表面活性剂作为助剂在用于提高果蔬农药有效利用率方面的应用的制作方法

本发明属于农药助剂应用的技术领域。具体涉及表面活性剂作为助剂在用于提高果蔬农药有效利用率方面的应用。

背景技术：

药液在靶标植株上的润湿性能和持留量直接影响农药的有效利用率。而润湿性能与药液的表面张力、药液在叶片上的接触角等有关。添加表面活性剂可有效地降低农药药液的表面张力、降低药液与靶标的接触角，并有效提高农药在靶标植物上的润湿能力和沉积量，减少药剂流失，降低农药对环境的污染。但由于国内农药使用技术相对落后，大多数药液中添加的表面活性剂未达到临界胶束浓度，导致药剂利用率低，特别是生物杀虫剂，到目前为止还没有添加表面活性剂的研究报道。此外，由于不同植物叶片的微观结构等生物学特性也会影响到药液的润湿及持留性能，因此筛选适宜于生物农药和不同植物应用的表面活性剂类型对提高生物农药的有效利用率、减少用药量、节约成本具有重要意义。大量研究表明，很多药液很难附着在甘蓝、苹果等植物的表面而滚落，造成农药对环境的污染，因此改善施药药液理化性质，特别是降低药液的表面张力是提高生物农药利用率的重要途经。近年来，随着生物农药应用的逐年增加，筛选适宜的助剂对提高生物农药的防效具有重要意义。

本发明涉及到的不同表面活性剂包括：水溶性硅油ofx-0193（道康宁上海有限公司）主要用于化妆品添加剂或表面活性剂，在水系统中十分稳定，可降低表面张力；二异丁基萘磺酸钠nekal主要用于渗透剂、乳化剂、洗涤剂、助染剂、分散剂和润湿剂等。

玫烟色棒束孢是一种极具开发潜力的昆虫病原真菌，对小菜蛾plutellaxylostella（linnaeus）、烟粉虱bemisababaci（gennadius）、桃蚜myzuspersicae（sulzer）等蔬菜害虫以及果树、茶树害虫具有重要致病作用。昆虫病原真菌的孢子能否附着在靶标植物上是其感染寄主昆虫的关键。但这些孢子大多缺乏润湿性、分散性和内吸性，因此只有尽可能多地使昆虫病原真菌孢子附着在靶标植物上，才能更好地发挥微生物农药对害虫的控制作用。目前，有关表面活性剂用于提高化学农药的利用效率的研究很多，而关于表面活性剂能否提高生物农药在寄主植物上的附着和药效还未见报道。

技术实现要素：

为此，本发明以添加不同表面活性剂的玫烟色棒束孢孢子悬浮液为试材，测定了药液的表面张力及在不同供试植物叶片上的接触角及最大稳定持留量，并进行了供试表面活性剂的安全性评价，以筛选出提高玫烟色棒束孢pf904有效利用率的最适表面活性剂及浓度。本发明将上述表面活性剂作为助剂用于提高生物杀虫剂的有效利用率目前国内外尚未见报道。

为实现上述目的，本发明公开了如下的技术内容：

表面活性剂用于提高生物杀虫剂在果蔬害虫有效利用率方面的应用；所述的表面活性剂助剂指的是peg-12聚二甲基硅氧烷（ofx-0193）和二异丁基萘磺酸钠（nekal）；所述的农药指的是：玫烟色棒束孢pf904；所述的果蔬指的是：甘蓝、苹果、茄子和黄瓜。

本发明所述的有效利用率指的是表面活性剂在提高玫烟色棒束孢pf904在果蔬植物上的润湿性能、降低接触角及药液的最大稳定持留量。

为筛选适用于玫烟色棒束孢（isariafumosorosea）pf904菌株的表面活性剂，本试验进行了添加不同表面活性剂后玫烟色棒束孢在果、蔬叶片上的润湿性能、最大持留量和接触角的研究。结果表明：peg-12聚二甲基硅氧烷（ofx-0193）、ɑ-烯基磺酸钠（aos）和二异丁基萘磺酸钠（nekal）3种表面活性剂在125mg·l^-1-500mg·l^-1下均可提高玫烟色棒束孢孢子悬浮液在4种供试植物叶片上的润湿性能；其中浓度为250mg·l^-1nekal在甘蓝和苹果叶片上的最大持留量（11.90、13.28）mg·cm^-2和接触角（29.5°、27.5°）均显著优于ofx-0193和aos，润湿效果最好；在茄子叶片上，添加浓度为125mg·l^-1的ofx-0193时持留量最大9.45mg·cm^-2；而普鲁兰多糖（pullulan）达到临界胶束浓度时的溶液表面张力大于甘蓝、苹果和茄子叶片的临界表面张力，接触角均大于90°，润湿性能最差。孢子萌发抑制率的测定结果表明：nekal和ofx-0193对玫烟色棒束孢pf904孢子萌发无抑制作用，aos对其表现为抑制作用。因此，nekal和ofx-01932种表面活性剂可用作玫烟色棒束孢防治苹果、甘蓝类害虫的助剂；ofx-0193还可用作防治茄类害虫的助剂。

