一种基于Ca2+流速的玉米种子活力测定方法与流程

本发明涉及种子活力检测技术领域，具体涉及一种基于ca²⁺流速的玉米种子活力测定方法。

背景技术：

种子活力是衡量种子播种质量的重要指标。高活力种子出苗快速整齐、苗强苗壮、抗逆性强，具有明显的生长优势和生产潜力；低活力种子在适宜条件下虽然能发芽，但在不良条件下出苗不整齐，甚至不出苗，对产量影响很大。选用高活力种子是实现一播全苗、苗强苗壮的重要保障。

种子活力测定方法有30多种，一般分为直接法和间接法两类。直接法是在试验室条件下模拟田间不良条件测定出苗率或幼苗生长速度和健壮度，如低温处理试验、砖砾试验、伸长胚根计数法等；间接法是在试验室内测定某些与种子活力相关的生理生化指标和物理特性，如酶活性、浸泡液电导率、呼吸强度等。ista颁布的《国际种子检验规程》中将伸长胚根计数法作为适用于玉米种子活力测定的方法。伸长胚根计数法采用20±1℃或13±1℃作为发芽温度，分别在66h±15min和144±1h时计数胚根突破种皮2mm以上的种子所占百分率，作为评价种子活力的指标。

在植物细胞中存在几个ca库，主要包括中央大液泡、内质网、线粒体和叶绿体，此外，在细胞壁中也贮存了大量ca。当植物接收到外界刺激后，ca²⁺由ca库流入细胞质，在静息状态时，ca²⁺又由细胞质流入ca库。外源施加ca²⁺可缓解低温、干旱和盐胁迫等非生物胁迫对种子萌发的抑制作用(廉洁等,2015；徐拾佳等,2017；任珺等,2019)。

非损伤微测技术(non-invasivemicro-testtechnology,nmt)是一种研究活体材料生理功能的技术。该技术利用选择性电极，可在保证被测样品完整性和近似实际生理环境状态下，检测分子/离子进出生物活体的三维流速信息，广泛应用于生理功能研究领域。种子在萌发的过程中通过呼吸作用消耗o2为自身提供能量，xin等(2013)通过nmt技术测定了大豆、小麦和油菜吸胀种子的o2流速，来判断种子生活力，提出了用吸胀种子o2流速评价种子生活力的方法。但目前还未见有基于ca²⁺流速评价玉米种子活力的相关报道。

技术实现要素：

针对上述现有技术，本发明的目的是提供一种基于ca²⁺流速的玉米种子活力测定方法。本发明的方法可以实现对玉米种子活力的准确测定，与现有的检测方法相比，本发明的方法用时更少，效率更高。

为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

本发明的第一方面，提供玉米种胚胚根端ca²⁺流速在玉米种子活力测定中的应用。

玉米种子萌发时，胚根最先突破种皮，因此，在种子吸胀过程中，胚根端细胞比其他部位代谢更旺盛，ca²⁺流速测定值更大，较易测定。本发明选择玉米种胚胚根端ca²⁺流速用于玉米种子活力测定，相对于玉米种胚的其他部位，其测定结果更为准确可靠。

本发明的第二方面，提供一种基于ca²⁺流速的玉米种子活力测定方法，包括以下步骤：

利用非损伤微测系统测定玉米种胚胚根端ca²⁺流速，根据ca²⁺流速来评价玉米种子的活力。

优选的，所述玉米种胚是由如下处理得到：

将待测玉米种子于25℃条件下吸胀24h，将玉米种子的胚乳切掉，剥出完整的玉米种胚。

我们在研究中曾对整粒玉米种子进行检测，结果发现以整粒种子作为检测对象，ca²⁺流速的稳定性较差，且数值较低。在包括玉米在内的禾本科植物种子中，胚是活组织而胚乳、果种皮是死组织，只有活组织可以响应外界环境信号，死组织的干扰也许是以整粒种子作为检测对象测得的ca²⁺流速稳定性较差的主要原因。由此，本发明选择玉米种胚作为检测对象，其ca²⁺流速稳定，且测定数值较高，有利于对玉米种子活力进行评价。

优选的，ca²⁺流速的测定方法为：将玉米种胚的背面朝下，固定在培养皿中，加入测试液，平衡5-10min；将培养皿置于非损伤微测系统的载物台上，利用显微镜及三维运动位移平台，使电极与玉米种胚清楚的在同一视野内显示，将电极尖端靠近玉米种胚胚根端，操作软件，对玉米种胚胚根端ca²⁺流速进行检测。

