羊肚菌高产菌株及其应用的制作方法

本发明涉及食用菌技术领域，具体涉及一株新的羊肚菌高产菌株及其应用。

背景技术：

羊肚菌因其菌盖外形似羊肚而得名，是羊肚菌属所有种类的统称，并不是指一个具体的物种。羊肚菌属(morchelladill.expers.:fr.)隶属于子囊菌门(ascomycota)、盘菌纲(discomycetes)、盘菌目(pezizales)、羊肚菌科(morchellaceae)。

羊肚菌属的所有种类均为珍稀食、药用真菌，具有较高的营养和药用价值。在欧洲，羊肚菌被认为是仅次于块菌的美味食用菌；在北美，被认为是最佳食品。在我国，明代李时珍的《本草纲目》中就有“甘寒无毒，益肠胃，化痰利气”的记载。羊肚菌子实体肉质脆嫩，味道鲜美，含有7种人体必需氨基酸以及多种维生素和高含量的铁、锌以及多种矿质元素，是餐桌上的美味佳肴。羊肚菌中含有大量的多糖，具有较强的抗肿瘤和抗癌作用；含有黑色素形成抑制剂，具有美容和抗衰老、抗氧化的功能。

羊肚菌自然分布范围较广、种类繁多，据报道羊肚菌属包括68个种。羊肚菌生长的环境条件差异较大，生物学特性容易受环境因素的影响，使得羊肚菌人工栽培的难度大大增加。据研究报道，在众多羊肚菌的种中，现阶段可成功栽培的羊肚菌主要有4个种，包括黑色羊肚菌类群的梯棱羊肚菌(morchellaimportuna)、六妹羊肚菌(morchellasextelata)和七妹羊肚菌(morchellaseptimelata)，以及在美国栽培较多的变红羊肚菌(morchellarufobrunnea)。梯棱羊肚菌和六妹羊肚菌是目前国内栽培最为广泛的两个种。

目前羊肚菌的栽培技术还处于初期阶段，仍存在很多问题。菌种来源不明确，种源混杂，多数栽培菌株主要来自于野生驯化菌株，整体产量低、不稳定，可重复性差；栽培管理技术相对粗放，缺乏较为精准的技术参数，尤其是在我国北方地区，羊肚菌栽培高产菌株及栽培技术更是缺乏，是限制羊肚菌产业发展存在主要问题。

技术实现要素：

针对上述现有技术，本发明的目的是提供一株羊肚菌高产菌株山农羊肚菌1号。该菌株的菌丝生长速度快、出菇产量高，为北方地区羊肚菌栽培提供了新的优质的菌株。

具体的，本发明涉及以下技术方案：

本发明提供的羊肚菌高产菌株，命名为山农羊肚菌1号，该菌株已于2019年4月28日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称cgmcc，地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号)，其保藏编号为：cgmccno.17677。

该菌株是由黑色羊肚菌菌株m10和m20为亲本，采用原生质融合育种技术，其中，菌株m10为四川省农科院选育的梯棱羊肚菌，菌株m20为六妹羊肚菌。

本发明的山农羊肚菌1号，其子实体单生或群生，少数簇生，菌盖圆锥形，偶尔卵圆形，长5～12cm，宽2～7cm。菌盖表面有明显的凹坑和纵横交错的脊，脊表面平滑、易碎，幼嫩时颜色呈茶褐色，老后深棕色近黑色。菌肉白色肉质，厚1～3mm，内壁较粗糙，具白色粉状颗粒。菌柄圆柱形，高3～8cm，直径2～4cm，白色至浅褐色，幼时表面较光滑，老后表面具粉状颗粒，菌柄基部膨大，中空。

菌丝初期白色，成熟后黄褐色，气生菌丝生长旺盛，菌落黄褐色，棉絮状，在pda培养基上培养5～7d易产生黄褐色菌核。

本发明的山农羊肚菌1号具有菌丝生长速度快、出菇产量高的优良生物性状；与亲本相比，本发明的菌株的产量可提高65％以上。

本发明所请求保护的羊肚菌菌株(cgmccno.17677)，即包括cgmccno.17677所对应的菌株，也包括该菌株繁殖所产生的与所述菌株具有相同遗传学和/或形态学性状的后代。

