一种RNA样本保存液及其应用方法与流程

本发明属于分子生物学领域，涉及到一种安全无毒、高效的保存rna样本的保存液及其应用。
背景技术：
核糖核酸(rna，nuecleicacid)是细胞的主要成分之一，也可作为rna病毒的遗传物质，在蛋白质生物合成过程中，包括转录、转录后加工、编辑、修饰中扮演重要角色；此外，rna具有重要的催化和持家功能，可对基因表达和细胞功能进行调节；在生物进化中也起到重要作用，rna参与细胞的各种功能活动，是生物学、医学、药学等生命有关学科研究的重要对象。rna检测适用于人类疾病诊断、健康检测、预后和治疗方案的选择等多重领域，rna测序亦可通过监测疾病发展过程中rna表达是否异常，确定rna与疾病发生的相关性。因此，获取完整rna对下游基因表达分析至关重要。但大多数情况下rna的完整性很难保证。除了rna本身为单链结构外，另一个重要的原因就是rna酶的广泛存在。除了外源环境中的rna酶，组织样本内部的rna酶也是非常丰富的。rna酶性能稳定，通过高温高压处理(如煮沸、高压灭菌)都很难让其失活，且难于去除。由此，体外贮存样品中的rna比dna更容易因为酶污染而被酶解，rna需要比dna更严格的贮存条件。目前常规保存组织rna的方法是液氮超低温保存方法、福尔马林或乙醇浸泡方法。前者对环境、设备及操作人员要求高，且超低温液氮温度极低，操作不当容易导致吸入或者溅出，危及操作人员安全。后者中福尔马林虽然渗透力强，防腐杀菌效果好，但极易造成rna降解，具有提取繁琐、重复性差等缺点，而乙醇则会导致样本脱水组织紧固，减低核酸提取产量。由此可见，有必要提供一种安全无毒、稳定、方便高效的rna样本保存液。技术实现要素：鉴于此，有必要针对上述问题提供一种安全无毒、稳定、方便高效的rna样本保存液以及该保存液的应用。对临床或野外等地进行现场样品采集，能够有效稳定保存组织样本rna，且使用方便。本发明是通过以下技术方案实现的：一种rna样本保存液，所述保存液包括：体积百分比为20～70％氯化盐，所述氯化盐，在高浓度环境下，可以使得组织脱水固定，同时防止组织腐坏；终浓度为10～50mmol/l的柠檬酸钠，所述柠檬酸钠在适宜的浓度可以对金属离子有络合能力，能够抑制rnase酶活性；终浓度为5mmol/l～200mmol/l氧钒核糖核苷复合物,该物质是由氧化钒离子和四种rntp(ratp、rutp、rctp、rgtp)等摩尔核苷混合物反应形成的复合物，能与rna酶以非共价键结合，形成稳定的复合物，即使在高温情况下，该复合物(钒酸根可形成磷酸转移反应的过渡态的类似物)也不会发生失活，能高效抑制rna酶的活性；体积百分比为10～40％的去离子甲酰胺，去离子甲酰胺与rna结合后可以消除rna表面电荷的排斥力，降低rna折叠的空间阻力，从而增加rna折叠形成双链的可能，局部形成双链的rna在稳定性方面能够显著提高；终浓度为0.01～0.2mol/l的2-(n-吗啉代)乙烷磺酸钠盐，ph值4.5～6.5,维持保存液ph值范围，使溶液维持在一个弱酸性环境，有利于保护rna。进一步的，所述氯化盐包括氯化钠、氯化钾、氯化铵等。进一步的，所述rna保存液也用于保存组织样本、细胞样本、血液样本等。进一步的，所述rna保存液的使用方法包括如下步骤：(1)将样本简单前处理后置于样品收集管；(2)向(1)中加入5-10倍体积的rna保存液，确保将样本完全浸没；(3)将(2)加了保存液的样本，置于适当的温度环境中保存。进一步的，所述保存液保存样本的温度环境与保存时间为：表1保存温度保存时间37℃5～7天18-25℃14～16天4℃1～2个月-20℃以下长期进一步的，所述样本为组织样本时，前处理包括：根据样本大小及保存管大小，将样本剪切，最优剪切为厚度小于0.5cm的碎块进行保存。进一步的，所述样本为细胞样本时，前处理包括：1000g离心10min,小心去掉上清保留沉淀。进一步的，所述样本为全血样本时，前处理包括：加入3-5倍红细胞裂解液裂解5-10min,然后1000g离心10min,小心去掉上清保留沉淀。