本发明涉及灵芝栽培领域，具体是在指一种提高灵芝中灵芝三萜含量的方法。
背景技术：
灵芝（ganodermalucidun）是我国传统名贵中药，早在东汉时期就被《神农本草经》列为上品，是滋补强壮、扶正培本，有久服轻身延年之功效的珍贵药品。现代药理学研究表明灵芝三萜类化合物是灵芝的主要活性成分，目前从子实体、菌丝体和发酵液中分离获得灵芝酸a、灵芝酸b、灵芝烯酸b、灵芝酸c等150多种灵芝三萜单体化合物，基本结构为羊毛甾烷四环三萜，具有杀灭肿瘤细胞、抗氧化、降血糖、保护肝脏、抗hiv-1病毒等多种生物学活性。
灵芝三萜是通过甲羟戊酸-异戊烯途径合成，乙酰辅酶a经过3-羟基3-甲基戊二酰coa合成酶（hmgs）、3-羟基3-甲基戊二酰coa还原酶（hmgr）、法尼基二磷酸合成酶（fps）等酶的催化形成法尼基二磷酸，再经角鲨烯合成酶（sqs）催化生成2,3-氧化角鲨烯，在环氧角鲨烯环化酶（osc）的催化下形成羊毛甾醇，再通过侧链修饰产生不同结构的灵芝三萜单体化合物。为了提高三萜类化合物的含量，专利cn105505800公开了“一种灵芝酸高产工程菌株kmust-fps”，选用灵芝强启动子p-gpd过表达编码法尼基焦磷酸合成酶fps基因，得到高产灵芝酸灵芝工程菌；专利cn101353689公开了“一种提高灵芝发酵液中灵芝三萜产量的方法”，通过补加棕榈酸1.5-3.0g/l，提高灵芝液体发酵生产灵芝三萜的含量；专利cn101892282公开了“一种利用稀土元素提高灵芝三萜产量的液体发酵方法”，在灵芝液体发酵培养基中补加稀土元素镨pr3+、钕nd3+或镧la3+，提高灵芝三萜的产量；专利cn104017852公开了“一种提高灵芝液体深层发酵菌丝体中灵芝三萜含量的方法”，在发酵培养过程中，添加1vol％-5vol％的油酸，提高灵芝菌丝体中灵芝三萜的含量；专利cn105506049公开了“一种提高灵芝菌丝体液体发酵的胞内灵芝三萜含量的方法”，在灵芝液体发酵扩大培养阶段，按照质量比例0.01-5％向培养液中添加木材降解物，培养时间1-6天，提高灵芝菌丝体液体发酵的胞内灵芝三萜含量，以上发明都是针对灵芝液体发酵过程中提高灵芝菌丝体合成灵芝三萜的水平。在灵芝固体栽培方面，专利cn106431698公开了“提高灵芝三萜含量的培养基”，在灵芝栽培培养基中添加中药成分，包括胡荽25～45份、浮萍20～40份、芦根15～35份、椿皮10～20份、山豆根8～16份、海桐皮6～14份，能够显著提高灵芝三萜含量。
灵芝三萜作为灵芝中的关键活性成分，提高其生物合成及在灵芝子实体中的含量已成为灵芝研究的重要内容，但目前的研究多是针对灵芝液体发酵诱导物的添加、培养条件的优化及工程菌的构建，而液体发酵需要专门的装备、工艺复杂、无法获得灵芝子实体；在灵芝栽培方面主要也是通过在培养基质中添加中药等刺激物来提高三萜的含量，而且栽培时间较长，容易受到温度、湿度、光照等栽培环境条件的影响。
技术实现要素：
本发明的目的是为了克服现有技术存在的缺点和不足，而提供一种提高灵芝中灵芝三萜含量的方法。
本发明所采取的技术方案如下：一种提高灵芝中灵芝三萜含量的方法，将菌种经过菌种活化、原种制作、载培种制作、段木发菌、出芝管理，培养栽培得到成熟的灵芝子实体，将灵芝子实体置于氧浓度为25-85%的高浓度氧环境中保持1-5天。
本发明采用中国普通微生物菌种保藏管理委员会保藏的灵芝属ganodermalucidum菌种，菌株保藏号为cgmcc5.616。菌种的有关性质可以参阅中国普通微生物菌种保藏管理委员会(cgmcc)菌种目录。
通常情况下，空气中的氧浓度为21%，本发明将成熟期的灵芝子实体置于氧浓度为25-85%的高浓度氧环境中保持1-5天，通过高浓度氧的作用，可以诱导灵芝子实体合成灵芝三萜，显著提高灵芝三萜的含量。
优选地，将成熟期的灵芝子实体采用40-60%的高浓度氧处理2-4天。