本发明主要解决了生物杀虫剂玫烟色棒束孢不易附着在植物表面而严重影响药效的问题，重点考察了不同表面活性剂对药液湿润性能的影响和对生物杀虫剂的安全性，主要的难点在于2种表面活性剂在降低药液的表面张力和接触角及提高药液稳定持留量方面的研究。

附图说明

图1为4种助剂达到临界胶束浓度所对应的表面张力；

图2为添加不同表面活性剂的玫烟色棒束孢孢子悬浮液在供试植物叶片上的接触角结果；其中a：甘蓝；b：苹果；c：茄子；d：黄瓜。图中数据为平均数±标准差。不同字母表示经lsd法检验在p<0.05水平差异显著。

图3为添加不同表面活性剂的玫烟色棒束孢孢子悬浮液在甘蓝和苹果叶片上的最大稳定持留量；a：甘蓝；b：苹果。图中数据为平均数±标准差。不同字母表示经lsd法检验在p<0.05水平差异显著。

图4为添加不同表面活性剂的玫烟色棒束孢孢子悬浮液在茄子和黄瓜叶片上的最大稳定持留量；其中a：茄子；b：黄瓜。图中数据为平均数±标准差。不同字母表示经lsd法检验在p<0.05水平差异显著。

图5为添加不同表面活性剂后玫烟色棒束孢分生孢子萌发情况；其中a、e：对照中孢子萌发；b、f：ofx-0193中孢子萌发；c、g：nekal中孢子萌发；d、h：aos中孢子萌发。a-d：12h分生孢子萌发情况；e-h：24h分生孢子萌发情况。co：分生孢子；gt：芽管；ap：附着孢。

具体实施方式

下面通过具体的实施方案叙述本发明。除非特别说明，本发明中所用的技术手段均为本领域技术人员所公知的方法。另外，实施方案应理解为说明性的，而非限制本发明的范围，本发明的实质和范围仅由权利要求书所限定。对于本领域技术人员而言，在不背离本发明实质和范围的前提下，对这些实施方案中的物料成分和用量进行的各种改变或改动也属于本发明的保护范围。本发明所用原料及试剂均有市售。

实施例1

1材料与方法

1.1材料

供试植物叶片：采集自山西农业大学试验田种植的新鲜甘蓝、苹果、茄子和黄瓜叶片。

供试菌株与表面活性剂：玫烟色棒束孢pf904（山西农业大学昆虫重点实验室保存，见生物工程学报，2019,35（1）：114-120）；peg-12聚二甲基硅氧烷（ofx-0193）（道康宁上海有限公司）、ɑ-烯基磺酸钠aos（临沂市绿森化工有限公司）、二异丁基萘磺酸钠nekal（临沂市绿森化工有限公司）、普鲁兰多糖pullulan（山东康纳馨生物科技股份有限公司）。

供试仪器：jc2000c1接触角测定仪（上海中晨数字技术设备有限公司）、jyw-200b微控表界面自动张力仪（承德金和仪器制造有限公司）、电子天平（北京赛多利斯科学仪器有限公司）、1～100μl移液枪（上海肯强仪器有限公司）等。

1.2方法

1.2.1供试植物叶片临界表面张力的测定

选取新鲜的甘蓝、苹果、茄子和黄瓜叶片，将不同表面张力的液体点滴在叶片上，使用接触角测量仪测定接触角。以接触角cosθ对溶液的表面张力值作回归方程，cosθ=1时，对应的液体表面张力即为该植物的临界表面张力值。

1.2.2孢子悬浮液的制备

将4℃下贮存的玫烟色棒束孢pf904菌株的培养基在室温下活化1d，接种在pda培养基上培养10d后，用接菌针把孢子慢慢刮下，用清水反复冲洗配制成孢子悬浮液，使用移液枪把孢子悬浮液滴加在血球计数器上，调整孢子浓度为1×10⁴孢子/ml。

1.2.3供试药液的配制

将不同表面活性剂添加到玫烟色棒束孢菌株制成的孢子悬浮液中，分别配制为含表面活性剂62.5mg·l^-1、125mg·l^-1、250mg·l^-1、500mg·l^-1和1000mg·l^-15个质量浓度梯度的药液，以加入清水的孢子悬浮液为对照。