本发明有益效果：本发明的保存液安全无毒、稳定、方便高效，对临床或野外等地进行现场样品采集，能够有效稳定保存组织样本rna，且使用方便。rna在酸性环境下较碱性环境下稳定，本发明保护液中可以稳定维持适宜于rna保存的ph值环境。经本发明rna保存液保存的样本，在常温条件下，待试剂中盐及其他组分渗入细胞并固定细胞后，可37℃可保存5-7天，18-25℃可保存14-16天，4℃保存1-2个月，-20℃以下可长期保存，即使经过多次反复冻融，rna也不会降解。上述温度环境可以根据实际需要进行变换。例如，野外采集现场为18-37℃的环境，证据采集完回到室内置于4℃或者-20℃以下的温度环境里保存，不会影响保存效果。本发明的rna保存液条带亮度及完整性明显优于其他方法。由此可以看出，本发明的rna保存液能够明显改善常规方法的保存效果，且无毒无害，更有利于环保。附图说明图1为：不同保存液保存组织的产物，q-pcr验证图图2为：本发明rna保存液对比rnalatertmstabilizationsolution保存液保存的组织的提取产物q-pcr验证图图3为：rna保存液保存培养细胞不同时间提取产物电泳图；其中：1为37℃第2天，2为37℃第5天，3为18-25℃第7天，4为18-25℃第15天，5为4℃第30天，6为4℃第45天，7为4℃第60天，8为-20℃第100天，9为-20℃第180天，10为-20℃第360天；上方条带为28s，下方条带为18s。图4为：rna保存液保存白细胞不同时间提取产物电泳图；其中：1为37℃第2天，2为37℃第5天，3为18-25℃第7天，4为18-25℃第15天，5为4℃第30天，6为4℃第45天，7为4℃第60天，8为-20℃第100天，9为-20℃第180天，10为-20℃第360天；上方条带为28s，下方条带为18s。具体实施方式为了更好的说明本发明技术方案所要解决的问题、采用的技术方案和达到的有益效果，现结合具体实施方式进一步阐述。值得说明的是，本发明技术方案包含但不限于以下实施方式。本发明实施例中未注明具体技术或条件的，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购等途径获得的常规产品。实施例1福尔马林、乙醇及本发明rna样本保存液保存效果对比验证设计实验对本发明rna保存液与市面上常规的福尔马林、乙醇法保存rna的保存效果进行对比验证。准备一份组织样品，通过剪切、称重，平均分为6份，厚度小于0.5cm。其中：2份加入5～10倍体积的本发明rna保存液，室温放置14天；2份使用福尔马林浸泡，室温放置14天；2份使用乙醇浸泡，室温放置14天；上述六份用不同方式处理的样本保存在同一室温环境。将上述6份用不同方式处理的组织样本，按照已上市商业化rna提取试剂盒说明书操作步骤(建议按照奇辉生物rna提取试剂盒说明书)进行rna的提取。并将提取产物进行浓度、纯度测定后再通过1％琼脂糖凝胶电泳检测完整性。6例样本使用三种不同rna保存方法得到的浓度纯度检测结果见下表。表2样本类型浓度ng/ul纯度电泳检测效果本发明保存液-11402.1+++本发明保存液-21352.1+++福尔马林-1801.9-福尔马林-2882.0-乙醇-1702.0+乙醇-2801.9+注：“---”代表rna完全降解，“-”代表rna部分降解，“+”代表rna完整性较好、有两条带，“+++”代表rna完整性好无降解。按照上述6份rna提取产物浓度，计算每份200ngrna总量对应的体积，并按照下表展示的康为世纪hifiscriptcdnasynthesiskit试剂盒说明书进行逆转录操作。表3将上述6份完成逆转录的rna产物采用荧光定量pcr方法验证提取rna的质量。验证结果见图1。荧光定量pcr结果显示，用本发明不同方式处理的组织样本提取的rna质量明显优于福尔马林和乙醇两种保存方法。该实验结果显示6个样本提取rna的完整性情况与1％琼脂糖凝胶电泳检测结果基本一致。