更优选地：将成熟期的灵芝子实体采用60%的高浓度氧处理3天。
通过本发明的技术方案与现有技术相比，能够取得下列有益效果：
本发明提供一种提高灵芝中灵芝三萜含量的方法，在灵芝子实体成熟期采用高浓度氧来诱导灵芝产生更多的灵芝三萜，工艺简单，适合大规模应用。所使用的氧安全性高、容易制取并且价格低廉，可显著提高灵芝子实体中灵芝三萜的含量。
具体实施方式
实施例1
将成熟期的灵芝子实体，置于容器中，容器内通入浓度为40%的氧气，保持容器中氧气含量为40%，处理3天，取处理后的灵芝子实体测定，每克新鲜灵芝子实体中灵芝三萜的含量为4.03mg，灵芝酸a的含量为1.12mg，灵芝烯酸b含量为0.18mg、灵芝酸c2含量为0.17mg。
实施例2
将成熟期的灵芝子实体，置于容器中，容器内通入浓度为60%的氧气，保持容器中氧气含量为60%，处理3天，取处理后的灵芝子实体测定，每克新鲜灵芝子实体中灵芝三萜的含量为5.62mg，灵芝酸a的含量为1.77mg，灵芝烯酸b含量为0.41mg、灵芝酸c2含量为0.21mg。
实施例3
将成熟期的灵芝子实体，置于容器中，容器内通入浓度为80%的氧气，保持容器中氧气含量为80%，处理3天，取处理后的灵芝子实体测定，每克新鲜灵芝子实体中灵芝三萜的含量为3.89mg，灵芝酸a的含量为1.09mg，灵芝烯酸b含量为0.33mg、灵芝酸c2含量为0.16mg。
实施例4
将成熟期的灵芝子实体，置于容器中，容器内通入浓度为60%的氧气，保持容器中氧气含量为60%，处理4天，取处理后的灵芝子实体测定，每克新鲜灵芝子实体中灵芝三萜的含量为4.09mg，灵芝酸a的含量为1.22mg，灵芝烯酸b含量为0.22mg、灵芝酸c2含量为0.16mg。
实施例5
将成熟期的灵芝子实体，置于容器中，容器内通入浓度为60%的氧气，保持容器中氧气含量为60%，处理5天，取处理后的灵芝子实体测定，每克新鲜灵芝子实体中灵芝三萜的含量为2.51mg，灵芝酸a的含量为0.59mg，灵芝烯酸b含量为0.27mg、灵芝酸c2含量为0.15mg。
对比例1
将成熟期的灵芝子实体直接置于空气中放置3天，取样测定，每克新鲜灵芝子实体中灵芝三萜的含量为2.02mg，灵芝酸a的含量为0.64mg，灵芝烯酸b含量为0.16mg、灵芝酸c2含量为0.09mg。
对比例2
将成熟期的灵芝子实体，置于容器中，容器内通入压缩空气，保持容器中氧气含量为21%，处理3天，取处理后的灵芝子实体测定，每克新鲜灵芝子实体中灵芝三萜的含量为2.41mg，灵芝酸a的含量为0.64mg，灵芝烯酸b含量为0.16mg、灵芝酸c2含量为0.14mg。
由上述实施例和对比例的对比分析，可以得出以下结论：
①高浓度氧气处理灵芝子实体可以显著提高灵芝三萜的含量；
②氧气浓度和处理时间也会影响灵芝三萜的含量，最优为氧气含量为60%以及处理3天，相比在空气中放置的对比例1，灵芝三萜含量提高178.2%，效果显著，而再去提高氧气浓度或者增加处理时间则会降低。
检测实施例和对比例中灵芝三萜合成关键酶基因的表达情况，结果见表2。由表2可见，适量的高浓度氧气的处理会使灵芝中关键酶基因的表达量提高，故可以提高合成的灵芝三萜含量。60%浓度的氧气处理3天，3-羟基3-甲基戊二酰coa合成酶（hmgs）、3-羟基3-甲基戊二酰coa还原酶（hmgr）、法尼基二磷酸合成酶（fps）、角鲨烯合成酶（sqs）、环氧角鲨烯环化酶（osc）等酶基因的表达量均处于最高值，从而合成的灵芝三萜的量最大。
1.以上实施例及对比例中所采取的灵芝子实体通过以下方法得到：
采用的菌种为中国普通微生物菌种保藏管理委员会保藏的灵芝属ganodermalucidum菌种，菌株保藏号为cgmccno.5.616，公众可在中国普通微生物菌种保藏管理中心购买得到，菌种的有关性质可以参阅中国普通微生物菌种保藏管理委员会(cgmcc)菌种目录，本发明不再详述。将上述方法应用于目前市场上购买的其它常见灵芝属菌株，具有一定效果，但是效果不是很明显，而本发明采用的灵芝属ganodermalucidum菌种，则效果显著。