1.2.4表面张力及临界胶束浓度的测定

使用微控表界面自动张力仪测定相应浓度药液的表面张力。供试药液分别倒入250ml的三角瓶中，充分摇匀，将待测药液倒入玻璃皿中放在自动升降台上，点击上升，直至铂金环完全浸入药液中，点击下降，直到铂金环完全拉开液面，界面张力仪会记录拉力的最大值便是该药液的表面张力。同一样品重复测量3次，将测得的表面张力与浓度作图，得到一条曲线，曲线拐点处即为药液中的表面活性剂的临界胶束浓度。

1.2.5接触角的测定

剪取2×2cm²新鲜干净的供试植物叶片（避开叶脉、病斑等），用双面胶将植物叶片粘在载玻片上，平放在接触角测量仪的样品台上，用移液枪吸取配制好的药液滴加在叶面上，用接触角测量仪上的摄像头在20s时摄下叶面上的液滴，输入电脑，通过量角法计算出液滴在不同植物叶片上的接触角，以未加助剂的玫烟色棒束孢悬浮液为对照，测定时将温度控制在（25±1）℃。

1.2.6最大稳定持留量的测定

剪取面积为2×2cm²的4种供试植物叶片，用天平称重(w0，g)，用镊子夹持垂直放入供试药液中3～5s，迅速把叶片拉出水面，垂直悬置，待其不再有液滴流淌时称重(w1，g)，计算叶片的最大稳定持留量rm(mg·cm^-2)。最大稳定持留量rm(mg·cm^-2)=(w1-w0)×1000/叶片面积(cm²)。

1.2.7表面活性剂对孢子萌发的影响

取pda平板上培养10d的玫烟色棒束孢pf904分生孢子，加入含2%葡萄糖的无菌水中，在涡旋振荡器上振荡均匀，并用血球计数板调整孢子浓度为10⁴个孢子/ml。孢悬液中加入1.2.4～1.2.6方法筛选出的可提高玫烟色棒束孢润湿性的最佳浓度的表面活性剂。将含有不同种类及浓度表面活性剂的孢子悬浮液置于摇床上25±1℃、160r/min振荡培养，各药剂浓度重复5次，以不加表面活性剂的孢子悬液作为对照。分别于12h、24h取20μl孢子悬液滴于凹玻片上，置于显微镜下统计孢子萌发情况，并拍照记录。孢子萌发抑制率（%）=（1-处理萌发数/对照萌发数）×100%。

1.3数据分析

试验数据经microsoftexcel2010计算，绘图经sigmaplot12.5，使用dps7.05软件进行统计分析，差异显著性检验用lsd法，显著性水平设定为p＜0.05。

2结果与分析

2.1供试植物叶片的临界表面张力

试验测得甘蓝、苹果、茄子和黄瓜叶片的临界表面张力值（表1）。药液的表面张力小于植物的临界表面张力时，药液才可以在植物叶片上润湿展布。

表14种植物的回归方程和临界表面张力

2.2不同供试药液的表面张力

玫烟色棒束孢孢子悬浮液的表面张力值为70.8mn/m，显著高于供试植物甘蓝、苹果、茄子和黄瓜叶片的临界表面张力，难以在供试植物叶片润湿展着。当pullulan、ofx-0193、aos和nekal的添加浓度分别达到500mg·l^-1、500mg·l^-1、250mg·l^-1和250mg·l^-1时，药液表面张力分别降低为45.6mn·m^-1、27.3mn·m^-1、24.3mn·m^-1和21.8mn·m^-1，且4种助剂溶液的表面张力值不再随浓度的增大而变化，即达到临界胶束浓度（cmc）。

从测定的4种助剂达到临界胶束浓度所对应的表面张力（图1）来看，当添加ofx-0193、aos和nekal3种助剂时，4种供试叶片的临界表面张力均大于其表面张力，表明这3种助剂在适宜浓度下均可显著提高药液的润湿性能，其中最优的为nekal，而pullulan达到临界胶束浓度时所对应的表面张力始终大于甘蓝、苹果和茄子叶片的临界表面张力。

