一种降低彩纹秋海棠叶片组织培养褐化率的方法与流程

本发明属于植物组织培养技术领域，具体涉及一种降低彩纹秋海棠叶片组织培养褐化率的方法。

背景技术

彩纹秋海棠（begoniamasoniana）为秋海棠科秋海棠属多年生常绿草本植物，叶卵形，表面有皱纹和刺毛，黄绿色叶面中央嵌有红褐色的马蹄形环带，十分秀丽，是秋海棠中较为名贵的品种。然而，作为秋海棠属植物的一种，其种子不易获得，有性繁殖能力弱，且后代多变异，优良性状难以保持。植物组织培养技术作为当代新兴的生物技术方法之一，具有繁殖系数高、遗传性状稳定、不受季节限制等诸多优点，因而十分适用于优秀观赏植物的推广繁殖，目前已广泛应用于马蹄莲、兰花、菊花、月季等观赏植物的再生产，秋海棠属植物中也有许多品种组培成功。但关于彩纹海棠组织培养的报道较少，而且常规的组织培养存在着严重的褐化问题，严重限制了彩纹秋海棠的组织培养效率。因此，褐化能否得到有效控制是彩纹秋海棠组织培养成功与否的关键所在。

技术实现要素：

本发明的目的是为了解决现有技术的不足，提供一种降低彩纹秋海棠叶片组织培养褐化率的方法，通过该种方法可以对彩纹秋海棠组织培养过程中出现的褐化问题进行改善，提高存活率，从而顺利诱导出丛生芽。

为实现上述目的，本发明采用的技术方案如下：

一种降低彩纹秋海棠叶片组织培养褐化率的方法，包括如下步骤：

步骤（1），冷藏保存处理：将新鲜的彩纹秋海棠幼嫩叶片在4℃冰箱冷藏保存1~2d；

步骤（2），外植体消毒与处理：将步骤（1）处理的幼嫩叶片用洗衣粉水洗净后，先用体积浓度为70%~75%的酒精浸泡20~30s，再用质量浓度为0.1%~0.15%hgcl2溶液处理5~8min，接着用无菌水漂洗多次；然后在无菌条件下用无菌滤纸吸去水分，之后把叶片切成叶盘；

步骤（3），暗培养：将步骤（2）得到的叶盘背面划伤口，叶片背面朝下接种初代培养基中，置于黑暗条件下培养5d，培养温度23±2℃；

步骤（4），半黑暗培养：将步骤（3）的培养物转接至新的初代培养基中，然后放入纸箱中，盖紧纸箱，在纸箱两侧各切开一条透光缝隙，保证有散射光进入纸箱内，但要避免光直射；将纸箱置于光照培养室内，培养温度23±2℃，光照时间10~12h/d，光照强度2000~3000lx；每5~7d更换一次新的初代培养基，持续转接3~5次；

步骤（5），光培养：将步骤（4）的培养物接种至不定芽诱导培养基中，撤去纸箱，直接放置于培养架上进行光照培养，培养温度为23±2℃，光照强度为2000~3000lx，光照时间为10~12h/d；每20~30d继代一次，即可获得不定芽；

初代培养基为ms培养基，培养基中添加0.5mg/l6-ba、0.1mg/lnaa、30g/l蔗糖、6.5g/l琼脂和2.0g/l活性炭，ph5.8，高温灭菌冷却至室温后待用；

不定芽诱导培养基为ms培养基，培养基中添加0.5mg/l6-ba、0.1mg/lnaa、30g/l蔗糖、6.5g/l琼脂、2.0g/l活性炭、80mg/lvc，ph5.8，高温灭菌冷却至室温后待用。

