本发明涉及生物技术领域，特别是涉及一种肿瘤组织高活性储存运输液及其制备方法。
背景技术
储存液要保持细胞的生物活性以满足其在临床上的应用，因此，如何维持细胞的高活性成为治疗关键。之前，人们用生理盐水或葡萄糖作为保护液，但是由于缺乏营养、溶液的张力或等渗透力存在差异等原因，导致细胞在长期保存或运输中出现活力低下、大量溶胀死亡等现象。随后，人们不断改善储存液的组成系统添加了kcl、柠檬酸钠，白蛋白、维生素等，形成保存液。虽然这些保存液在较长时间内很好的维持了细胞活性，但组成成分复杂，配制过程繁琐。
目前，常见的肿瘤组织体外储存液为磷酸缓冲盐溶液(phosphatebuffersaline，pbs)和细胞培养基。其中pbs缓冲液的主要成分包括磷酸氢二钠、磷酸二氢钠、氯化钠和氯化钾等，具有盐平衡、可调整的适宜的ph缓冲作用；细胞培养基的主要成分包括基础培养基、牛血清、抗生素等，可用于维持细胞的生长增殖。但是在实际使用过程中发现，pbs缓冲液成分简单，但是功能局限，不能很好地保持体外肿瘤组织的生物活性；细胞培养及主要用来维持细胞的生长增殖，不是作为肿瘤组织储存液的最佳选择，使用pbs和细胞培养基作为肿瘤细胞储存液时，保留肿瘤细胞的活性有限，从而致使肿瘤组织移植的成功率很低。
为了解决上述问题，中国专利申请201710175519.7中公开了一种肿瘤组织体外保存液及其制备方法，所述方法包括：在基础培养基中加入抗生素得到a溶液；在天然培养基中溶解牛磺酸，再加入聚乙二醇辛基苯基醚得到b液，将所述b液加入到所述a液中并混匀，得到所述肿瘤组织体外保存液，通过该发明所述方法制备的体外保存液，能够维持肿瘤组织在体外保存时的生物活性，延长肿瘤组织地体外保存时间，提高肿瘤移植的成功率。
当今肿瘤治疗依然是医学界面临的巨大难题，由于不同肿瘤细胞所适用的药物不同，更加有针对性的治疗肿瘤，医生在对不同肿瘤患者用药时，需要筛选对患者最有利，副作用小并具有靶向作用的药物，因此在手术过程中需要切下长度为0.5-1.5厘米的小标本或术前穿刺取出微标本，冲洗后放入保存液中，在一定温度条件下，一定时间内运送到细胞培养机构，对肿瘤细胞进行原代培养，得到原代肿瘤细胞株，用于筛选对患者最有效的药物。因此需要制备一种组织保存运输液，可以保证细胞或组织在长时间运输过程中保持较高的活性，保证培养过程中细胞有较高的成活率。
例如中国专利申请公开了一种细胞保存液，包括如下物质：白蛋白、低分子肝素钠、海藻糖和生理盐水。本发明的有益效果：本发明所述的细胞保存液，其中，所使用的白蛋白可以维持溶液适度的粘度和渗透压，同时可以防止细胞黏连，维持细胞生物活性。肝素钠可以防止纤维蛋白生成，进一步防止细胞黏连。而海藻糖是一种非特异性天然保护剂，具有保护生物组织、细胞和生物大分子的作用，可以很好的保证较长时间的保存和运输中细胞的生物活性，因此，本发明的细胞保存液对细胞的活力和形态起到优良的维持作用，可适应较长时间保存和运输，维持其生物活性。该申请中保存的细胞为间充质细胞和中央记忆型t细胞，对于肿瘤细胞的保存和运输并没有任何描述。
肿瘤细胞环境要求与正常细胞有所区别，肿瘤细胞保存液缺点在于保存液对肿瘤细胞的生物活性保护还不够理想，保存细胞成活率未达到令人满意的效果。为了适应临床的需要，开发一种能适应长时间运输并提高肿瘤细胞保存活率的保存液是十分必要的。
技术实现要素：
针对上述存在技术问题，本发明提出了一种肿瘤组织高活性保存运输液，对肿瘤组织的生物活性保护较好，保存细胞成活率较高，能适应长时间运输。本发明还提供了一种肿瘤组织保存运输液的制备方法。