对于非损伤微测系统而言，测定不同的离子或分子需要使用不同的测试液，针对本发明所测定的对象，测试液的组成优选为：kcl(0.1mm)、cacl2(0.1mm)、mgcl2(0.1mm)、nacl(0.5mm)、na2so4(0.2mm)、mes(0.3mm)，ph值6.0。

更优选的，电极尖端与玉米种胚胚根端的距离为2-5μm。

更优选的，对玉米种胚胚根端ca²⁺流速进行连续检测10min。

优选的，以苗干重活力指数为y值，以玉米种胚胚根端ca²⁺流速为x值，拟合得到苗干重活力指数与ca²⁺流速的线性曲线，通过线性曲线来评价玉米种子的活力。

更优选的，所述线性曲线为y＝0.0006218x+0.1454，r²＝0.8604。

本发明的有益效果：

本发明利用非损伤微测系统对玉米种胚胚根端ca²⁺流速进行检测，根据ca²⁺流速来评价玉米种子的活力。通过本发明的方法可以对玉米种子进行快速检测，准确性高、种子用量少。

附图说明

图1：玉米种胚在正常视野与显微镜下的检测位点；其中，a：正常视野；b显微镜下的视野；其中测试位点为箭头标注的位置。

图2：玉米种子吸胀24h后种胚ca²⁺内流速率的动态变化；不同折线表示4个玉米品种，包括杂交种先玉335(xy335)和郑单958(zd958)及其母本ph6wc和郑58(z58)，空白对照(blank)是在没有放置样品的测试液中测得，其数值在0附近上下波动。以单个活体胚为检测样品，每个样品连续检测10min。

图3：不同品种间种子活力指数与种胚ca²⁺流速；图中，(a)四个玉米品种ca²⁺流速值，(b)株干重活力指数。四个玉米品种为杂交种先玉335(xy335)和郑单958(zd958)及其母本ph6wc和郑58(z58)。

图4：不同处理种胚ca²⁺流速动态变化；(a)先玉335，(b)郑单958。其中ck表示没有经过任何处理；sa表示人工老化处理，即在温度为45℃，湿度为90％，连续老化96h；sp表示“老化+引发”处理，即老化结束后，对其做引发处理；blank是在没有放置样品的测试液中测得。每个样品连续检测10min。

图5：不同处理种子活力与种胚ca²⁺流速；(a)先玉335不同处理ca²⁺流速，(b)先玉335不同处理苗干重活力指数，(c)郑单958不同处理ca²⁺流速，(d)郑单958不同处理苗干重活力指数。ck表示没有经过任何处理；sa表示人工老化处理；sp表示“老化+引发”处理。

图6：玉米种子活力与种胚ca²⁺流速呈显著正相关。

具体实施方式

应该指出，以下详细说明都是例示性的，旨在对本申请提供进一步的说明。除非另有指明，本文使用的所有技术和科学术语具有与本申请所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同含义。

正如背景技术部分所介绍的，随着玉米单粒播技术的推广，种子活力这一指标受到越来越多的重视，准确测定种子活力对于玉米生产非常重要。种子活力测定方法较多，但大多用时较长，效率不高。

基于此，本发明提供了一种新的测定玉米种子活力的方法，本发明利用非损伤微测系统对玉米种胚胚根端ca²⁺流速进行检测，根据ca²⁺流速来评价玉米种子的活力。通过本发明的方法可以对玉米种子活力进行快速检测，准确性高、种子用量少。

在本发明的一种实施方案中，给出的玉米种胚胚根端ca²⁺流速测定方法具体如下：

将待测玉米种子20～30粒置于纸床(纸间)于25℃条件下吸胀24h；用手术刀将玉米种子的胚乳切掉，剥出一个完整的胚，背面朝下，用滤纸条和石英将其固定在培养皿(35mm)中，加入5ml的测试液，所述测试液的组成为kcl(0.1mm)、cacl2(0.1mm)、mgcl2(0.1mm)、nacl(0.5mm)、na2so4(0.2mm)、mes(0.3mm)，ph值6.0；平衡5-10min；将培养皿置于非损伤微测系统载物台上，利用显微镜及三维运动位移平台，使电极与样品清楚地在同一视野内显示，电极尖端靠近样品胚根端(图1)；通过计算机运动模块的调节，使微电极逐渐靠近样品，直至电极尖端和样品之间的距离保持在2-5μm，并且两者均在同一视野下清晰成像；操作软件，对样品ca²⁺流速进行连续检测10min。