进一步，优选的是，步骤（2）中，所述的无菌水漂洗多次为3~5次。

进一步，优选的是，步骤（2）中，每次漂洗2min。

进一步，优选的是，步骤（2）中，叶盘大小为1.8~2.2cm²。

进一步，优选的是，步骤（4）中，每侧缝隙的宽度为4.8~5.2cm。

进一步，优选的是，步骤（4）中，所述的纸箱为牛皮纸箱。

本发明与现有技术相比，其有益效果为：

通过对新鲜彩纹秋海棠幼嫩叶片进行接种前冷藏保存处理，保证了彩纹秋海棠叶片的诱导率且降低其污染率及褐化率；通过酒精和升汞消毒灭菌，降低了初代培养的污染率及褐化率并保证其诱导率；采用组织培养中不同光照培养方式结合不断转瓶处理（即先暗培养→半黑暗培养→光培养，并且每5~7d转接一次），能够降低80%~90%的褐化率，从而有效防止甚至消除彩纹秋海棠褐化，并在一定程度上提高其诱导率，促进植物的生长。本发明方法与已有的降低褐变的物质相比，无需增加专用设备，使用浓度小，成本低，操作简便。

附图说明

图1为通过本发明方法获得的彩纹秋海棠不定芽图；

图2为通过本发明不定芽诱导获得的彩纹秋海棠完整植株图。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明作进一步的详细描述。

本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限定本发明的范围。实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。所用材料或设备未注明生产厂商者，均为可以通过购买获得的常规产品。

实施例1

一种降低彩纹秋海棠叶片组织培养褐化率的方法，包括如下步骤：

步骤（1），冷藏保存处理：将新鲜的彩纹秋海棠幼嫩叶片在4℃冰箱冷藏保存1d；

步骤（2），外植体消毒与处理：将步骤（1）处理的幼嫩叶片用洗衣粉水洗净后，先用体积浓度为75%的酒精浸泡30s，再用质量浓度为0.1%hgcl2溶液处理5min，接着用无菌水漂洗3次；然后在无菌条件下用无菌滤纸吸去水分，之后把叶片切成2cm²大小的叶盘；

步骤（3），暗培养：将步骤（2）得到的叶盘背面划伤口，叶片背面朝下接种初代培养基中，置于黑暗条件下培养5d，培养温度23±2℃；

步骤（4），半黑暗培养：将步骤（3）的培养物转接至新的初代培养基中，然后放入牛皮纸箱中，盖紧纸箱，在纸箱两侧各切开一条透光缝隙，保证有散射光进入纸箱内，但要避免光直射，每侧缝隙的宽度为5cm；将纸箱置于光照培养室内，培养温度23±2℃，光照时间10~12h/d，光照强度2000~3000lx；每5d更换一次新的初代培养基，持续转接3次；

步骤（5），光培养：将步骤（4）的培养物接种至不定芽诱导培养基中，撤去牛皮纸箱，直接放置于培养架上进行光照培养，培养温度为23±2℃，光照强度为2000~3000lx，光照时间为10~12h/d；每20d继代一次，即可获得不定芽；

初代培养基为ms培养基，培养基中添加0.5mg/l6-ba、0.1mg/lnaa、30g/l蔗糖、6.5g/l琼脂和2.0g/l活性炭，ph5.8，高温灭菌冷却至室温后待用；

不定芽诱导培养基为ms培养基，培养基中添加0.5mg/l6-ba、0.1mg/lnaa、30g/l蔗糖、6.5g/l琼脂、2.0g/l活性炭、80mg/lvc，ph5.8，高温灭菌冷却至室温后待用。

实施例2：

一种降低彩纹秋海棠叶片组织培养褐化率的方法，包括如下步骤：

步骤（1），冷藏保存处理：将新鲜的彩纹秋海棠幼嫩叶片在4℃冰箱冷藏保存2d；

步骤（2），外植体消毒与处理：将步骤（1）处理的幼嫩叶片用洗衣粉水洗净后，先用体积浓度为75%的酒精浸泡30s，再用质量浓度为0.1%hgcl2溶液处理8min，接着用无菌水漂洗3次，每次漂洗2min；然后在无菌条件下用无菌滤纸吸去水分，之后把叶片切成2cm²大小的叶盘；

步骤（3），暗培养：将步骤（2）得到的叶盘背面划伤口，叶片背面朝下接种初代培养基中，置于黑暗条件下培养5d，培养温度23±2℃；

步骤（4），半黑暗培养：将步骤（3）的培养物转接至新的初代培养基中，然后放入牛皮纸箱中，盖紧纸箱，在纸箱两侧各切开一条透光缝隙，保证有散射光进入纸箱内，但要避免光直射，每侧缝隙的宽度为5cm；将纸箱置于光照培养室内，培养温度23±2℃，光照时间10~12h/d，光照强度2000~3000lx；每5d更换一次新的初代培养基，持续转接5次；