一种肿瘤组织高活性保存运输液，包括：dmem培养液和抗生素。
所述的抗生素包括庆大霉素；所述的抗生素还包括两性霉素b或制霉菌素中的一种或两种；抗生素的主要作用为抑菌杀菌作用，杀死肿瘤组织可能携带的微生物，进而防止细菌、真菌等微生物感染，以保证肿瘤细胞培养的成功。
所述的肿瘤组织高活性保存运输液，还包括氨基酸、生长因子和胰岛素。
所述的氨基酸可选自γ-氨基丁酸、脯氨酸和环丝氨酸中的至少两种；
优选地，所述的氨基酸可选自γ-氨基丁酸和环丝氨酸。
所述γ-氨基丁酸、环丝氨酸和脯氨酸的添加浓度比为1-2∶1∶1-2。
所述生长因子可选择自细胞生长因子，所述细胞生长因子为表皮细胞生长因子(egf)和/或纤维母细胞生长因子(fgf)。
所述的肿瘤组织高活性保存运输液，还包括山梨醇。
γ-氨基丁酸，别名4-氨基丁酸、哌啶酸，是一种天然活性成分，可参与多种代谢活动，具有较高的生理活性。
脯氨酸，化学名称为吡咯烷酮羧酸，它是一种环状的亚氨基酸，脯氨酸是人体的非必需氨基酸，在生物体内，脯氨酸不仅仅是理想的渗透调节物质，而且还可作为膜和酶的保护物质及自由基清除剂，从而对植物在渗透胁迫下的生长起到保护作用，对于钾离子生物体内另外一种重要的渗透调节物质在液泡中的积累情况，脯氨酸又可起到对细胞质渗透平衡的调节作用
环丝氨酸，学名″右旋-4-氨基-3-四氢异恶唑酮″，分子式c3h6n2o2，分子量102.09，白色或淡黄色结晶性粉末。抗生素类药物，除抗结核杆菌外，对革兰氏阳性菌、阴性菌，立克次菌也有抑制作用。
所述的dmem培养液在保存液中的体积百分比为84.8-93.5％，具体可以为85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％或93％。
所述的庆大霉素的浓度为5-15mg/l；优选地，所述的庆大霉素的浓度为6-14mg/l；再优选地，所述的庆大霉素的浓度为7-13mg/l；进一步优选地，所述的庆大霉素的浓度为8-12mg/l；再进一步优选地，所述的庆大霉素的浓度为9-11mg/l；再进一步优选地，所述的庆大霉素的浓度为10-11mg/l。
所述的两性霉素b的浓度为0.5-2mg/l；优选地，所述的两性霉素b的浓度为0.6-1.9mg/l；再优选地，所述的两性霉素b的浓度为0.7-1.8mg/l；进一步优选地，所述的两性霉素b的浓度为0.8-1.7mg/l；再进一步优选地，所述的两性霉素b的浓度为0.9-1.6mg/l；再进一步优选地，所述的两性霉素b的浓度为1.0-1.5mg/l；再进一步优选地，所述的两性霉素b的浓度为1.1-1.4mg/l；再进一步优选地，所述的两性霉素b的浓度为1.2-1.3mg/l。
所述的制霉菌素的浓度为50-100mg/l；优选地，所述的制霉菌素的浓度为60-90mg/l；再优选地，所述的制霉菌素的浓度为70-80mg/l。
所述的γ-氨基丁酸的浓度为20-50mg/l；优选地，所述的γ-氨基丁酸的浓度为25-45mg/l；再优选地，所述的γ-氨基丁酸的浓度为30-40mg/l；进一步优选地，所述的γ-氨基丁酸的浓度为35-40mg/l。
所述的脯氨酸的浓度为20-50mg/l；优选地，所述的脯氨酸的浓度为25-45mg/l；再优选地，所述的脯氨酸的浓度为30-40mg/l；进一步优选地，所述的脯氨酸的浓度为35-40mg/l。
所述的环丝氨酸的浓度为20-50mg/l；优选地，所述的环丝氨酸的浓度为25-45mg/l；再优选地，所述的环丝氨酸的浓度为30-40mg/l。