实施例2不同ph值保存液保存效果验证设计实验验证ph值环境对rna保护效果：(1)rna保存液准备：根据本发明提供的rna保存液组成成分及浓度范围配制rna保存液。本实验通过添加2-(n-吗啉代)乙烷磺酸钠盐含量来调节ph值，ph值设置分别为3.5、4.5、5.5、6.5、7.5、8.5。(2)样本准备：准备一份组织样品，通过剪切、称重，平均分为12份，厚度小于0.5cm。加入5～10倍体积的保存液，将样本置于37℃温箱保存48小时。(3)rna提取：按照已上市商业化rna提取试剂盒说明书操作步骤(建议按照奇辉生物rna提取试剂盒说明书)进行rna的提取。(4)rna提取结果检测：将提取产物进行浓度、纯度测定后再通过1％琼脂糖凝胶电泳检测。12例样本使用六种不同ph值验证后检测结果见下表4。表4ph值浓度ng/ul纯度电泳检测效果3.5-11412.1-3.5-21522.0-4.5-11552.1+++4.5-21572.1+++5.5-11602.1+++5.5-21502.0+++6.5-11592.0+++6.5-21522.0+++7.5-11562.0+7.5-21542.1+8.5-11402.0+8.5-11562.1-电泳结果显示，ph值位于4.5～6.5之间时，rna保存完整性明显优于其他ph范围值，ph值过高或过低都会导致rna的不同程度降解。实施例3验证不同ph下去离子甲酰胺在保存液中的作用验证设计实验验证不同ph值条件下去离子甲酰胺在保存液中作用。配制体积百分比为30％氯化钾，终浓度为25mmol/l的柠檬酸钠，终浓度为100mm氧钒核糖核苷复合，终浓度为0.1m的2-(n-吗啉代)乙烷磺酸钠盐，ph分别为4.5、5.5、6.5、7.5；配制不同体积百分比的去离子甲酰胺，体积百分比分别为0、10％、20％、30％、40％。样品准备：取小鼠肝脏，通过剪切、称重，平均分为20份，厚度小于0.5cm。加入5～10倍体积的保存液，置于样本rna保存液保存；在37℃保存，分别在第三天、第五天、第七天进行提取。(4)rna提取结果检测：将提取产物进行浓度、纯度测定后再通过1％琼脂糖凝胶电泳检测。20例样本使用四种不同ph值验证后检测结果见下表5。表5注：“---”代表rna完全降解，“-”代表rna部分降解，“+”代表rna完整性较好、有两条带，“+++”代表rna完整性好无降解。根据电泳图结果：ph为5.5～6.5，配合去离子甲酰胺浓度在20％～40％时，rna在37℃保存5～7天后rna条带仍然比较完整。实施例4对组织保存时间验证设计实验对样本rna保存液保存组织时间进行验证，确定保存液的保存效果。配制的体积百分比为40％氯化铵、终浓度为25mmol/l的柠檬酸钠、终浓度为50mm氧钒核糖核苷复合物,体积百分比为20％的去离子甲酰胺，终浓度为0.1m的2-(n-吗啉代)乙烷磺酸钠盐，ph6.5。取小鼠肝脏均分为8份，4份置于样本rna保存液，另外4份置于thermofisher公司的rnalatertmstabilizationsolution保存液中。室温放置4小时后，在37℃、18-25℃、4℃、-20℃，取本发明rna保存液、rnalatertmstabilizationsolution保存液保存的组织。按照下表6保存时间提取：表6取上述提取的产物进行1％琼脂糖凝胶电泳，同时计算每份200ngrna总量对应的体积，并按照下表7展示的康为世纪hifiscriptcdnasynthesiskit试剂盒说明书进行逆转录操作。表7逆转录完成后，取逆转录产物进行q-pcr验证。验证效果见图2。荧光定量pcr结果显示，在上述保存温度及保存时间点，用本发明rna保存液，保存的组织样本rna完整性好。实施例5不同含量氧钒核糖核苷复合物在rna保存液中效果测试设计实验验证不同浓度的氧钒核糖核苷复合物对rna保护效果：(1)rna保存液准备：按照本发明提供的rna保存液组成配制：体积百分比为50％的氯化钠，终浓度为10mm柠檬酸钠、终浓度为0.06m的2-(n-吗啉代)乙烷磺酸钠盐，ph值5.0。