一种无菌条件下牡丹胚高效生根的方法与流程

本发明属于植物生根技术领域，具体而言，涉及一种牡丹无菌生根的方法，尤其涉及一种无菌条件下牡丹胚高效生根的方法。

背景技术：

牡丹(paeoniasuffruticosa)是属于芍药科(paeoniaceae)芍药属(paeonia)的一种多年生灌木植物，是世界著名花卉，也是中国十大名花之一，具有较高的观赏价值，同时兼具药用和油用价值。其中，油用牡丹是指种籽含油率较高(大于或等于22％)的一类牡丹的总称，以其压榨的牡丹籽油富含不饱和脂肪酸，且α-亚麻酸含量高达42％，被称为“液体黄金”。油用牡丹耐干旱，能够种植在非耕性的荒山荒坡上，同时在水土保持，防风固沙，改善土壤品质等方面具有重要作用，因此也具有较广阔的推广应用前景。目前，油用牡丹已经具备一定的种植规模，但事实上该产业的经济效益和前景并不乐观，主要原因在于牡丹应用和基础方面的研究不够深入，科技创新性较低，不能为产业发展提供有效服务。

农业生产上普遍采用播种方法对牡丹进行育苗和良种扩繁，但是牡丹种子存在基因杂合度高以及生根困难等问题。由于牡丹种子存在胚休眠现象，通常需要3个月左右才能萌发生根，成苗则需要更长的时间；在其它植物中普遍采用组培快繁技术进行扩繁的方法，在油用牡丹中上尚未成熟，主要原因在于缺乏合适的外植体，消毒后的外植体在后续培养中表现出褐化率高、污染率高和诱导率低等问题，严重影响着油用牡丹的育种周期及产业发展。如果能够在无菌条件下，实现牡丹胚的高效生根，将为组织培养提供合适的外植体，并可为相关研究(如根部的营养吸收规律、快速成苗)提供可供的研究体系和材料。到目前为止，现有技术还未针对无菌条件下，油用牡丹胚生根的问题提出简单有效的处理方法，然而该方法对于油用牡丹的深入研究和产业化开发具有重要的现实意义。

通过检索国内外现有技术，目前尚未发现无菌条件下，通过温度控制与营养元素互作有效提高牡丹胚生根率和生根质量的简易方法。

技术实现要素：

鉴于现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种无菌条件下牡丹胚高效生根的方法，以克服生根率低和褐化率高的问题，从而填补无菌条件下牡丹胚生根技术的空白。

为了实现本发明的目的，发明人通过大量试验研究并不懈探索。本发明人首先考虑在培养基中加入激素打破牡丹胚休眠，促进其生根，但效果不太理想。例如：ba(苄氨基嘌呤，benzylaminopurine)能打破上胚轴休眠，但对下胚轴萌发有明显的抑制作用；naa(萘乙酸，naphthlceticacid)能诱导愈伤，iaa(吲哚-3-乙酸，indole-3-aceticacid)能促进胚膨大，但都不利于生根；ga(赤霉素，gibberellin)能打破上下胚轴的休眠，但根较为细弱。大量的试验后发现，在‘凤丹’中使用激素后最优的生根率仅仅约为90％，与其它品种中的100％的生根率还有较大差距。

令人意外的是，试验研究过程中发现一个不添加激素的对照组，却表现出非常理想的生根率，进一步的研究中发现，特定的培养温度与钙可以有效互作，从而协同促进牡丹胚的高效生根。因此本发明人另辟蹊径，最终获得了如下技术方案：一种无菌条件下牡丹胚高效生根的方法，该方法包括如下步骤：

(1)选取花后100～150d的牡丹种子；

(2)将牡丹种子用流水冲洗干净后，置入杀菌剂溶液中浸泡5～15min，蒸馏水冲洗，再置入400～600mg·l^-1的ga溶液中浸泡15～30h，收集下沉种子，蒸馏水冲洗干净后置于无菌容器中；

(3)在无菌环境下，将种子消毒处理，然后采用无菌水清洗3～8次；

(4)将消毒好的种子平铺在无菌的放有3～5层滤纸的培养皿中，用无菌修枝剪沿种脐剪开种子，无菌镊子取出种脐处的胚，接入备好的无激素培养基中，所述的无激素培养基的组成为1/2ms+3～5mmca²⁺；每瓶接种6～8个胚，接种后进行静置培养，培养条件：培养温度16～18℃，黑暗培养。

进一步优选地，如上所述一种无菌条件下牡丹胚高效生根的方法，步骤(1)中选取花后100～110d的当年生牡丹种子。

进一步优选地，如上所述一种无菌条件下牡丹胚高效生根的方法，其中步骤(2)中所述的杀菌剂溶液为800倍的多菌灵，浸泡时间为15min。

进一步优选地，如上所述一种无菌条件下牡丹胚高效生根的方法，其中步骤(2)中ga溶液的浓度为500mg·l^-1，浸泡时间为24h。

进一步优选地，如上所述一种无菌条件下牡丹胚高效生根的方法，其中步骤(3)中所述的消毒处理为75％乙醇溶液消毒1～3min，2％次氯酸钠溶液消毒3～8min。

再进一步优选地，如上所述一种无菌条件下牡丹胚高效生根的方法，其中步骤(3)中所述的消毒处理为75％乙醇溶液消毒1min，2％次氯酸钠溶液消毒5min。

进一步优选地，如上所述一种无菌条件下牡丹胚高效生根的方法，其中步骤(4)中所述的修枝剪和镊子的灭菌方式为：紫外线照射25～35min，使用前用75％酒精擦拭并用酒精灯灭菌。

