下步骤进行：
(1)浸泡干燥栀子果实经过高速粉碎机粉碎后，过20目筛，加入甲醇或乙醇，搅拌下浸泡72h，过滤，滤液旋干得栀子粗提物；
(2)粗分，用x-5、d101或hpd-100型大孔吸附树脂分离环烯醚萜类化合物和栀子黄色素；
(3)制备单体化合物，多次硅胶柱层析，重结晶及制备高效色谱进一步分离环烯醚萜苷类化合物。
所述环烯醚萜苷包括京尼平苷、京尼平龙胆二糖苷、羟异栀子苷和去乙酰车叶草苷酸甲酯。
本发明的有益效果是，本发明以干燥栀子果实为原料，粉碎后，甲醇或乙醇浸泡提取栀子粗提物。大孔吸附树脂粗分环烯醚萜类化合物和栀子黄色素，将得到的环烯醚萜苷混合物进行多次硅胶柱层析，重结晶及制备高效色谱进一步分离环烯醚萜苷单体化合物，包括京尼平苷，京尼平龙胆二糖苷，羟异栀子苷，去乙酰车叶草苷酸甲酯。本发明对得到的四个提取化合物进行抗植物病毒活性和杀虫活性测试，普筛浓度下对烟草花叶病毒，粘虫、棉铃虫、玉米螟、蚜虫、成螨、小菜蛾和尖音库蚊表现出活性，特别是所有化合物均对小菜蛾表现出很好的活性，可作为新型植物源农药进行开发。
具体实施方式
实施例1
本实施例从栀子果实中提取环烯醚萜苷制备农药的方法如下：
将栀子果实粉末150g，用1200ml甲醇浸泡72h，期间不断搅拌。抽滤，滤液旋干的栀子粗提物浸膏33.7g。粗提物用大孔吸附树脂分离，水和乙醇作为洗脱剂，共得到五个组分(1-5)。组分2用硅胶柱层析分离得到四个组分(组分2.1-组分2.4)。合并组分3和组分2.1，重结晶得到京尼平苷。组分2.4也重结晶得到京尼平龙胆二糖苷。组分2.3进一步用硅胶柱层析分离得到三个组分(组分2.3.1-组分2.3.3)。组分2.3.3再次用硅胶柱层析分离得到三个组分(组分2.3.3.1-组分2.3.3.3)。组分2.3.3.1和组分2.3.3.3分别用制备色谱进一步分离得到羟异栀子苷和去乙酰车叶草苷酸甲酯。
京尼平苷：白色固体；1hnmr(400mhz,dmso)δ7.47(s,1h),5.68(s,1h),5.12(d,j＝6.7hz,1h),5.07(d,j＝5.0hz,1h),5.00(d,j＝4.6hz,1h),4.96(d,j＝5.0hz,1h),4.74(t,j＝5.1hz,1h),4.53(d,j＝7.7hz,1h),4.49(t,j＝5.5hz,1h),4.14(d,j＝14.4hz,1h),3.97(d,j＝15.2hz,1h),3.69–3.61(m,4h),3.46–3.37(m,1h),3.20–2.94(m,5h),2.74–2.61(m,2h),2.05(dd,j＝15.1,4.1hz,1h).13cnmr(100mhz,dmso)δ166.88,151.56,144.06,125.40,110.87,98.52,95.66,77.23,76.58,73.26,69.91,60.92,59.31,51.01,45.81,37.93,34.44。
京尼平龙胆二糖苷：白色固体；1hnmr(400mhz,meod)δ7.53(s,1h),5.88(s,1h),5.17(d,j＝7.9hz,1h),4.74(dd,j＝7.8,2.8hz,1h),4.39(d,j＝7.7hz,1h),4.34(d,j＝14.3hz,1h),4.21(d,j＝14.4hz,1h),4.14(d,j＝12.0hz,1h),3.89(d,j＝11.9hz,1h),3.78(dd,j＝12.0,6.9hz,1h),3.73(s,3h),3.67(d,j＝12.1hz,1h),3.58–3.50(m,1h),3.40(t,j＝9.0hz,1h),3.31–3.13(m,7h),2.85(dd,j＝16.1,8.3hz,1h),2.73(t,j＝7.8hz,1h),2.20(dd,j＝15.4,7.4hz,1h).13cnmr(100mhz,meod)δ168.18,151.95,143.43,127.62,111.01,103.44,99.21,97.42,76.61,76.50,76.44,76.38,73.78,73.41,70.33,70.27,68.39,61.41,60.08,50.31,45.65,38.36,35.36.hrms(esi)calcdforc23h34nao15[m+na]+573.1790,found573.1770。