所述的表皮细胞生长因子(egf)的浓度为10-20μg/l；优选地，所述的表皮细胞生长因子(egf)的浓度为12-18μg/l；再优选地，所述的表皮细胞生长因子(egf)的浓度为13-17μg/l；进一步优选地，所述的表皮细胞生长因子(egf)的浓度为14-16μg/l；再进一步优选地，所述的表皮细胞生长因子(egf)的浓度为15-16μg/l。
所述的纤维母细胞生长因子(fgf)的浓度为10-20μg/l；优选地，所述的纤维母细胞生长因子(fgf)的浓度为12-18μg/l；再优选地，所述的纤维母细胞生长因子(fgf)的浓度为13-17μg/l；进一步优选地，所述的纤维母细胞生长因子(fgf)的浓度为14-16μg/l；再进一步优选地，所述的纤维母细胞生长因子(fgf)的浓度为15-16μg/l。
所述的胰岛素的浓度为1-5mg/l；优选地，所述的胰岛素的浓度为2-4mg/l；再优选地，所述的胰岛素的浓度为2-3mg/l。
所述山梨醇的浓度为10-50g/l；优选地，所述山梨醇的浓度为20-40g/l；再优选地，所述山梨醇的浓度为20-30g/l。
所述的胰岛素与所述的山梨醇的浓度比为1∶2000-40000；优选地，所述的胰岛素与所述的山梨醇的浓度比为1∶5000-30000；再优选地，所述的胰岛素与所述的山梨醇的浓度比为1∶8000-20000；再优选地，所述的胰岛素与所述的山梨醇的浓度比为1∶10000-20000。
上述肿瘤组织保存运输液的制备方法，具体包括以下步骤：
(1)首先将dmem培养液平均分成两部分；
(2)取一半dmem培养液中加入抗生素、氨基酸和生长因子，得到培养液a；
(3)取另一半dmem培养液加入山梨醇和胰岛素，得到培养液b；
(4)将步骤(2)中得到的培养液a和步骤(3)中得到的培养液b混合均匀，即得到高活性的肿瘤组织保存运输液。
本发明还提供了一种将肿瘤组织保存于所述的肿瘤组织高活性保存运输液中的方法，包括以下步骤：
s1、首先，将肿瘤组织高活性保存运输液，用粒径为0.2微米的过滤器过滤，除菌，得到过滤液；
s2、将步骤s1中得到的过滤液分装于15毫升的无菌塑料管中，每管含有过滤液6毫升，得到分装后的保存运输液；
s3、将步骤s2中分装后的保存运输液在-20摄氏度条件下长期保存，使用前在4摄氏度条件下解冻，并储存于4摄氏度条件中直至使用，即得到可使用的肿瘤组织的保存运输液；
s4、将新鲜手术或者穿刺标本用无菌pbs冲洗后，放入步骤s3中得到的肿瘤组织保存运输液中，冷链48小时内运送至检测中心，完成肿瘤组织的保存运输。
本发明的有益效果：
(1)本发明所述的肿瘤组织高活性保存运输液，其中使用的γ-氨基丁酸是一种天然活性成分，可以很好地保护肿瘤组织的活性，可以保证肿瘤细胞在运输过程中依然可以具有较高的活性。
(2)本发明在肿瘤组织的保存运输液中加入了山梨醇和胰岛素，研究发现山梨醇和胰岛素的加入可以使组织形态保持较好，使制备的保存液具有很好地抗凝作用，并能保证肿瘤组织的活性较高，延长肿瘤组织在体外的保存时间。
(3)本发明公开的肿瘤组织保存运输液中加入的抗生素为庆大霉素，然后又加入了两性霉素b或制霉菌素中的一种或两种。抗生素的主要作用为抑菌杀菌作用，杀死肿瘤组织可能携带的微生物，进而防止细菌、真菌等微生物感染，以保证肿瘤细胞培养的成功。