所述的羊肚菌菌株(cgmccno.17677)作为亲本进行育种中的应用也属于本发明的保护范围。

栽培所述羊肚菌菌株(cgmccno.17677)得到的子实体也属于本发明的保护范围。

培养所述羊肚菌菌株(cgmccno.17677)得到的菌丝体和/或孢子也属于本发明的保护范围。

根据本发明的一方面，本发明还涉及所述羊肚菌菌株(cgmccno.17677)的栽培方法，包括如下步骤：

(1)将羊肚菌菌株(cgmccno.17677)培养得到的原种接种到栽培种培养基中，22-24℃条件下培养10-15d，得到栽培种；

(2)在畦面上开播种沟，将步骤(1)得到的栽培种撒入后覆土，覆土后盖上薄膜保湿；

(3)播种后待菌丝长满畦面形成“菌霜”时，开始放置含有培养料的营养袋，在营养袋的一面划口，将营养袋划口的一面平放在畦面上，使羊肚菌菌丝可以直接接触营养袋中的培养料；

(4)放置营养袋35-45d后移走营养袋；土面开始形成原基后揭开薄膜；子实体生长期控制温度为8-20℃，出菇期土壤含水量控制在20-28％，空气湿度控制在85-90％。

优选的，步骤(1)中，所述栽培种培养基由以下质量百分比的原料组成：

麦粒40％、木屑45％、腐殖质土10％、麦麸3％、石灰1％、石膏1％。

优选的，步骤(2)中，覆土材料中添加有20％的草炭；覆土厚度为3cm。

优选的，步骤(3)中，所述培养料由以下质量百分比的原料组成：

麦粒30％、木屑68％、石灰1％、石膏1％。

羊肚菌目前栽培中许多技术都未明确具体，栽培条件粗放，导致最终得到的羊肚菌的产量和质量不稳定。针对于本发明的羊肚菌高产菌株，对其栽培技术进行了研究优化，为北方地区羊肚菌的栽培提供了技术支持。

本发明的山农羊肚菌1号的栽培方法中，在覆土材料中添加了一定量的草炭，草炭质地疏松，对提高土壤的透气性和保水性具有显著效果，可为羊肚菌菌丝在土内生长提供充足的氧气和适宜的湿度。随着覆土厚度的增加，有效子实体个数和产量增加，当覆土厚度为3cm时，羊肚菌有效子实体个数和产量最高。当覆土层的厚度继续增加，有效子实体个数和产量开始减少。外源营养袋的使用是羊肚菌人工栽培探究过程中的一个里程碑，使羊肚菌栽培可实现高产。放置外源营养袋作为栽培技术中重要的一项技术，需对其深入研究，研究发现营养袋放置时间与羊肚菌原基形成的时间成正相关关系，随着营养袋放置时间的推迟，原基形成时间随之延迟。放置营养袋可为菌丝的生长提供营养，土表菌丝生长旺盛，从营养袋开口处菌丝向四周蔓延生长。营养袋放置时间越早，菌丝生长越旺盛，当菌丝营养生长达到一定时间后，需要撤掉营养袋，在合适的温湿度条件下即可形成原基。营养袋撤袋时间过早，菌丝还未完全利用营养袋，营养袋对出菇和子实体的后期生长促进作用较小；撤营养袋时间过晚容易感染病虫害，会对羊肚菌产量造成一定的损失；经多次试验研究发现，放置营养袋35-45d后移走营养袋为最优的放置时间，可以显著的提高羊肚菌的产量。

根据本发明的一方面，本发明还涉及上述羊肚菌菌株(cgmccno.17677)得到的子实体在食品加工中的应用。

根据本发明的一方面，本发明还涉及一种食品，其含有如上所述菌株；

和/或：

所述菌株培育得到的菌丝体和/或子实体。

本发明的有益效果：

本发明选育的羊肚菌菌株(cgmccno.17677)，其菌丝生长速度快、出菇产量高，为北方地区羊肚菌栽培提供了新的优质菌株。

附图说明

图1：融合菌株r5与亲本拮抗现象。

图2：基于its构建的系统发育树。

图3：引物对me9-em8对融合菌株r5及亲本的srap图谱。

图4：融合菌株r5出菇情况。

具体实施方式

应该指出，以下详细说明都是例示性的，旨在对本申请提供进一步的说明。除非另有指明，本文使用的所有技术和科学术语具有与本申请所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同含义。

