本发明属于医学技术领域，更具体地，涉及一种基于icsi显微操作的冻精方法。
背景技术
冷冻精子是辅助生殖中必需的技术，在体外受精过程中，部分患者因活动精子的数目较少或取精困难等原因，需要提前冷冻精子，以备体外受精用。其中部分患者活动精子的数目较少，常规方法冷冻的操作环节较多，操作过程中有多种器具和准备冷冻或解冻的精子及其冷冻保护剂相接触，容易导致少量准备冷冻或解冻的精子丢失，解冻后很难找到活动精子。在临床工作中，冷冻前活动精子的数目在10-15条以下者，用常规方法冷冻，解冻后就很难找到活动精子。
现有的人类少量精子的冷冻采用的是显微冻精技术。具体过程是将含有少量精子及其冷冻保护剂装入麦秆，然后将含有少量精子及其冷冻保护剂的麦秆置液氮中冷冻；如要解冻精子，则将麦秆从液氮中取出，复温后将麦秆中的少量精子及其冷冻保护剂吸出，置皿(icsi皿)中备用。
单精子胞浆内注射技术(intracytoplasmicsperminjection，icsi)广泛应用于治疗男性不育；icsi显微操作系统用于精液的冷冻储存，主要是用注射针从icsi皿中吸取活动精子，并将吸取的精子置于透明带等载体上，超低温保存。精液的冷冻储存方式有吸管法、安瓶法、冰晶法和透明带存放法4种。在透明带存放法中，按照icsi操作流程，将精子注入透明带，一个透明带存放不超过5个精子，将带有精子的透明带置于麦秆或麦管，冷冻保存，解冻时将含有精子的透明带放入icsi皿中备用。国内外虽有icsi吸取精子进行冷冻，但其冷冻的载体是麦管、胶囊或透明带。cn108207931a公开了一种微量精子冷冻保存方法，其中虽未使用麦管、胶囊或透明带，但仍采用水凝胶微球作为载体，解冻时需将精子及其保护剂从载体中吸出，制成液滴方可使用，增加了太多的显微操作及中间环节。
因此，现有的少量精子冻精技术操作环节较多，操作过程有多种器具和准备冷冻或解冻的精子及其冷冻保护剂相接触，容易导致少量准备冷冻或解冻的精子丢失，且解冻后需要将精子及其冷冻保护剂转移到一定的器皿后方可使用，在操作过程中增加了中间环节，明显增加了精子丢失和失活的可能性。同时，使用载体还增加了购买载体的费用和增加了操作人员的技术难度和操作时间
技术实现要素：
本发明的目的是提供一种基于icsi显微操作的冻精方法。本发明的方法无需载体，显著减少了少量精子在冷冻和复苏操作过程中的中间环节，解冻后精子活动率高、精子丢失率低，精子的利用率高。
具体地，本发明提供一种基于icsi显微操作的冻精方法，该方法包括以下步骤：
(1)准备两个icsi皿，一个放置精子标本(包括射出精液及睾丸和附睾的穿刺液)，另一个放置1至数滴精子冷冻保护液；
(2)在icsi倒置显微镜下，用单精子注射针从放置精子标本的icsi皿中吸取活动精子，置于另一个icsi皿的精子冷冻保护液的液滴中；
(3)将含有精子冷冻保护液的液滴的icsi皿置于液氮中冷冻并保存。
本发明利用icsi穿刺针吸取精子并直接放入icsi皿中冷冻，为再取出观察或应用减少中间环节。
本发明中，所述精子冷冻保护液可以为常规各种自制或商品化的精子冷冻保护液，本发明对此并无特别限定。根据本发明一种具体实施方式，所述精子冷冻保护液为商品化的精子冷冻保护液(quinnsadvantagetmspermfreezingmedium)。
本发明是一种以icsi显微操作系统为基础的显微冻精技术，是一种改进的显微冻精技术。由常规方法冷冻精子技术和单精子胞浆内注射中的吸精技术两部分组合而成。各部分均可采用常规操作流程。