(4)本发明公开的肿瘤组织保存运输液中含有dmem培养液，抗生素，氨基酸、生长因子以及山梨醇和胰岛素，并通过控制各种分成的具体组分以及具体含量，对肿瘤组织起到很好的保护作用，该保存运输液能够维持其形态结构和生物活性，延长肿瘤组织在体外的保存时间，可以更好地保证肿瘤组织原代培养的成活率。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整的描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性的劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
以下实施例中所使用的乳腺癌肿瘤组织和肺癌肿瘤组织取自宁夏银川，上海，张家口，北京和山西等地的30例乳腺癌和10例肺癌患者体内，术中冰冻病理报告证实为乳腺癌或肺癌。
实施例1-3一种肿瘤组织高活性保存运输液
表1
上述实施例1-3所述的肿瘤组织保存运输液的制备方法，具体包括以下步骤：
(1)首先将dmem培养液平均分成两部分；
(2)取一半dmem培养液中加入抗生素、氨基酸和生长因子，得到培养液a；
(3)取另一半dmem培养液加入山梨醇和胰岛素，得到培养液b；
(4)将步骤(2)中得到的培养液a和步骤(3)中得到的培养液b混合均匀，即得到高活性的肿瘤组织保存运输液。
将肿瘤组织保存于所述的肿瘤组织高活性保存运输液中的方法包括以下步骤：
s1、首先，将肿瘤组织高活性保存运输液，用粒径为0.2微米的过滤器过滤，除菌，得到过滤液；
s2、将步骤s1中得到的过滤液分装于15毫升的无菌塑料管中，每管含有过滤液6毫升，得到分装后的保存运输液；
s3、将步骤s2中分装后的保存运输液在-20摄氏度条件下长期保存，使用前在4摄氏度条件下解冻，并储存于4摄氏度条件中直至使用，即得到可使用的肿瘤组织的保存运输液；
s4、将新鲜手术或者穿刺标本用无菌pbs冲洗后，放入步骤s3中得到的肿瘤组织保存运输液中，冷链48小时内运送至检测中心，完成肿瘤组织的保存运输。
试验实施例
将相同体积的pbs缓冲液、dmem细胞培养液和本发明按照实施例1-3公开含量的成分制备的肿瘤组织保存运输液分成5组每组100管作为保存运输液保存运输肿瘤组织，运输时间为6小时，所保存的肿瘤组织等重。
所运输的肿瘤组织为5份来自于同一人乳腺癌肿瘤组织，运输到目的地后培养2-3周后观察肿瘤细胞的培养情况，并将其成活率进行比较，具体数据见下表2
需要指明的是，除了上述指出的不同以外，其他条件均相同。
表2利用各种保存运输液进行乳腺癌肿瘤组织的运输
由表2可知，乳腺癌肿瘤组织在保存运输液中保存时间为6小时。其结果为利用pbs缓冲液的运输后进行培养2-3周，乳腺癌肿瘤细胞株成活率为54％，利用dmem细胞培养液运输后进行培养2-3周，乳腺癌肿瘤细胞株的成活率为65％，而利用本发明提供的三种保存运输液运输后进行培养2-3周，乳腺癌肿瘤细胞株的成活率为分别高达98％、100％、99％，因此本发明提供的实施例1-3三种成分含量不同的保存运输液的成活率均显著高于前两种保存液。
为了进一步证明本发明提供的保存运输液适用于多种肿瘤组织的运输保存，将其用于肺癌肿瘤组织的运输，将相同体积的pbs缓冲液、dmem细胞培养液和本发明按照实施例1-3公开含量的成分制备的肿瘤组织保存运输液分成5组每组100管作为保存运输液保存运输肿瘤组织，运输时间为6小时，所保存的肿瘤组织等重。
所运输的肿瘤组织为5份来自于同一人肺癌肿瘤组织，运输到目的地后培养2-3周后观察肿瘤细胞的培养情况，并将其成活率进行比较，具体数据见下表3
需要指明的是，除了上述指出的不同以外，其他条件均相同。
表3利用各种保存运输液进行肺癌肿瘤组织的运输