进一步优选地，如上所述一种无菌条件下牡丹胚高效生根的方法，其中步骤(4)中所述的无激素培养基的组成为1/2ms+5mmca²⁺，培养温度为17℃。

进一步优选地，如上所述一种无菌条件下牡丹胚高效生根的方法，其中所述的牡丹种子选自耐湿热的‘凤丹’种子。

与现有技术相比，本发明创造性地利用灭菌方式、钙添加量和培养温度提出一种无菌条件下牡丹高效生根的方法，该发明具有如下进步性和有益效果：

(1)能够在无菌条件下，实现牡丹胚的高效生根，将为组织培养提供合适的外植体，并可为相关研究(如根部的营养吸收规律)提供可控的研究体系和材料。

(2)首次发现特定的培养温度与钙可有效互作，协同促进牡丹胚的高效生根。该方法明确了牡丹胚生根所需的培养基及温度，整个过程简单高效、可操作性强，具有较大的推广应用前景。

附图说明

图1为温度对牡丹胚生根率的影响(a和b)及25℃下钙对牡丹胚生根率(c)和根长的影响(d)。

图2为17℃下钙对牡丹胚生根情况(a-c)、根长(d)和褐化率(e)的影响。

具体实施方式

无菌条件下，牡丹胚生根过程中存在褐化率高和生根率低等问题。而本发明创造性地通过无菌处理，研究钙添加量和温度因素对生根情况的协同作用，提出一种无菌条件下牡丹胚高效生根的方法，不仅降低了褐化率，还有效提高了生根率。该方法流程清晰，效率高，有较强的推广应用价值。以下实施例结合附图进一步描述本发明方法的实施过程和有益效果，实施例仅用于例证的目的，不限制本发明的范围，同时本领域普通技术人员根据本发明所做的显而易见的改变也包含在本发明范围之内。

实施例1：无菌条件下牡丹胚高效生根的方法

(1)选取花后100～150d的当年生牡丹种子；

(2)先将牡丹种子用流水冲洗干净，再加入800倍液多菌灵浸泡15min，用蒸馏水冲种子种残留的多菌灵后，加入500mg·l^-1的ga，浸泡24h后，收集下沉种子，用蒸馏水冲洗干净，置于无菌三角瓶中；

(3)在超净工作台上，将种子用75％(v/v)的乙醇消毒1min，2％(w/w)次氯酸钠溶液消毒5min，无菌水清洗5次，每次1min。整个过程需要不断摇动三角瓶，提高消毒效率。

(4)将消毒好的种子平铺在无菌的放有3～5层滤纸的培养皿中，用修枝剪沿种脐方向解剖种子，利用尖头镊子取出离体胚，接入含有不同钙浓度的1/2ms无激素培养基中，每瓶接种6～8个胚，置于17℃培养箱进行暗培养。

实施例2：无菌条件下牡丹胚高效生根的实验设计

本研究以耐湿热的‘凤丹’种子为实验材料，直接对种子进行短时灭菌后，获取离体胚并接种于修改的1/2ms培养基上(培养基成分及添加量如表1所示)。钙的添加浓度分别为0、5和20mm；培养温度为25℃和17℃。采用实施例1的试验步骤，试验结果如下：

表1无激素1/2ms基本培养基成分信息表

(1)不同培养温度对牡丹胚生根情况的影响

温度显著性影响了牡丹胚的生根率(图1a和b)，25℃条件下，牡丹胚的生根率在50％左右(图1a和c)，而17℃时，其生根率可达到100％(图1b)；温度也影响了根的伸长，胚培养25d后，25℃时较长根长约为2.9cm(图1d)，而17℃时，其较长根长可长达6.2cm(图2a-d)。

(2)钙对牡丹胚生根情况的影响

除温度外，不同的钙添加量也影响了牡丹胚的生根：如25℃时，虽然牡丹胚的生根率较低(图1a)，但是随着钙浓度的增加其生根率也逐渐升高，从36.8％上升到61.7％(图1c)，根长也逐渐增长，从1.2cm逐渐增加到2.9cm(图1d)。17℃时，在低浓度钙与温度的有效互作下，其生根率、根长和褐化率等指标均得到了优化，尤其随着钙浓度从0mm增加到5mm，根长由3.5cm增加到6.5cm(图2d)，而褐化率由87.9％降低到了4.2％(图2e)。值得注意的是，17℃时，随着钙浓度从5mm增加到20mm，根长由6.5cm降低到5.9cm(图2d)，褐化率无明显变化(图2e)。依据上述情况，最终选择添加3～5mm钙的1/2ms无激素培养基作为首选，培养温度为16～18℃。