一种植物新品种聊红椿的组培快繁方法与流程

本发明涉及的是植物的组织快繁技术领域，具体涉及一种植物新品种聊红椿的组培快繁方法。

背景技术：

聊红椿是聊城大学课题组从一个芽变株经过多年培育而成的一种新的红果臭椿品种，具有极高的观赏价值，已获批新品种保护权（证书号为20170268）。

红果椿树属于臭椿变种之一，河北省林科所张均营报道在河北平山一带有天然散生红果臭椿，但其翅果在发育30天后才逐渐显色（张均营，1988），姚德生等人在甘肃省秦安县好地乡洞子沟等地发现一种红果臭椿，其叶片、翅果均较臭椿小（姚德生，2011）。红果椿长期与普通臭椿混栽，种子繁育易发生性状变异，王洪明等人对采集的红果椿开展了嫁接试验，发现能够较好维持翅果红色遗传性（王洪明，2009）。聊城大学课题组在山东聊城发现了一种臭椿一个芽变株，果荚呈鲜红色，经嫁接后多代隔离种植，获得了果色遗传稳定的后代，通过基因多态性分析表明其属于臭椿变种，该红果椿从花期即表达花青素，花药、花瓣呈暗红色，成熟翅果鲜红色，果梗为深红色，5月下旬到7月中下旬是观果最佳期，8月翅果成熟之后变为红褐色（徐卉，2015）。并对其形态特征、物侯期、种子萌发与幼苗生长、种子繁殖后代果色分化、‘聊红椿’与普通臭椿的品种差异性分析等开展了研究，取得了阶段性成果（徐卉，2015）。鉴于红果椿翅果灿烂如霞的观赏效果，可作为行道树、庭荫树在道路、风景区、公园、社区、单位等绿化时应用，可列植、对植、孤植，具有广阔的应用前景，值得大力推广种植。组织培养是快速标准化育苗的一个最重要的途径，既能维持亲本形状，又能极大提高繁育系数，对新品种快速推广很有成效，因此我们对其组培技术开展了系统研究，取得了成功。

技术实现要素：

本发明的目的在于找到臭椿新变种聊红椿组织培养各阶段培养基的原料组成和最佳配比，建立聊红椿的从外植体制备、消毒和接种、脱分化和愈伤组织培养、芽与根的再分化及其培养、组培苗的炼苗定植等组培快繁技术体系。

为实现上述目的，本发明采用的技术方案是：

1.配置培养基：

培养基成分包含有以下原料：①50×大量元素母液（含硝酸铵、硝酸钾、磷酸二氢钾、七水硫酸镁）；②100×氯化钙；③100×金属元素（含有七水硫酸亚铁、乙二胺四乙酸二钠）；④100×微量元素（含有碘化钾、硼酸、四水硫酸锰、七水硫酸锌、二水合钼酸钠、五水硫酸铜、六水合氯化钴）；⑤1000×维生素（含有硫胺素、吡哆素、泛酸、甘氨酸）⑥100×肌醇；⑦激素选用萘乙酸（naa）0.1mg/ml、2.4-二氯苯氧乙酸（2.4-d）0.1mg/ml、6-苄氨基嘌呤（6-ba）0.1mg/ml、吲哚丁酸（iba）1mg/ml；⑧蔗糖；⑨琼脂。

其脱分化阶段、引导发芽和生根等各阶段的培养基原料有部分变化。

首先，诱导脱分化培养基所使用的原料包括（以1l为例）：蔗糖20g、琼脂粉20~24g、大量元素20ml、氯化钙10ml、金属元素10ml、微量元素10ml、维生素1ml、肌醇10ml、萘乙酸（naa）0.1mol/l、2.4-二氯苯氧乙酸（2.4-d）0.1mol/l、6-苄氨基嘌呤（6-ba）0.1mol/l。