选择7种不同浓度的氧钒核糖核苷复合物，分别为：0、1mm、5mm、10mm、50mm、100mm、200mm，共配制7种rna保存液，对样本进行保存验证。(2)样本准备：取小鼠肝脏均分为21份，置于样本rna保存液保存。置于37℃，分别在保存第三天、第五天、第七天时取出样本，按照商业化rna提取试剂盒说明书操作步骤(建议按照奇辉生物rna提取试剂盒说明书)进行rna的提取。样本提取完成后，每个样本定量200ng进行电泳，用1％琼脂糖凝胶电泳检测。条带检测汇总情况见下表8。表8注：“---”代表rna完全降解，“-”代表rna部分降解，“+”代表rna完整性较好、有两条带，“+++”代表rna完整性好无降解。由此得知，氧钒核糖核苷复合物浓度为10mm～200mm时，对组织中rna有较好的保存效果。实施例6rna保存液保存培养细胞根据本发明提供的rna保存液组成成分及浓度范围配制rna保存液：体积百分比为50％氯化钠，终浓度为20mm氧钒核糖核苷复合物,终浓度为25mmol/l的柠檬酸钠、体积比为30％的去离子甲酰胺，终浓度为0.2mmol/l的2-(n-吗啉代)乙烷磺酸钠盐，ph值6.0。采用上述rna保存液保存培养细胞，具体操作如下：(1)将待保存标本置于离心机中1000g离心10min，去上清，收集细胞；(2)向(1)中收集有细胞的离心管加入500μlpbs洗涤一次，1000g离心5min，弃上清；(3)向(2)离心管加入50μlpbs,将细胞悬浮；(4)向(3)离心管中加入500μl的rna保存液，混匀；(5)将(4)中混匀溶液平均分为10份，按照下表9保存温度进行保存，并在相应的时间点进行rna提取：表9保存温度提取时间点37℃第2天、第5天18-25℃第7天、第15天4℃第30天、第45天、第60天-20℃第100天、第180天、第360天上述10例组织样本rna提取完成后，每个样本定量200ngrna进行1％琼脂糖凝胶电泳。上样量：2μlrna+3μltris:loading。电泳检测情况见图3。电泳检测结果表明，上述四个保存温度保存的组织样本在相应的时间提取的rna均具有较好的产量(亮度)及完整性(无降解)。实施例7rna保存液保存全血白细胞根据本发明提供的rna保存液组成成分及浓度范围配制rna保存液：体积百分比30％氯化钠、终浓度为10mm氧钒核糖核苷复合物,,终浓度为10mmol/l的柠檬酸钠、体积百分比为15％的去离子甲酰胺，终浓度为0.1m的2-(n-吗啉代)乙烷磺酸钠盐、ph值7.0。采用上述rna保存液保存全血白细胞，具体操作如下：(1)取200μl新鲜全血，加入600μl商品化的红细胞裂解液(rt122)(天根)，裂解后1000g离心10min，保留白细胞沉淀。(2)向(1)离心管加入500μlpbs洗涤一次，1000g离心5min，弃上清；(3)向(2)离心管加入50μlpbs,将细胞悬浮；(4)向(3)离心管中加入500μl的rna保存液，混匀；(5)将(4)中混匀溶液平均分为10份，按照下表10保存温度进行保存，并在相应的时间点进行rna提取：表10保存温度提取时间点37℃第5天、第7天18-25℃第14天、第16天4℃第30天、第45天、第60天-20℃第100天、第180天、第360天上述10例组织样本rna提取完成后，每个样本定量200ngrna进行1％琼脂糖凝胶电泳。上样量：2μlrna+3μltris:loading。电泳检测情况见图4。电泳检测结果表明，上述四个保存温度保存的组织样本在相应的时间提取的rna均具有较好的产量(亮度)及完整性(无降解)。上述实验操作要求实验室各区间人员流动及空气流向应有严格要求，最大限度避免交叉污染。实验过程中穿工作服，带一次性手套和口罩，使用自卸管的移液器。实验用消耗品(如离心管、吸头等)应无核酸酶污染，一次性使用，避免假阴性或假阳性结果。以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。当前第1页12