2.3添加不同表面活性剂的药液在4种植物叶片上的接触角

添加不同表面活性剂的玫烟色棒束孢孢子悬浮液在供试植物叶片上的接触角结果（图2）表明：随着ofx-0193、aos和nekal浓度的提高，玫烟色棒束孢孢子悬浮液在各供试植物叶片的接触角显著下降，各浓度表面活性剂均与对照组存在显著差异。在甘蓝叶片上，当nekal和aos的浓度仅为62.5mg·l^-1时，接触角小于60°，表明润湿性好，而ofx-0193和pullulan5个浓度的接触角均大于60°，润湿性中等至差；在苹果叶片上，当nekal、ofx-0193和aos浓度仅为62.5mg·l^-1时，接触角均小于60°，润湿性好，pullulan5个浓度的接触角介于90°-100°，润湿性较差；在茄子和黄瓜叶片上，添加nekal、ofx-0193和aos的浓度为62.5mg·l^-1时，接触角小于60°，润湿性好，而pullulan添加浓度分别为250mg·l^-1、500mg·l^-1时，在黄瓜和茄子叶片上的接触角小于60°润湿性好。考虑到药液中表面活性剂浓度应越小越好，还需选择降低表面张力效率较高的助剂，因此选用ofx-0193、aos、nekal进行下一步试验。

2.4添加不同表面活性剂的药液在4种植物叶片上的最大稳定持留量

2.4.1供试药液在甘蓝和苹果叶片上的最大稳定持留量

添加表面活性剂后玫烟色棒束孢孢子悬浮液在甘蓝和苹果叶片上持留量结果（图3）表明：未添加表面活性剂的玫烟色棒束孢孢子悬浮液在甘蓝和苹果叶片的持液量仅为3.79mg·cm^-2、4.17mg·cm^-2，随3种助剂浓度的增加，持留量明显上升。当nekal和aos浓度为250mg·l^-1、ofx-0193浓度为500mg·l^-1（达到临界胶束浓度）时，供试药液在甘蓝和苹果叶片上持留量达到最大。其中，添加250mg·l^-1nekal药液在2种供试植物叶片上的持留量最大，可达11.90mg·cm^-2、13.28mg·cm^-2，均显著高于其它2种表面活性剂和对照。

2.4.2供试药液在茄子和黄瓜叶片上的最大稳定持留量

添加表面活性剂后玫烟色棒束孢孢子悬浮液在茄子和黄瓜叶片上最大稳定持留量结果（图4）表明：未添加表面活性剂的玫烟色棒束孢孢子悬浮液在茄子和黄瓜叶片的持液量较多，分别为8.52mg·cm^-2、7.66mg·cm^-2。随着助剂浓度逐渐增大，供试药液在茄子和黄瓜叶片上的持留量在减少，甘蓝和苹果叶片持留量最少的是ofx-0193，在茄子黄瓜叶片的持留量却最多。当ofx-0193添加浓度为125mg·l^-1时，药液的表面张力达到茄子的临界表面张力，此时ofx-0193药液在茄子叶片上的持留量最大达9.45mg·cm^-2。

2.5供试药剂对玫烟色棒束孢pf904萌发的影响

3种表面活性剂最佳润湿浓度对玫烟色棒束孢孢子萌发的抑制率如表2。不同供试表面活性剂对玫烟色棒束孢分生孢子萌发的影响不同。其中ofx-0193和nekal对玫烟色棒束孢孢子萌发无抑制作用（图5b、f、c、g），且添加ofx-0193的玫烟色棒束孢分生孢子培养24h后，可观察到大量附着孢的产生（图5f），部分孢子可向两端萌发，表明ofx-0193对玫烟色棒束孢孢子的萌发具有一定的促进作用；而aos对玫烟色棒束孢孢子萌发存在明显的影响（图5d、h），当浓度为125mg·l^-1时，孢子萌发抑制率为19.58%，最佳润湿浓度250mg·l^-1时孢子萌发抑制率达85.71%。可见，nekal和ofx-0193可用作玫烟色棒束孢pf904的表面活性剂,而aos由于抑制孢子萌发，故不能用作玫烟色棒束孢pf904的表面活性剂。

表2不同表面活性剂对玫烟色棒束孢pf904孢子萌发的抑制率

注：处理24h的孢子萌发抑制率；不同字母表示经lsd法检验在p<0.05水平差异显著

结论：peg-12聚二甲基硅氧烷（ofx-0193）和二异丁基萘磺酸钠（nekal）2种表面活性剂在125mg·l^-1-500mg·l^-1下可提高玫烟色棒束孢孢子悬浮液在甘蓝、苹果、茄子和黄瓜4种植物叶片上的润湿性能，并提高了其稳定持留量和降低了接触角，且对玫烟色棒束孢孢子萌发没有影响，因此这2种表面活性剂可作为生物农药玫烟色棒束孢的有效助剂。而普鲁兰多糖（pullulan）润湿性能差，ɑ-烯基磺酸钠（aos）对玫烟色棒束孢孢子萌发有明显的抑制作用，不能作为玫烟色棒束孢的有效助剂。