一种快速恢复Steinernemacarpocapsae感染期线虫的方法与流程

本发明属于昆虫病原线虫培养技术领域，具体的说，涉及一种快速恢复s.carpocapsae感染期线虫的方法。

背景技术：

昆虫病原斯氏属steinernema和异小杆属heterorhabditis线虫是国际上新型的高效生物杀虫剂（georgisetal.，2006），从二十世纪30年代开始就被用于害虫的防治（smart，1995），具有杀虫能力强，杀虫谱广，能主动搜索寄主，对人畜、环境安全等优点，易于大量培养及配制产品，并能与多种化学农药混用，对钻蛀及地下害虫有特效（kayaandgaugler1993；grewaletal.，2005；georgisetal.，2006；yanetal.，2013；颜珣等，2014）。

昆虫病原线虫的生活史起始于感染期幼虫（infectivejuveniles，ij）携带共生细菌进入寄主昆虫体内，感染期幼虫避开昆虫的免疫反应，在昆虫血淋巴内释放共生细菌（dowdsandpeters，2002）。共生细菌在昆虫血淋巴内增殖，杀死寄主昆虫，线虫取食共生细菌以繁殖。当昆虫体内营养耗尽，3龄耐受态感染期幼虫形成，在外界环境足够湿润且温度适宜时，感染期幼虫携带共生细菌离开寄主昆虫（brownandgaugler，1997），搜寻新的寄主。感染期幼虫是昆虫病原线虫生活史中唯一能自由存活的龄期，可使用普通的喷雾器进行施用以防治害虫。感染期幼虫能存活1到多个月，可进行产业化培养（wrightetal.，2005）。

感染期幼虫的恢复是液体培养流程中的关键。如果恢复率低，第一代成虫数量少，仅有少部分的共生细菌被取食，第一代成虫的后代则会因为营养充足不能发育成感染期幼虫，而形成成虫。由于此时培养液中的共生细菌质量较差，第二代成虫难以产生后代，所以这个具有两代成虫的培养过程中的感染期幼虫产量会比仅有一代成虫的培养过程中的感染期幼虫产量低（hiraoandehlers，2010），培养时间长，收获时培养液中有高比例的其他龄期的线虫，会缩短最终线虫产品的货架时间。

技术实现要素：

为了克服背景技术中存在的问题，本发明提供了一种快速恢复s.carpocapsae感染期线虫的方法，恢复率高，为高效快速的培养s.carpocapsae线虫提供条件。

为实现上述目的，本发明是通过如下技术方案实现的：

所述的快速恢复steinernemacarpocapsae感染期线虫的方法，具体包括以下步骤：

1）将柞蚕蛹血淋巴、海藻糖、鸡蛋黄、脱脂奶粉、n’s盐溶液和水进行调配、混匀，得到人工卵液；

2）将s.carpocapsae感染期幼虫接种到人工卵液中，待感染期幼虫恢复，收集恢复的线虫。

作为优选，人工卵液每9ml通过以下方法配制：将柞蚕蛹血淋巴3ml，无水海藻糖0.1g，鸡蛋黄2.5ml，脱脂奶粉0.1g，n’s盐溶液1ml和无菌水2.5ml混合均匀。

作为优选，每升n’s盐溶液的配方如下：nacl7.5g/升，kcl0.1g/升，cacl20.2g/升，nahco30.2g/升，余量为水。

作为优选，s.carpocapsae感染期幼虫为s.carpocapsaeall感染期幼虫。

恢复的感染期幼虫可以接种到液体或固体培养基中继续培养，从而可以获得商品化的s.carpocapsae感染期幼虫。

本发明的有益效果：

s.carpocapsae感染期幼虫在人工卵液中恢复较快，且比例较高，2d后恢复率已达85.24%，可应用本发明的方法快速高效的恢复s.carpocapsae感染期幼虫，从而为高效快速的培养s.carpocapsae线虫提供条件。

附图说明

图1是实施1与对比例1-2中线虫恢复情况对比图。

具体实施方式

为了使本发明的目的、技术方案和有益效果更加清楚，下面将对本发明的优选实施例进行详细的说明，以方便技术人员理解。

实施例1

1）昆虫病原线虫：s.carpocapsae，从大蜡螟虫尸中收集感染期幼虫（infectivejuveniles），过滤去除死虫，调整线虫浓度为1000ij/ml，15℃，100rpm保存备用。测定前在25℃左右的室温下将线虫浓度浓缩为20000ij/ml。

2）人工卵液的制备：将柞蚕蛹血淋巴3ml，无水海藻糖0.1g，鸡蛋黄2.5ml，脱脂奶粉0.1g，n’s盐溶液1ml和无菌水2.5ml混合均匀，-20℃保存备用（n’s盐溶液：将nacl7.5g，kcl0.1g，cacl20.2g，nahco30.2g加入到1000mlh2o中，121℃，10⁵kpa高压灭菌30min，室温保存备用）；

3）在384孔板的每个孔内加入4μl孵育液，每孔加入2μl浓度为20000ij/ml的线虫液（含约40条感染期线虫），进行恢复培养。

对比例1

步骤与实施例1相同，不同的是孵育液为柞蚕蛹血淋巴。

柞蚕蛹血淋巴的制备：剪开茧，取出柞蚕蛹，65℃水浴10min，75%酒精涂擦蛹表消毒后，在超净工作台内剪开蛹尾部，挤出收集血淋巴，-20℃保存备用；

对比例2

步骤与实施例1相同，不同的是孵育液为柞蚕蛹血淋巴水混合液。

柞蚕蛹血淋巴水混合液的制备：将柞蚕蛹血淋巴3ml和无菌水6ml混匀，现配现用。

对比例3

步骤与实施例1相同，不同的是孵育液为基础液。

基础液的制备：将无水海藻糖0.1g，鸡蛋黄2.5ml，脱脂奶粉0.1g，n’s盐溶液1ml和无菌水5.5ml混合均匀，-20℃保存备用（n’s盐溶液：将nacl7.5g，kcl0.1g，cacl20.2g，nahco30.2g加入到1000mlh2o中，121℃，10⁵kpa高压灭菌30min，室温保存备用）。

实验分析

每个取样时间6个孔，每天取样，连续取样2天，每种线虫每个处理42孔。在计数板内加入水，将每个孔的线虫吸取到计数板的每个孔内，镜检，记录每个孔内恢复的线虫数量。

s.carpocapsaeall在基础液中孵育七天，其恢复率为0。

s.carpocapsae感染期幼虫在3种孵育液（人工卵液、柞蚕蛹血淋巴、柞蚕蛹血淋巴水混合液）中的恢复情况见图1，s.carpocapsae感染期幼虫在人工卵液中恢复最快，且比例最高，2d后恢复率已达85.24%，略高于在柞蚕蛹血淋巴中的恢复率，在柞蚕蛹血淋巴水混合液中恢复率最低，仅为68.8%。

本发明的方法只需要少量的柞蚕蛹血淋巴与其他物质相配合，其达到的恢复效果可与纯柞蚕蛹血淋巴恢复效果相同，并且经试验证明，本发明的人工卵液在-20℃保存一个月，其效果与刚刚配制的效果一样好。

最后说明的是，以上优选实施例仅用于说明本发明的技术方案而非限制，尽管通过上述优选实施例已经对本发明进行了详细的描述，但本领域技术人员应当理解，可以在形式上和细节上对其作出各种各样的改变，而不偏离本发明权利要求书所限定的范围。