步骤（5），光培养：将步骤（4）的培养物接种至不定芽诱导培养基中，撤去牛皮纸箱，直接放置于培养架上进行光照培养，培养温度为23±2℃，光照强度为2000~3000lx，光照时间为10~12h/d；每25d继代一次，即可获得不定芽；

初代培养基为ms培养基，培养基中添加0.5mg/l6-ba、0.1mg/lnaa、30g/l蔗糖、6.5g/l琼脂和2.0g/l活性炭，ph5.8，高温灭菌冷却至室温后待用；

不定芽诱导培养基为ms培养基，培养基中添加0.5mg/l6-ba、0.1mg/lnaa、30g/l蔗糖、6.5g/l琼脂、2.0g/l活性炭、80mg/lvc，ph5.8，高温灭菌冷却至室温后待用。

实施例3

一种降低彩纹秋海棠叶片组织培养褐化率的方法，包括如下步骤：

步骤（1），冷藏保存处理：将新鲜的彩纹秋海棠幼嫩叶片在4℃冰箱冷藏保存1d；

步骤（2），外植体消毒与处理：将步骤（1）处理的幼嫩叶片用洗衣粉水洗净后，先用体积浓度为70%的酒精浸泡20s，再用质量浓度为0.1%hgcl2溶液处理5min，接着用无菌水漂洗3次，每次漂洗2min；然后在无菌条件下用无菌滤纸吸去水分，之后把叶片切成1.8cm²大小的叶盘；

步骤（3），暗培养：将步骤（2）得到的叶盘背面划伤口，叶片背面朝下接种初代培养基中，置于黑暗条件下培养5d，培养温度23±2℃；

步骤（4），半黑暗培养：将步骤（3）的培养物转接至新的初代培养基中，然后放入牛皮纸箱中，盖紧纸箱，在纸箱两侧各切开一条透光缝隙，保证有散射光进入纸箱内，但要避免光直射，每侧缝隙的宽度为4.8cm；将纸箱置于光照培养室内，培养温度23±2℃，光照时间10h/d，光照强度2000~2200lx；每5d更换一次新的初代培养基，持续转接3次；

步骤（5），光培养：将步骤（4）的培养物接种至不定芽诱导培养基中，撤去牛皮纸箱，直接放置于培养架上进行光照培养，培养温度为23±2℃，光照强度为2000~2200lx，光照时间为10h/d；每20d继代一次，即可获得不定芽；

初代培养基为ms培养基，培养基中添加0.5mg/l6-ba、0.1mg/lnaa、30g/l蔗糖、6.5g/l琼脂和2.0g/l活性炭，ph5.8，高温灭菌冷却至室温后待用；

不定芽诱导培养基为ms培养基，培养基中添加0.5mg/l6-ba、0.1mg/lnaa、30g/l蔗糖、6.5g/l琼脂、2.0g/l活性炭、80mg/lvc，ph5.8，高温灭菌冷却至室温后待用。

实施例4

一种降低彩纹秋海棠叶片组织培养褐化率的方法，包括如下步骤：

步骤（1），冷藏保存处理：将新鲜的彩纹秋海棠幼嫩叶片在4℃冰箱冷藏保存2d；

步骤（2），外植体消毒与处理：将步骤（1）处理的幼嫩叶片用洗衣粉水洗净后，先用体积浓度为75%的酒精浸泡30s，再用质量浓度为0.15%hgcl2溶液处理8min，接着用无菌水漂洗5次，每次漂洗2min；然后在无菌条件下用无菌滤纸吸去水分，之后把叶片切成2.2cm²大小的叶盘；

步骤（3），暗培养：将步骤（2）得到的叶盘背面划伤口，叶片背面朝下接种初代培养基中，置于黑暗条件下培养5d，培养温度23±1℃；

步骤（4），半黑暗培养：将步骤（3）的培养物转接至新的初代培养基中，然后放入牛皮纸箱中，盖紧纸箱，在纸箱两侧各切开一条透光缝隙，保证有散射光进入纸箱内，但要避免光直射，每侧缝隙的宽度为4.8~5.2cm；将纸箱置于光照培养室内，培养温度23±1℃，光照时间12h/d，光照强度2800~3000lx；每7d更换一次新的初代培养基，持续转接5次；