由表3可知，肺癌肿瘤组织在保存运输液中保存时间为6小时。其结果为利用pbs缓冲液运输后进行培养2-3周，肺癌肿瘤细胞株成活率为50％，利用dmem细胞培养液运输后进行培养2-3周，肺癌肿瘤细胞株的成活率为58％，而利用本发明提供的三种保存运输液运输后进行培养2-3周，肺癌肿瘤细胞株的成活率分别高达95％、93％、95％，因此本发明提供的实施例1-3三种成分含量不同的保存运输液的成活率均显著高于前两种保存液。
由表2-3中提供的几组数据可以明显得出本发明制备的保存运输液可用于多种肿瘤组织的保存运输，并且可以保证细胞在6小时乳腺癌细胞株的成活率在98％以上，肺癌细胞株的成活率在95％以上。
实施例4-6一种肿瘤组织高活性保存运输液
表4
制备方法：除成分不同外，其他操作与步骤与实施例1-3相同。
运输方法：与实施例1-3相同。
试验实施例
将相同体积的pbs缓冲液、dmem细胞培养液和本发明按照实施例4-6公开含量的成分制备的肿瘤组织保存运输液分成5组每组100管作为保存运输液保存运输肿瘤组织，运输时间为12小时，所保存的肿瘤组织等重。
所使用的肿瘤组织为5份来自于同一人乳腺癌肿瘤组织，运输到目的地后培养2-3周后观察肿瘤细胞的培养情况，并将其成活率进行比较，具体数据见下表5
表5利用各种保存运输液进行乳腺癌肿瘤组织的运输
同上由表5可知，乳腺癌肿瘤在保存运输液中保存时间为12小时。其结果为利用pbs缓冲液的运输后进行培养2-3周，乳腺癌肿瘤细胞株的成活率为48％，利用dmem细胞培养液运输后进行培养2-3周，乳腺癌肿瘤细胞株的成活率为52％，而利用本发明提供的三种保存运输液运输后进行培养2-3周，乳腺癌肿瘤细胞株的成活率分别高达95％、97％、96％，因此本发明提供的实施例4-6三种成分含量不同的保存运输液的成活率均显著高于前两种保存液。
为了进一步证明本发明提供的保存运输液适用于多种肿瘤组织的运输保存，将其用于肺癌肿瘤组织的运输，将相同体积的pbs缓冲液、dmem细胞培养液和本发明按照实施例4-6公开含量的成分制备的肿瘤组织保存运输液分成5组每组100管作为保存运输液保存运输肿瘤组织，运输时间为12小时，所保存的肿瘤组织等重。
所运输的肿瘤组织为5份来自于同一人肺癌肿瘤组织，运输到目的地后培养2-3周后观察肿瘤细胞的培养情况，并将其成活率进行比较，具体数据见下表6
需要指明的是，除了上述指出的不同以外，其他条件均相同。
表6利用各种保存运输液进行肺癌肿瘤组织的运输
由表6可知，肺癌肿瘤在保存运输液中保存时间为12小时。其结果为利用pbs缓冲液的运输后进行培养2-3周，肺癌肿瘤细胞株的成活率为36％，利用dmem细胞培养液运输后进行培养2-3周，肺癌肿瘤细胞株成活率为41％，而利用本发明提供的三种保存运输液运输后进行培养2-3周，肺癌肿瘤细胞株成活率分别高达93％、94％、93％，因此本发明提供的实施例4-6三种成分含量不同的保存运输液的成活率均显著高于前两种保存液。
由表5-6中提供的几组数据可以明显得出本发明制备的保存运输液可用于多种肿瘤细胞的保存运输，并且可以保证细胞在12小时乳腺癌细胞株的成活率在95％以上，肺癌细胞株的成活率在93％以上。
实施例7-9一种肿瘤组织高活性保存运输液
表7
制备方法：除成分不同外，其他操作与步骤与实施例1-3相同。
运输方法：与实施例1-3相同。
试验实施例
将相同体积的pbs缓冲液、dmem细胞培养液和本发明按照实施例7-9公开含量的成分制备的肿瘤组织保存运输液分成5组每组100管作为保存运输液保存运输肿瘤组织，运输时间为48小时，所保存的肿瘤组织等重。
所运输的肿瘤组织为5份来自于同一人乳腺癌肿瘤组织，运输到目的地后培养2-3周后观察肿瘤细胞的培养情况，并将其成活率进行比较，具体数据见下表8