菌种活化：按照无菌操作规程，从原有母种中挑取带菌丝琼脂块，置于pda培养基中，于25-30℃避光培养5-7天，至菌丝长满培养基。
原种制作：按照无菌操作规程，从活化菌种中挑取带菌丝琼脂块，置于灭菌的原种培养基（麸皮20%、玉米粉9%、棉籽壳10%、蔗糖1%、水60%）中，于25-30℃的条件下，培养至菌丝长满菌种瓶得原种。通过上述原种培养基，成品率达到67.12%，芝盖大，质量好，孢子散发量也多。
栽培种制作：按照下述重量百分比配料：杂木屑10-15％、棉籽壳20-25％、麸皮8-10％、石灰1-2％、石膏1-2％、水55-65%，装入菌种瓶，高温灭菌，冷却后接入原种，于25-28℃的条件下培养至菌丝长满菌种瓶得栽培种。
段木发菌：山毛榉段木（直径15厘米，长度30厘米）套袋灭菌，冷却后接入灵芝栽培种，25-28℃培养30-40天，至灵芝菌丝长满段木。
出芝管理：将发菌完全的段木脱袋，埋入经太阳暴晒的沙土中，喷水控制空气湿度80-90％，控制环境温度25-30℃，光照强度500-2000lx，完成灵芝子实体的发育、生长和成熟。
2.以上实施例及对比例中灵芝总三萜含量的分析通过以下步骤实现：取成熟的灵芝样品用组织研磨机研碎后冷冻干燥，取干燥灵芝粉末于100ml锥形瓶，加入30ml氯仿，40℃超声30min后抽滤取滤液，用氯仿定容至30ml，吸取上述提取液10ml于分液漏斗中用10ml5%nahco3溶液萃取后收集上层液体，分三次操作，利用盐酸将上述溶液调ph至<3；再次用氯仿30ml分三次反萃后，55℃减压旋转蒸发浓缩。用10ml无水乙醇40℃超声水浴混合溶解上述浓缩物（5min），获得灵芝三萜溶液，于245nm下测其吸光度值。用无水乙醇溶解麝香草酚配置标准溶液绘制标准曲线，根据标准曲线计算灵芝三萜浓度。
3.以上实施例及对比例中灵芝酸a、灵芝烯酸b、灵芝酸c2含量的分析通过以下步骤实现：
灵芝酸a、灵芝烯酸b、灵芝酸c2标准品购自宝鸡市辰光生物科技有限公司，含量98%。灵芝三萜溶液的制备同实施例2。灵芝酸a、灵芝烯酸b、灵芝酸c2的含量采用hplc分析。hplc分析条件为：
hplc柱：c18，250*4.6mm；
流动相a：0.1%乙酸（v/v）；
流动相b：乙腈；
梯度洗脱：0min，0%b；5min，20%b；15min，30%b；30min，50%b；40min，65%b；50min，85%b；60min，95%b；80min，100%b。
流速：0.6ml/min；
柱温：28℃；
进样量：5μl；
检测波长：254nm。
1.以上实施例及对比例中灵芝三萜合成关键酶基因表达的分析通过以下步骤实现：
精密称取0.1g样品置于ep管，加入0.5mltrizol采用scientz-48高通量组织研磨器（宁波新芝生物科技有限公司）进行研磨（70hz；30s）提取样品rna，然后进行反转录、qpcr测定灵芝三萜合成途径中的3-羟基3-甲基戊二酰coa合成酶（hmgs）、3-羟基3-甲基戊二酰coa还原酶（hmgr）、法尼基二磷酸合成酶（fps）、角鲨烯合成酶（sqs）、环氧角鲨烯环化酶（osc）等酶基因hmgs、hmgr、fps、sqs、osc的ct值，各基因的引物序列见表1，引物由上海生工生物工程有限公司合成；rna提取、反转录和qpcr测定条件根据文献（陈林，崔培梧，鲁耀邦，廖彦，张志丽，张书航，黄绍国，易刚强.茉莉酸甲酯对茯苓三萜生物合成的调控研究.湖南中医药大学学报，2017,37(6):606-610）进行，以灵芝18srrna为参考基因，2-δδct计算各基因相对表达量。
以上所揭露的仅为本发明较佳实施例而已，当然不能以此来限定本发明之权利范围，因此依本发明权利要求所作的等同变化，仍属本发明所涵盖的范围。