步骤（5），光培养：将步骤（4）的培养物接种至不定芽诱导培养基中，撤去牛皮纸箱，直接放置于培养架上进行光照培养，培养温度为23±1℃，光照强度为2800~3000lx，光照时间为12h/d；每30d继代一次，即可获得不定芽；

初代培养基为ms培养基，培养基中添加0.5mg/l6-ba、0.1mg/lnaa、30g/l蔗糖、6.5g/l琼脂和2.0g/l活性炭，ph5.8，高温灭菌冷却至室温后待用；

不定芽诱导培养基为ms培养基，培养基中添加0.5mg/l6-ba、0.1mg/lnaa、30g/l蔗糖、6.5g/l琼脂、2.0g/l活性炭、80mg/lvc，ph5.8，高温灭菌冷却至室温后待用。

实施例5

一种降低彩纹秋海棠叶片组织培养褐化率的方法，包括如下步骤：

步骤（1），冷藏保存处理：将新鲜的彩纹秋海棠幼嫩叶片在4℃冰箱冷藏保存1.5d；

步骤（2），外植体消毒与处理：将步骤（1）处理的幼嫩叶片用洗衣粉水洗净后，先用体积浓度为72%的酒精浸泡25s，再用质量浓度为0.12%hgcl2溶液处理7min，接着用无菌水漂洗4次，每次漂洗2min；然后在无菌条件下用无菌滤纸吸去水分，之后把叶片切成2cm²大小的叶盘；

步骤（3），暗培养：将步骤（2）得到的叶盘背面划伤口，叶片背面朝下接种初代培养基中，置于黑暗条件下培养5d，培养温度23±0.5℃；

步骤（4），半黑暗培养：将步骤（3）的培养物转接至新的初代培养基中，然后放入牛皮纸箱中，盖紧纸箱，在纸箱两侧各切开一条透光缝隙，保证有散射光进入纸箱内，但要避免光直射，每侧缝隙的宽度为5cm；将纸箱置于光照培养室内，培养温度23±0.5℃，光照时间11h/d，光照强度2300~2600lx；每6d更换一次新的初代培养基，持续转接4次；

步骤（5），光培养：将步骤（4）的培养物接种至不定芽诱导培养基中，撤去牛皮纸箱，直接放置于培养架上进行光照培养，培养温度为23±0.5℃，光照强度为2300~2600lx，光照时间为11h/d；每25d继代一次，即可获得不定芽；

初代培养基为ms培养基，培养基中添加0.5mg/l6-ba、0.1mg/lnaa、30g/l蔗糖、6.5g/l琼脂和2.0g/l活性炭，ph5.8，高温灭菌冷却至室温后待用；

不定芽诱导培养基为ms培养基，培养基中添加0.5mg/l6-ba、0.1mg/lnaa、30g/l蔗糖、6.5g/l琼脂、2.0g/l活性炭、80mg/lvc，ph5.8，高温灭菌冷却至室温后待用。

对照例1：

将新鲜的彩纹秋海棠幼嫩叶片用洗衣粉水洗净后，用75%酒精浸泡30s，再用0.1%hgcl2处理6min，用无菌水漂洗5次，每次2min。然后在无菌条件下用无菌滤纸吸去水分，确保无残留水分后，把叶片切成2cm²大的小块叶盘，并在叶盘背面划伤口，叶片背面朝下接种至初代培养基（ms+0.5mg/l6-ba+0.1mg/lnaa+30g/l蔗糖+6.5g/l琼脂+2.0g/l活性炭，ph5.8）中。进行常规的光照培养，培养温度为23±2℃、光照强度为2000～3000lx，光照时间为10～12h/d。每5d继代一次。