羟异栀子苷：白色固体；1hnmr(400mhz,meod)δ7.38(s,1h),6.16(dd,j＝5.7,2.7hz,1h),5.79(d,j＝2.4hz,1h),5.74(dd,j＝5.7,1.4hz,1h),4.65(d,j＝7.9hz,1h),3.88(dd,j＝11.9,1.4hz,1h),3.76–3.62(m,7h),3.52(d,j＝11.4hz,1h),3.39–3.24(m,2h),3.18(t,j＝8.5hz,1h),2.62(dd,j＝8.5,2.4hz,1h).13cnmr(100mhz,meod)δ167.53,150.56,134.44,134.32,110.17,98.53,92.98,84.88,76.98,76.60,73.28,70.21,65.72,61.42,50.98,50.29,37.49.hrms(esi)calcdforc17h24nao11[m+na]+427.1211,found427.1240。
去乙酰车叶草苷酸甲酯：白色固体；1hnmr(400mhz,meod)δ7.65(s,1h),6.02(s,1h),5.06(d,j＝9.0hz,1h),4.79(m,2h),4.72(d,j＝7.9hz,1h),4.45(d,j＝15.5hz,1h),4.21(d,j＝15.4hz,1h),3.85(d,j＝12.0hz,1h),3.74(s,3h),3.62(dd,j＝11.8,4.7hz,1h),3.42–3.36(m,1h),3.28–3.16(m,3h),3.02(t,j＝6.6hz,1h),2.57(t,j＝8.1hz,1h).13cnmr(100mhz,meod)δ169.49,155.42,151.55,129.94,108.36,101.66,100.60,78.59,77.94,75.48,75.06,71.74,62.93,61.74,51.84,45.96,42.76.hrms(esi)calcdforc17h24nao11[m+na]+427.1211,found427.1226。
实施例2
本实施例为环烯醚萜苷的提取物生物活性抗烟草花叶病毒(tobaccomosaicvirus,tmv)的活性测试，
1、病毒提纯及浓度测定：
病毒提纯及浓度测定参照南开大学元素所生测室编制烟草花叶病毒sop规范执行。病毒粗提液经2次聚乙二醇离心处理后，测定浓度，4℃冷藏备用。
2、化合物溶液配制：
称量后，原药加入dmf溶解，制得1×105μg/ml母液，后用含1‰吐温80水溶液稀释至所需浓度；病毒唑制剂直接兑水稀释。原药包括环烯醚萜苷的提取物京尼平苷、京尼平龙胆二糖苷、羟异栀子苷、去乙酰车叶草苷酸甲酯和对比化合物病毒唑。
3、活体保护作用：
选长势均匀一致的3–5叶期珊西烟，全株喷雾施药，每处理3次重复，并设1‰吐温80水溶液对照。24h后，叶面撒布金刚砂(500目)，用毛笔蘸取病毒液，在全叶面沿支脉方向轻擦2次，叶片下方用手掌支撑，病毒浓度10μg/ml，接种后用流水冲洗。3d后记录病斑数，计算防效。
4、活体治疗作用：
选长势均匀一致的3-5叶期珊西烟，用毛笔全叶接种病毒，病毒浓度为10μg/ml，接种后用流水冲洗。叶面收干后，全株喷雾施药，每处理3次重复，并设1‰吐温80水溶液对照。3d后记录病斑数，计算防效。
5、活体钝化作用：
选长势均匀一致的3-5叶期珊西烟，将药剂与等体积的病毒汁液混合钝化30min后，摩擦接种，病毒浓度20μg/ml，接种后即用流水冲洗，重复3次，设1‰吐温80水溶液对照。3d后数病斑数，计算结果。