进一步，继代培养的培养基原料包括（以1l为例）：蔗糖20g、琼脂粉20~24g、大量元素20ml、氯化钙10ml、金属元素10ml、微量元素10ml、维生素1ml、肌醇10ml、萘乙酸（naa）0.1mol/l、2.4-二氯苯氧乙酸（2.4-d）0.1mol/l、6-苄氨基嘌呤（6-ba）0.2mol/l。

进一步，愈伤组织萌芽的培养基原料包括（以1l为例）：蔗糖20g、琼脂粉20~24g、大量元素20ml、氯化钙10ml、金属元素10ml、微量元素10ml、维生素1ml、肌醇10ml、萘乙酸（naa）0.1mol/l、2.4-二氯苯氧乙酸（2.4-d）0.1mol/l、6-苄氨基嘌呤（6-ba）3mol/l。

进一步，愈伤组织生根的培养基

原料包括（以1l为例）：蔗糖20g、琼脂粉20~24g、大量元素10ml、氯化钙5ml、金属元素5ml、微量元素5ml、维生素0.5ml、肌醇5ml、吲哚丁酸(iba)1.0mg/l。

进一步，培养基的制备方法具体如下：分别按上述成分配置六种母液，包括大量元素、氯化钙、微量元素、金属元素、肌醇、维生素，其中大量元素各组分需分别在不同容器溶解后再按顺序加入，其它母液按顺序溶解于同一容器即可。再配置好所需的激素，其中6-ba浓度为0.1mg/ml，需用少量1mol/l氢氧化钠溶液助溶后定容至100ml；naa和2.4-d浓度为0.1mg/ml，用少量乙醇助溶后定容至100ml；iba浓度为1mg/ml，用少量1mol/l氢氧化钠溶液助溶后定容至100ml。根据所要制作的培养基的配方先分别加入各个营养母液，搅拌均匀后，分装到瓶内，再按溶液量加入所需的激素，调整培养基的最适ph为6，最后按溶液量加入琼脂粉，高压蒸汽灭菌后冷却备用。

2.取材：取“聊红椿”侧枝的腋芽及顶芽作为外植体，放置于小烧杯中，先用手轻轻剥去腋芽及顶芽的外层鳞片，直至露出浅绿色组织为止，用无菌水反复冲洗5~6次，捞出备用。

3.消毒：提前将所用器具放入超净工作台中灭菌2h，在超净工作台中将上述臭椿腋芽或顶芽取出，在75%的酒精中浸泡30s，接着取出放置在15%的次氯酸钠溶液中浸泡10~15min，并放入0.1%的升汞溶液中消毒3~5min，取出后用无菌水反复冲洗7~8次。

4.接种：在超净工作台中将材料接种到ms培养基，注意将消毒后的腋芽组织埋进培养基中。

5.培养：脱分化及继代培养条件为温度26℃，无光照；再分化萌芽及生根过程中的温度26℃、光照时间16h黑暗8h。

6.炼苗与定植：将生根的组培苗转移到人工气候室外的普通温室闭瓶炼苗10天左右（遮荫度50%~70%），然后打开瓶口3~7天；然后取出试管苗洗净，移栽到育苗穴盘中灭菌的基质中，基质由1：1的草炭土和蛭石制备，并喷水浇平，放入驯化室，培养至30公分左右可大田定植。本发明的优势为：

（1）首次探索了林木新品种‘聊红椿’（证书号为20170268）的组培培养技术，该技术体系的建立能满足‘聊红椿’快繁需求，具有生产容易、成本低、易操作、繁殖系数大等优点。

（2）培养基激素添加比例是适合本品种和特定材料的特有配方，激素不足或超出均易造成脱分化和再分化试验环节的失败，对其它植物品种或者该椿树品种的其它组织材料，激素添加比例仅具有参考价值。

（3）以腋芽作为聊红椿组培外植体是本项目的创新，相较于其它植物组织如叶盘、茎段、果荚等脱分化成功率最高，并且除了生长季节外也能在休眠季节取材，对于开展科研与生产能够不受生长季节的限制。