对照例2：

（1）将新鲜的彩纹秋海棠幼嫩叶片在4℃冰箱冷藏保存2d；

（2）将步骤（1）处理的幼嫩叶片用洗衣粉水洗净后，用75%酒精浸泡30s，再用0.1%hgcl2处理8min，用无菌水漂洗3次，每次2min。然后在无菌条件下用无菌滤纸吸去水分，确保无残留水分后，把叶片切成2cm²大的小块叶盘，并在叶盘背面划伤口，叶片背面朝下接种至不定芽诱导培养基（ms+0.5mg/l6-ba+0.1mg/lnaa+30g/l蔗糖+6.5g/l琼脂+2.0g/l活性炭+80mg/lvc，ph5.8）中。进行常规的光照培养，培养温度为23±2℃、光照强度为2000～3000lx，光照时间为10～12h/d。每5d继代一次。

对照例3：

将新鲜的彩纹秋海棠幼嫩叶片用洗衣粉水洗净后，用75%酒精浸泡30s，再用0.1%hgcl2处理8min，用无菌水漂洗5次，每次2min。然后在无菌条件下用无菌滤纸吸去水分，确保无残留水分后，把叶片切成约2cm²大的小块叶盘，并在叶盘背面划伤口，叶片背面朝下接种至初代培养基（ms+0.5mg/l6-ba+0.1mg/lnaa+30g/l蔗糖+6.5g/l琼脂+2.0g/l活性炭，ph5.8）中。进行常规的光照培养，培养温度为23±2℃、光照强度为2000～3000lx，光照时间为10～12h/d。30d后进行观察。

对照例4：

对照例4与实施例2的区别在于，无半黑暗培养步骤，其余皆相同。具体为：

一种降低彩纹秋海棠叶片组织培养褐化率的方法，包括如下步骤：

步骤（1），冷藏保存处理：将新鲜的彩纹秋海棠幼嫩叶片在4℃冰箱冷藏保存2d；

步骤（2），外植体消毒与处理：将步骤（1）处理的幼嫩叶片用洗衣粉水洗净后，先用体积浓度为75%的酒精浸泡30s，再用质量浓度为0.1%hgcl2溶液处理8min，接着用无菌水漂洗3次，每次漂洗2min；然后在无菌条件下用无菌滤纸吸去水分，之后把叶片切成2cm²大小的叶盘；

步骤（3），暗培养：将步骤（2）得到的叶盘背面划伤口，叶片背面朝下接种初代培养基中，置于黑暗条件下培养5d，培养温度23±2℃；

步骤（4），光培养：将步骤（3）的培养物接种至不定芽诱导培养基中，撤去牛皮纸箱，直接放置于培养架上进行光照培养，培养温度为23±2℃，光照强度为2000~3000lx，光照时间为10~12h/d；每25d继代一次，即可获得不定芽；

初代培养基为ms培养基，培养基中添加0.5mg/l6-ba、0.1mg/lnaa、30g/l蔗糖、6.5g/l琼脂和2.0g/l活性炭，ph5.8，高温灭菌冷却至室温后待用；

不定芽诱导培养基为ms培养基，培养基中添加0.5mg/l6-ba、0.1mg/lnaa、30g/l蔗糖、6.5g/l琼脂、2.0g/l活性炭、80mg/lvc，ph5.8，高温灭菌冷却至室温后待用。

对照例5：

对照例4与实施例2的区别在于，无暗培养步骤，其余皆相同。具体为：

一种降低彩纹秋海棠叶片组织培养褐化率的方法，包括如下步骤：

步骤（1），冷藏保存处理：将新鲜的彩纹秋海棠幼嫩叶片在4℃冰箱冷藏保存2d；

步骤（2），外植体消毒与处理：将步骤（1）处理的幼嫩叶片用洗衣粉水洗净后，先用体积浓度为75%的酒精浸泡30s，再用质量浓度为0.1%hgcl2溶液处理8min，接着用无菌水漂洗3次，每次漂洗2min；然后在无菌条件下用无菌滤纸吸去水分，之后把叶片切成2cm²大小的叶盘；

步骤（3），暗培养：将步骤（2）得到的叶盘背面划伤口，叶片背面朝下接种初代培养基中，然后放入牛皮纸箱中，盖紧纸箱，在纸箱两侧各切开一条透光缝隙，保证有散射光进入纸箱内，但要避免光直射，每侧缝隙的宽度为5cm；将纸箱置于光照培养室内，培养温度23±2℃，光照时间10~12h/d，光照强度2000~3000lx；每5d更换一次新的初代培养基，持续转接5次；