表8利用各种保存运输液进行乳腺癌肿瘤组织的运输
由表8可知，乳腺癌肿瘤在保存运输液中保存时间为48小时以内。其结果为利用pbs缓冲液的运输后进行培养2-3周，乳腺癌肿瘤细胞株的成活率为24％，利用dmem细胞培养液运输后进行培养2-3周，乳腺癌肿瘤细胞株的成活率为36％，而利用本发明提供的三种保存运输液运输后进行培养2-3周，乳腺癌肿瘤细胞株的成活率分别高达94％、96％、95％，因此本发明提供的实施例7-9三种成分含量不同的保存运输液的成活率均显著高于前两种保存液。
为了进一步证明本发明提供的保存运输液适用于多种肿瘤组织的运输保存，将其用于肺癌肿瘤细胞的运输，将相同体积的pbs缓冲液、dmem细胞培养液和本发明按照实施例7-9公开含量的成分制备的肿瘤组织保存运输液分成5组每组100管作为保存运输液保存运输肿瘤组织，运输时间为48小时，所保存的肿瘤组织等重。
所运输的肿瘤组织为5份来自于同一人肺癌肿瘤组织，运输到目的地后培养2-3周后观察肿瘤细胞的培养情况，并将其成活率进行比较，具体数据见下表9
需要指明的是，除了上述指出的不同以外，其他条件均相同。
表9利用各种保存运输液进行肺癌肿瘤组织的运输
由表9可知，肺癌肿瘤组织在保存运输液中保存时间为48小时以内。其结果为利用pbs缓冲液的运输后进行培养2-3周，肺癌肿瘤细胞株的成活率为22％，利用dmem细胞培养液运输后进行培养2-3周，肺癌肿瘤细胞株的成活率为34％，而利用本发明提供的三种保存运输液运输后进行培养2-3周，肺癌肿瘤细胞株的成活率分别高达92％、90％、92％，因此本发明提供的实施例7-9三种成分含量不同的保存运输液的成活率均显著高于前两种保存液。
由表8-9中提供的几组数据可以明显得出本发明制备的保存运输液可用于多种肿瘤细胞的保存运输，并且可以保证细胞在12小时乳腺癌细胞株的成活率在94％以上，肺癌细胞株的成活率在92％以上。
即从上述检测结果可以看出使用本发明提供的肿瘤组织保存运输液，进行肿瘤细胞的保存，即使长时间运输(48小时以内)肿瘤细胞依然可以保持很高的成活率。
对比实施例1-3一种肿瘤组织高活性保存运输液
表10
上述对比实施例1-3与实施例7的区别在于：对比实施例1中没有加庆大霉素，对比实施例2中没有加γ-氨基丁酸，环丝氨酸和脯氨酸，对比实施例3中山梨醇和胰岛素的浓度比为50000∶1，对比实施例4中γ-氨基丁酸，环丝氨酸和脯氨酸的浓度比为4∶1∶12。
试验实施例
将相同体积本发明按照实施例7和对比实施例1-4公开含量的成分制备的肿瘤组织保存运输液分成5组每组100管作为保存运输液保存运输肿瘤组织，运输时间为48小时，所保存的肿瘤组织等重。
所运输的肿瘤组织为5份来自于同一人乳腺癌肿瘤组织，运输到目的地后培养2-3周后观察肿瘤细胞的培养情况，并将其成活率进行比较，具体数据见下表11
表11利用各种保存运输液进行乳腺癌肿瘤细胞的运输
由表11可知，乳腺癌肿瘤组织在保存运输液中保存时间为48小时以内。其结果为利用实施例7公开含量的成分制备的肿瘤组织保存运输液的运输后进行培养2-3周，乳腺癌肿瘤细胞株的成活率为92％，利用对比实施例1-4提供的三种保存运输液运输后进行培养2-3周，乳腺癌肿瘤细胞株的成活率分别为70％、72％、81％、85％，因此对比实施例1-4三种成分含量不同的保存运输液的成活率均显著低于实施例7公开含量的成分制备的肿瘤组织保存运输液。
以上所述仅为本发明的实施例，并非因此限制本发明的专利范围，凡是利用本发明说明书内容所作的等效结构或等效流程变换，或直接或间接运用在其他相关的技术领域，均同理包括在本发明的专利保护范围内。