术语说明：

子实体：是高等真菌的产孢构造，即果实体，由已组织化了的菌丝体组成。

原基：食用菌出菇之前，由菌丝缠绕扭结形成的一个个小颗粒，长大后即为一个个蘑菇。

菌丝：单条管状细丝，为大多数真菌的结构单位。

菌丝体：很多菌丝聚集在一起组成真菌的营养体，即菌丝体。

为了使得本领域技术人员能够更加清楚地了解本申请的技术方案，以下将结合具体的实施例详细说明本申请的技术方案。如果实施例中未注明的实验具体条件，通常按照常规条件，或者按照试剂公司所推荐的条件；下述实施例中所用的试剂、耗材等，如无特殊说明，均可通过商业途径获得。

本发明实施例中所用的培养基配方如下：

pda培养基：马铃薯(去皮)200g，葡萄糖20g，琼脂20g，水1l。

再生培养基：马铃薯(去皮)200g，葡萄糖20g，甘露醇109.3g，琼脂20g，水1l。

原种培养基：麦粒90％，麦麸8％，石灰1％，石膏1％；(重量百分比)。

栽培种培养基：麦粒40％，木屑45％，腐殖质土10％，麦麸3％，石灰1％，石膏1％；(重量百分比)。

营养袋中培养料配方：麦粒30％，木屑68％，石灰1％，石膏1％；(重量百分比)。

实施例1：羊肚菌高产菌株的选育

选用黑色羊肚菌菌株m10和m20作为原生质体融合的亲本。菌株m10为四川省农科院选育的菌株梯棱羊肚菌，菌株m20为六妹羊肚菌，公众可从山东农业大学获得。通过原生质体种间融合技术进行羊肚菌高产菌株的选育。

1.原生质体制备：

(1)菌丝体的培养

用打孔器在pda培养基上分别取3～4个菌饼接种于贴有玻璃纸的培养基中，25℃培养1～2d。

(2)酶液的配置

称取一定量的溶壁酶(广东微生物研究所)溶解于0.6mol/lmgso4渗透压稳定剂中，用0.22μm微孔滤膜过滤除菌(酶液现配现用)，溶壁酶浓度为3％。

(3)原生质体制备

挑出培养基中的羊肚菌菌丝，用无菌水冲洗两次，再用0.6mol/lmgso4冲洗两遍，滤纸吸干置于备好的酶液中，其中酶液的体积是湿菌丝体的3～5倍。剧烈震荡离心管分散菌丝后将其置于摇床中80r/min32℃下酶解3h左右。每隔半小时检测酶解情况，吸取10μl酶解液于血球计数板上在显微镜下观察原生质体释放方式并计数。

(4)原生质体纯化

酶解结束后，吸取酶液用孔径40μm的细胞筛过滤除去残余菌丝。滤液经4500r/min离心10min，弃上清，沉淀用0.6mol/lmgso4洗涤两次。加入适量0.6mol/lmgso4制成悬液，用血球计数板测算原生质体最终产量。

2.原生质体融合：

(1)将纯化后的m10菌株原生质体悬浮于0.6mol/lmgso4溶液中，调整浓度为10⁵个/ml。吸取200μl原生质体，于无菌条件下均匀涂布于平板再生培养基上，在距离30w(253.7nm)紫外灯下10cm处开盖，垂直照射24min。

(2)将纯化后的m20菌株原生质体悬浮于0.6mol/lmgso4溶液中，调整浓度为10⁵个/ml。吸取1ml放入2ml离心管中，同时置于55℃的恒温水浴箱中进行热灭活处理20min；每隔2min轻轻震荡离心管1次，使原生质体受热均匀。

(3)将步骤(1)和步骤(2)处理后的两亲本原生质体各0.5ml～1ml(根据每次滤出的酶液量而定)，悬浮于0.6mol/lmgso4溶液中，调整浓度达到10⁵个/ml数量级后1:1混合。用0.6mol/lmgso4洗脱混合液洗脱2次，2000r/min离心10min，得到原生质体沉淀后定容至1ml。

将上述原生质体沉淀在30℃水浴中预热后，用移液器沿管壁逐滴缓慢加入1ml一定浓度(30～45％)peg-cacl2助溶剂，混匀后置于30℃水浴中进行原生质体融合反应20min。融合反应结束后低速2000r/min离心10min，弃上清液再用0.6mol/lmgso4的渗稳剂洗涤2次，尽可能地去除peg毒性。