步骤（4），光培养：将步骤（3）的培养物接种至不定芽诱导培养基中，撤去牛皮纸箱，直接放置于培养架上进行光照培养，培养温度为23±2℃，光照强度为2000~3000lx，光照时间为10~12h/d；每25d继代一次，即可获得不定芽；

初代培养基为ms培养基，培养基中添加0.5mg/l6-ba、0.1mg/lnaa、30g/l蔗糖、6.5g/l琼脂和2.0g/l活性炭，ph5.8，高温灭菌冷却至室温后待用；

不定芽诱导培养基为ms培养基，培养基中添加0.5mg/l6-ba、0.1mg/lnaa、30g/l蔗糖、6.5g/l琼脂、2.0g/l活性炭、80mg/lvc，ph5.8，高温灭菌冷却至室温后待用。

对照例6：

对照例4与实施例2的区别在于，基础培养基采用dmem培养基，其余皆相同。具体如下：

一种降低彩纹秋海棠叶片组织培养褐化率的方法，包括如下步骤：

步骤（1），冷藏保存处理：将新鲜的彩纹秋海棠幼嫩叶片在4℃冰箱冷藏保存2d；

步骤（2），外植体消毒与处理：将步骤（1）处理的幼嫩叶片用洗衣粉水洗净后，先用体积浓度为75%的酒精浸泡30s，再用质量浓度为0.1%hgcl2溶液处理8min，接着用无菌水漂洗3次，每次漂洗2min；然后在无菌条件下用无菌滤纸吸去水分，之后把叶片切成2cm²大小的叶盘；

步骤（3），暗培养：将步骤（2）得到的叶盘背面划伤口，叶片背面朝下接种初代培养基中，置于黑暗条件下培养5d，培养温度23±2℃；

步骤（4），半黑暗培养：将步骤（3）的培养物转接至新的初代培养基中，然后放入牛皮纸箱中，盖紧纸箱，在纸箱两侧各切开一条透光缝隙，保证有散射光进入纸箱内，但要避免光直射，每侧缝隙的宽度为5cm；将纸箱置于光照培养室内，培养温度23±2℃，光照时间10~12h/d，光照强度2000~3000lx；每5d更换一次新的初代培养基，持续转接5次；

步骤（5），光培养：将步骤（4）的培养物接种至不定芽诱导培养基中，撤去牛皮纸箱，直接放置于培养架上进行光照培养，培养温度为23±2℃，光照强度为2000~3000lx，光照时间为10~12h/d；每25d继代一次，即可获得不定芽；

初代培养基为dmem培养基，培养基中添加0.5mg/l6-ba、0.1mg/lnaa、30g/l蔗糖、6.5g/l琼脂和2.0g/l活性炭，ph5.8，高温灭菌冷却至室温后待用；

不定芽诱导培养基为dmem培养基，培养基中添加0.5mg/l6-ba、0.1mg/lnaa、30g/l蔗糖、6.5g/l琼脂、2.0g/l活性炭、80mg/lvc，ph5.8，高温灭菌冷却至室温后待用。

以上实施例及对照例每组处理30片叶片，经过约1个月培养，观察记录彩纹秋海棠植株褐化率及诱导率，结果如表1。

表1不同培养方式对彩纹秋海棠褐化率及诱导率的影响。

对比分析了不同培养方法，包括：本专利培养方法（暗培养→光培养方法）、常规培养方法（光培养方法），对彩纹秋海棠褐化率及诱导率的影响。结果显示：本发明培养方法的褐化率明显低于对照例培养方法，而诱导率显著高于对照例培养方法。综合数据分析，使用本发明培养方法明显优于常规培养方法。

以上显示和描述了本发明的基本原理、主要特征和本发明的优点。本行业的技术人员应该了解，本发明不受上述实施例的限制，上述实施例和说明书中描述的只是说明本发明的原理，在不脱离本发明精神和范围的前提下，本发明还会有各种变化和改进，这些变化和改进都落入要求保护的本发明范围内。本发明要求保护范围由所附的权利要求书及其等效物界定。