细胞质内游离ca²⁺是植物体内重要的第二信使，ca²⁺信号的产生是细胞质内ca²⁺增减、波动的结果。当细胞受到外界刺激时，胞外钙库(细胞壁)或/和胞内钙库(如液泡)中的ca²⁺进入细胞质，随后与下游靶蛋白(如cam、cml、cdpk等)结合，进行信息的传递。种子吸胀使得种子从相对静止状态进入代谢的活跃状态，在这一过程中，胞外ca²⁺的主动内吸很可能在其中发挥了重要作用，代谢活跃的高活力种子内吸速率快而代谢较弱的低活力种子内吸速率慢。种子吸胀过程中未发现ca²⁺外排现象。因此，本发明所检测的ca²⁺流速为种子内吸速率。

将电极尖端与样品距离设为2-5μm，选择性电极在待测ca²⁺浓度梯度中以已知距离dx进行两点测量，获得电压v1和v2，两点间的浓度差dc可通过v1、v2以及已知的该电极的电压浓度校正曲线和nernst方程计算获得，将它们带入fick第一扩散定律公式j0＝-d(dc/dx)(其中，d为扩散常数)可计算获得ca²⁺跨膜流动的速度和方向。

为了使得本领域技术人员能够更加清楚地了解本申请的技术方案，以下将结合具体的实施例详细说明本申请的技术方案。

本发明实施例中所用的试验材料如无特别说明均为本领域常规的试验材料，均可通过商业渠道购买得到。

实施例1：当年收获玉米种子活力与种胚ca²⁺流速

以玉米杂交种先玉335、郑单958及其母本ph6wc、郑58为研究材料，利用nmt技术分别检测上述4个玉米品种的种胚ca²⁺流速。由图2可以看出，不同玉米品种之间的ca²⁺流速是不相同的，其中先玉335与郑单958的ca²⁺流速值较高，且两者的流速值相近，ph6wc的ca²⁺流速值次之，郑58的ca²⁺流速值最低。4个材料的苗干重活力指数差异规律与ca²⁺流速相同(图3)。

实施例2：当年收获种子人工加速老化以及“老化+引发”处理所得种子活力与种胚ca²⁺流速

对玉米杂交种先玉335和郑单958的种子进行人工老化处理以及“老化+引发”处理(老化结束后，再对其引发处理)，利用nmt技术分别检测处理种子种胚ca²⁺流速(图4)。经过不同处理后的先玉335种子，其种胚ca²⁺流速发生了变化，表现为没有经过任何处理的种子种胚ca²⁺流速值最大，“老化+引发”处理的次之，老化处理种子种胚ca²⁺流速值最低(图5a)；相应种子苗干重活力指数的变化趋势相同(图5b)。而郑单958“老化+引发”处理种胚ca²⁺流速与老化处理种子差异不显著(原因是由于引发处理的效果不好)(图5c)，相应种子苗干重活力指数差异也较小(图5d)。

将苗干重活力指数与相应ca²⁺流速值的8组数据代入spss中，以ca²⁺流速值为自变量，苗干重活力指数为因变量，进行数据的相关性分析。得到苗干重活力指数与ca²⁺流速呈极显著的正相关关系(p＝0.0009)用spss拟合了苗干重活力指数与ca²⁺流速的线性回归方程，y＝0.0006218x+0.1454(r²＝0.8604)，其中y代表苗干重活力指数，x代表种胚ca²⁺的流速值(单位：pmolcm^-2s^-1)(图6)。

苗干重活力指数的计算方法为：

首先进行标准发芽试验。以粒径为0.05-0.8mm的建筑用沙制备砂床进行发芽试验，砂床含水量为饱和含水量的60％，每个重复50粒种子，3次重复，放入温度25℃、相对湿度60％、光照16h/黑暗8h的植物生长室中培养，3天后将发芽盒的盖子打开，开始每天记录出苗数(正常苗)，同时适当补充散失的水分，保证幼苗正常生长过程中对水分的需求。第7天末次计数完成后，取出幼苗，冲洗干净后，去除残留的种子组织，将根和地上部的苗分开，将地上部的苗烘干称重，计算苗干重活力指数。

计算公式：苗干重活力指数vi＝gi×s，

gi＝∑(gt/dt)，其中dt为发芽日数，gt为与dt相对应的每天发芽种子数，

s为单株地上部苗干重。

以上所述仅为本申请的优选实施例而已，并不用于限制本申请，对于本领域的技术人员来说，本申请可以有各种更改和变化。凡在本申请的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本申请的保护范围之内。