取100μl稀释液涂布在再生培养基上，置于25℃恒温培养箱中避光培养，定期观察菌落生长情况，选择菌丝粗壮且生长速度快的融合菌株作为目标菌株，编号为r5。

实施例2：羊肚菌高产菌株的鉴定

1.形态学鉴定：

融合菌株r5的子实体单生或群生，少数簇生，菌盖圆锥形，偶尔卵圆形，长5～12cm，宽2～7cm。菌盖表面有明显的凹坑和纵横交错的脊，脊表面平滑、易碎，幼嫩时颜色呈茶褐色，老后深棕色近黑色。菌肉白色肉质，厚1～3mm，内壁较粗糙，具白色粉状颗粒。菌柄圆柱形，高3～8cm，直径2～4cm，白色至浅褐色，幼时表面较光滑，老后表面具粉状颗粒，菌柄基部膨大，中空。

菌丝初期白色，成熟后黄褐色，气生菌丝生长旺盛，菌落黄褐色，棉絮状，在pda培养基上培养5～7d易产生黄褐色菌核。

2.拮抗试验：

在平板上分别接种亲本菌株和原生质体融合后筛选出的菌株r5，两者相距2cm，25℃恒温培养，3～5d观察是否有明显拮抗线产生。若菌丝能融合生长、连成一片的说明是同种菌丝，若出现拮抗线明显的，则说明菌种性质不同，为有效融合株，可能产生了新的性状，结果见图1。

从图1可以看出，得到的融合菌株r5与两亲本出现了拮抗线，在拮抗线附近产生了大量菌核，说明融合菌株r5与两亲本都存在一定的差异性，属于不同菌株。

3.融合菌株与亲本亲缘性鉴定：

对融合菌株及其亲本进行its鉴定，构建系统发育树(见图2)，由图2可知亲本m10与融合菌株r5聚在一枝上，说明融合菌株r5和m10亲缘关系更近。

利用srap技术对融合菌株r5与其亲本菌株进行分子标记，srap分子鉴定所用的引物对为：me5-em17、me9-em6、me9-em8、me9-em9、me10-em3、me10-em12、me10-em17、me11-em3、me11-em17、me13-em10，序列如下：

me5:5'-tgagtccaaaccggaag-3'；(seqidno.1)

me9：5'-tgagtccaaaccggagg-3'；(seqidno.2)

me10:5'-tgagtccaaaccggaaa-3'；(seqidno.3)

me11:5'-tgagtccaaaccggaac-3'；(seqidno.4)

me13:5'-tgagtccaaaccggaag-3'；(seqidno.5)

em3:5'-gactgcgtacgaattgac-3'；(seqidno.6)

em6:5'-gactgcgtacgaattgca-3'；(seqidno.7)

em8：5'-gactgcgtacgaattcac-3'；(seqidno.8)

em9:5'-gactgcgtacgaattcag-3'；(seqidno.9)

em10:5'-gactgcgtacgaattcat-3'；(seqidno.10)

em12:5'-gactgcgtacgaattctc-3'；(seqidno.11)

em17:5'-tgtggtccgcaaatttag-3'。(seqidno.12)

其中引物对me9-em8对融合菌株r5及亲本扩增出来的条带见图3。采用ntsys-pc软件分析得到相似性矩阵，如表1所示。

表1：融合菌株基于srap分子标记的相似性系数矩阵

基于上述对菌株的形态学鉴定、拮抗试验和分子学鉴定结果，将融合菌株r5鉴定为羊肚菌的新菌株，命名为山农羊肚菌1号。并对该菌株进行生物保藏，保藏信息如下：

参据的生物材料(株)：山农羊肚菌1号

分类命名：梯棱羊肚菌morchellaimportuna

保藏机构：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心

保藏机构简称：cgmcc

地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号

保藏日期：2019.4.28.

保藏中心登记入册编号：cgmccno.17677。

实施例3：菌丝生长速度比较

将本发明的融合菌株r5和亲本菌株m10和m20在平板上培养测量其生长速度，并观察菌丝形态。菌丝生长速度结果见表2。

菌丝生长速度(cm/d)＝[(菌落直径－0.4cm)/2]/培养天数

(0.4cm为菌饼直径)

表2：融合菌株与亲本的菌丝生长速度

由表2可以看出，融合菌株r5的菌丝生长速度优于亲本。而且融合菌株r5的菌丝生长旺盛，菌丝粗壮。

实施例4：羊肚菌菌株(cgmccno.17677)的栽培产量验证

(1)场地选择及处理

清理场地内的石块、杂物、杂草及其他植物根茎，暴晒10d后撒石灰后整地建畦，规格为0.9×1m²，畦间距离为0.3m，畦面比地面高0.1m。灌大水洇湿土壤。

(2)菌种制作

将活化好的菌株接种到pda培养基上，置于25℃培养5d后备用。

称取适量麦粒，清洗干净后大火煮至大部分麦粒透明无白心，立即倒入冷水中进行冷却。过滤掉多余的水分，加入2％麦麸和2％石膏搅拌均匀。用原种瓶分装，每瓶装入量为2/3瓶，用透气封口膜封口。在126℃灭菌120min冷却后接入培养好的母种，置于23℃条件下培养，作为原种备用。