根据本发明，步骤(3)还可以包括：将含有精子冷冻保护液的液滴的icsi皿于2-6℃放置10-20分钟，继之放在液氮蒸汽中20-30分钟，最后置于液氮中冷冻。该步骤直接冷冻含有精子冷冻保护液的液滴，不需要吸出精子及其冷冻保护剂的液滴至载体上，然后冷冻载体及其液滴，减少了冷冻时转移精子至载体的环节。
根据本发明，解冻精子时，将含有精子冷冻保护液的液滴的icsi皿从液氮中取出，复温后备用。所述复温的具体步骤包括：将含有精子冷冻保护液的液滴的icsi皿从液氮中取出，快速放入37℃水浴箱内复苏5-10分钟，直接备用。该步骤中不需要吸出精子及其冷冻保护剂至icsi皿备用，而是直接就可以备用，减少了解冻后转移精子的环节。
使用本发明的方法，不会增加新的仪器、设备及试剂，所用的仪器、设备及试剂不会毒害及损伤患者的精子，也不会给患者带来任何风险。与常规方法相比，本发明的冻精方法，解冻后精子活动率较高，精子丢失率较低；对有适应症的患者，用本发明的冻精方法可明显改善其临床结局。
本发明的方法可用于现有人类少量精子(包括射出精子、睾丸和附睾精子等)及精子胞浆内显微注射后留在icsi皿中的剩余精子的冷冻，特别适用于冷冻前活动精子的数目在10-15条以下者。此外，本发明的方法还适用于行睾丸穿刺术取得的精子的冷冻，通过此技术，将取得的精子分成多份冷冻，每次取一份来受精，可以明显减少患者因体外受精失败后再次行睾丸穿刺术取精的几率，减少患者的痛苦和经济负担。
本发明的其它特征和优点将在随后具体实施方式部分予以详细说明。
具体实施方式
下面将更详细地描述本发明的优选实施方式。虽然以下描述了本发明的优选实施方式，然而应该理解，可以以各种形式实现本发明而不应被这里阐述的实施方式所限制。
实施例
采用贵州医科大学附属医院生殖中心6份废弃的精液标本进行实验。包括以下步骤：
(1)准备两个icsi皿，一个放置精子标本，另一个放置1至数滴精子冷冻保护液；
(2)在icsi倒置显微镜下，用单精子注射针从放置精子标本的icsi皿中吸取活动精子，置于另一个icsi皿的精子冷冻保护液的液滴中；
(3)将含有精子冷冻保护液的液滴的icsi皿于4℃放置15分钟，继之放在液氮蒸汽中25分钟，最后置于液氮中冷冻并保存；
所述精子冷冻保护液为quinnsadvantagetmspermfreezingmedium。
解冻精子时，将含有精子冷冻保护液的液滴的icsi皿从液氮中取出，复温后备用，所述复温的步骤包括：将含有精子冷冻保护液的液滴的icsi皿从液氮中取出，快速放入37℃水浴箱内复苏10分钟。
冻精技术的成功与否，主要根据冻精解冻后精子活动率和精子丢失率来计算。冻精解冻后精子活动率越高，精子丢失率越低，冻精技术就成功。冻精效果如表1所示。
表1本发明方法冷冻精子效果
注：精子活动率＝活动的精子个数/总的精子个数；精子丢失率＝冷冻前的精子个数-解冻后的精子个数/冷冻前的精子个数；由于常规方法冷冻精子时冷冻的是标本中的活动精子和非活动精子，为了更好地与生殖中心常规方法冷冻精子效果比较，本方法的本次实验冷冻的亦是标本中的活动精子和非活动精子。
6份标本冷冻及解冻后的效果分析：冷冻前精子平均活动率为59.58％；解冻后精子平均丢失率为3.32％，精子平均活动率为49.08％。贵州医科大学附属医院生殖中心用常规方法冷冻精子，解冻后精子的平均活动率较冷冻前下降16％。用本发明的冻精方法，解冻后精子的平均活动率较冷冻前仅下降10.4％。可见，与常规冻精方法相比，用本发明的方法冻精，解冻后精子活动率较高，精子丢失率较低。
以上已经描述了本发明的各实施例，上述说明是示例性的，并非穷尽性的，并且也不限于所披露的各实施例。在不偏离所说明的各实施例的范围和精神的情况下，对于本技术领域的普通技术人员来说许多修改和变更都是显而易见的。