表1提取化合物的抗烟草花叶病毒活性对照表
从表1可以看出所有化合物在500mg/kg浓度下对烟草花叶病毒均表现出活性，且羟异栀子苷的活性水平高于商品化品种病毒唑。
实施例3
本实施例为环烯醚萜苷的提取物杀虫活性测试：
1、粘虫的活性测试
粘虫活性测试的实验方法：浸叶法，配置成所需浓度后，把直径约为5-6cm的叶片浸入药液中5-6秒，取出，放在吸水纸上晾干，放在指定的培养皿中，接入10头3龄幼虫，放入27±1℃的养虫室中观察3-4天后检查结果。
2、棉铃虫的活性测试
棉铃虫活性测试的实验方法：饲料混药法，从配置好的溶液中移取3ml加入约27g的刚配置好的饲料中，从而得到稀释十倍的所需浓度。药剂混匀后均匀地倒入干净的24孔板中，晾凉后接入24头3龄棉铃虫，观察3-4天后检查结果。
3、玉米螟的活性测试
玉米螟活性测试的试验方法：浸叶法，配置成所需浓度后，把直径约为5-6㎝的叶片浸入药液中5-6秒，取出，放在吸水纸上晾干，放在指定的培养皿中，接入10头3龄幼虫，放入27±1℃的养虫室中观察3-4天后检查结果。
4、蚜虫的活性测试
杀蚜虫活性测定步骤如下：试虫为蚜虫(aphislaburnikaltenbach)，实验室蚕豆叶饲养的正常群体。称取药品，加1mldmf溶解，加两滴吐温－20乳化剂，加入一定量的蒸馏水，搅拌均匀，配成所需浓度的药液。将带蚜虫(约60只)蚕豆叶片浸入药剂中5秒钟，拿出轻轻甩干，用滤纸吸干多余药剂，然后将蚕豆枝插入吸水海绵中，并用玻璃罩罩住枝条，用纱布封口，96小时检查结果，每个化合物重复3次。对照只向蒸馏水中加入乳化剂和溶剂，搅拌均匀。
5、朱砂叶螨成螨的活性测试
供试验用的矮生菜豆长至两片真叶时，选择长势比较整齐、叶面积4-5平方厘米、株高10厘米左右的植株接虫，每株虫量控制在60-100头左右。接虫24小时后进行药剂处理。药剂处理采用植株浸渍法，浸渍时间5秒钟。植株从药液中取出后，轻轻抖动，甩掉多余药液，然后移入水培缸中，放置在室温下。处理后24小时在双目镜下检查结果。(做三次平行试验取平均值)
6、小菜蛾幼虫的活性测试
采用国际抗性行动委员会(irac)提出的浸叶法。在分析天平上称取2mg药样于10ml小烧杯中，加50μl二甲基甲酰胺(分析纯)溶解，加10ml水制成200mg/kg药液。用直头眼科镊子浸渍甘蓝叶片，时间2-3秒，甩掉余液。每次1片，每个样品共3片。按样品标记顺序依次放在处理纸上。待药液干后，放入具有标记的10cm长的直型管内，接入2龄小菜蛾幼虫，用纱布盖好管口。将试验处理置于标准处理室内，96h后检查结果。每个化合物重复3次。对照只向蒸馏水中加入乳化剂和溶剂，搅拌均匀。
7、蚊幼虫的活性测试
蚊幼虫的实验方法：尖音库蚊淡色亚种，室内饲养的正常群体。称取供试化合物约5mg于盘尼西林药瓶中，加5ml丙酮(或适宜溶剂)，振荡溶解，即为1000mg/kg母液。移取0.5ml母液，加入盛有89.9ml水的100ml烧杯中，选取10头4龄初蚊子幼虫，连同10ml饲养液一并倒入烧杯中，其药液的浓度即为5mg/kg。放入标准处理室内，24h检查结果。以含有0.5ml试验溶剂的水溶液为空白对照。
表2环烯醚萜苷的提取化合物的杀虫活性对照表
从表2可以看出，所有化合物对小菜蛾都表现出了令人满意的杀虫活性，在600mg/kg的浓度下致死率超过70％，特别是去乙酰车叶草苷酸甲酯在100mg/kg的浓度下致死率超过商品化品种鱼藤酮。京尼平龙胆二糖苷，羟异栀子苷，去乙酰车叶草苷酸甲酯三个化合物在600mg/kg浓度下对朱砂叶螨成螨表现出不低于70％的致死率。京尼平龙胆二糖苷对黏虫表现出优异的活性水平(80％,100mg/kg)。仅京尼平苷对蚊幼虫表现出了适中的活性水平(50％，5mg/kg)；所有化合物对于棉铃虫，玉米螟和蚜虫的致死率较弱或者无活性。