将栽培种配料称量后预湿并混匀，调整含水量到65％左右后装入聚丙烯菌袋中126℃条件下灭菌120min，冷却后接入原种置于23℃条件下培养15～20d备用。

(3)播种及菌丝生长期管理

在0.9×1m²的畦面上均匀开三条播种沟，沟深5cm，将菌种撒入后覆土，覆土厚度为3cm，覆土后盖上薄膜保湿。

菌丝生长期间，主要是土壤湿度的管理，土壤湿度控制在20％～25％即可。

(4)放置营养袋

播种后大约1周左右，菌丝将长满畦面，形成“菌霜”，开始放置营养袋，每个畦面上均匀放置6个营养袋，营养袋规格为12cm×24cm。在营养袋的一面划两道10cm左右的开口，把营养袋划口的一面平放在畦面上，轻轻压实，使羊肚菌菌丝可以直接接触“外源营养袋”中的培养料。菌丝将慢慢长进“外源营养袋”中并吸收营养，并向土层内的菌丝传送。

(5)出菇管理

菌丝慢慢长满营养袋，菌丝由白色转变为黄色，营养袋放置35d后移走外源营养袋。土面开始形成原基后，揭开薄膜。子实体生长期的温度范围尽量控制在8～20℃。温度低时加强增温措施。当温度超过22℃时，要及时进行通风透气、降低温度。通风时注意不宜强风吹拂土层表面，容易损失土壤表面的水分，导致原基容易死亡，子实体菌盖变尖或变小。出菇期土壤含水量控制在20％～28％，空气湿度85％～90％为宜。

(6)病虫害防治

羊肚菌栽培期间一般出现伞菌、盘菌、粘菌等杂菌量比较少，及时清除即可，若发现局部感染青霉、绿霉或毛霉时，要及时将感染部位挖掉，并撒上少量石灰。土壤湿度过大时容易在子实体上形成白色霉菌，导致原基和幼菇开始腐烂，这时应保持良好的通风，降低土壤湿度和空气湿度，抑制病原菌的繁殖扩散。出菇期间悬挂黄板，引诱飞虫，防止菇蚊、菇蝇等的危害，同时使用糖醋液引诱果蝇、小地老虎等。

(7)采收及数据统计分析

当羊肚菌的子囊果菌盖脊与凹坑棱廓分明，菌盖肉质厚实有弹性且未弹射孢子时即可采收。采收时，用小刀在菌柄接近地面的地方沿水平方向切割摘下，保持子实体的整洁以保证其商品性状。采摘完毕后将剩余的菇脚慢慢清理干净，避免伤到其它原基及幼菇。成熟的子实体须及时采收，以免其商品质量降低影响效益。管理期间观察记录菌霜和原基形成时间，最后统计分析小区产量，计算单位面积产量。

以亲本菌株作为对照，对本发明的融合菌株r5(即山农羊肚菌1号)进行出菇验证，栽培方法同上。试验结果见表3。

表3：菌株(cgmccno.17677)出菇验证试验结果

由表3可以看出，融合菌株r5的产量显著高于亲本m10和m20，说明融合菌株r5为高产的羊肚菌。

实施例5：二代出菇验证

对出菇验证后得到菌株，选择朵形良好的子实体组织分离培养，并制种播种于冬暖棚进行栽培。统计其出菇产量表现，进一步验证高产的稳定性，栽培方法同实施例4。试验结果见表4，菌株r5出菇现场见图4。

表4：菌株(cgmccno.17677)二代出菇验证试验结果

由表4可以看出，选择r5(即山农羊肚菌1号)栽培过程中朵形良好的子实体将组织分离培养再次栽培，菌株r5于播种40d开始形成原基，出菇表现良好，产量为218.60kg/667m²，出菇表现稳定，说明菌株r5均具有较好的高产遗传稳定性。

以上所述仅为本申请的优选实施例而已，并不用于限制本申请，对于本领域的技术人员来说，本申请可以有各种更改和变化。凡在本申请的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本申请的保护范围之内。

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<110>山东农业大学

<120>羊肚菌高产菌株及其应用

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