（4）外植体制备、消毒与接种，脱分化及愈伤组织培养，芽及根的再分化及再生苗培养，组培苗的炼苗和定植等技术适用本试验材料，对其它材料仅具有参考价值。

附图说明

图1为聊红椿愈伤组织；

图2为聊红椿组培芽的形成；

图3为聊红椿与普通臭椿对比图；

图4为聊红椿与普通臭椿翅果对比图。

具体实施方式

为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合具体实施方式，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施方式仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。

实施例1：

一种植物新品种聊红椿的组培快繁方法，包括如下步骤：

（1）取材：取聊红椿侧枝的腋芽及顶芽，放置于小烧杯中，先用手轻轻剥去腋芽及顶芽的几层鳞片，直至露出浅绿色组织为止；用无菌水反复冲洗5~6次，捞出备用；

（2）消毒：提前将所用器具放入超净工作台中灭菌2h，在超净工作台中将上述臭椿腋芽或顶芽取出，在75%的酒精中浸泡30s，接着取出放置在15%的次氯酸钠溶液中浸泡10~15min，并放入0.1%的升汞溶液中消毒3~5min，取出后用无菌水反复冲洗7~8次；

（3）接种：在超净工作台中将材料接种到ms培养基，注意将消毒后的腋芽组织埋进培养基中；

（4）培养：脱分化及愈伤组织继代培养条件为温度26℃，无光照；再分化过程的萌芽及生根阶段的温度为26℃，光照时间16h黑暗8h；

（5）炼苗与定植：将已生根的聊红椿组培苗转移到人工气候室外的普通温室闭瓶炼苗10天左右（遮荫度50%~70%），然后打开瓶口3~7天；最后取出试管苗、洗净、移栽到育苗穴盘中灭菌的基质中，基质由1：1的草炭土和蛭石制备，并喷水浇平，放入驯化室培养至30公分即可大田定植。

其中，培养基成分包含有以下原料：①50×大量元素母液（含硝酸铵、硝酸钾、磷酸二氢钾、七水硫酸镁）；②100×氯化钙；③100×金属元素（含有七水硫酸亚铁、乙二胺四乙酸二钠）；④100×微量元素（含有碘化钾、硼酸、四水硫酸锰、七水硫酸锌、二水合钼酸钠、五水硫酸铜、六水合氯化钴）；⑤1000×维生素（含有硫胺素、吡哆素、泛酸、甘氨酸）⑥100×肌醇；⑦激素选用萘乙酸（naa）0.1mg/ml、2.4-二氯苯氧乙酸（2.4-d）0.1mg/ml、6-苄氨基嘌呤（6-ba）0.1mg/ml、吲哚丁酸（iba）1mg/ml；⑧蔗糖；⑨琼脂。

分别配置好上述六种母液：大量元素、氯化钙、微量元素、金属元素、肌醇、维生素。其中大量元素各组分需分别在不同容器溶解后再按顺序加入，其他母液按顺序溶解于同一容器即可；再配置好所需的激素，其中6-ba为0.1mg/ml，用少量1mol/l氢氧化钠溶液助溶后加至100ml，naa和2.4-d为0.1mg/ml，用少量乙醇助溶后加至100ml；根据所要制作的培养基的配方先分别加入各个营养母液，搅拌均匀后，分装到瓶内（50ml），再按溶液量加入所需的激素，其中每个瓶内naa和2.4-d取50微升母液，6-ba取50微升母液，调整ph值为6，最后按溶液量每瓶加1.0g-1.2g琼脂粉，高压灭菌后冷却凝固备用。

实施例2：

与实施例1不同的是，诱导脱分化培养基所加入的原料（以1l为例）：蔗糖20g、琼脂粉20-24g、大量元素母液20ml、氯化钙母液10ml、金属元素母液10ml、微量元素母液10ml、维生素母液1ml、肌醇10ml、萘乙酸终浓度（naa）0.1mol/l、2.4-二氯苯氧乙酸（2.4-d）终浓度0.1mol/l、6-苄氨基嘌呤（6-ba）终浓度0.1mol/l，制备方法同实施例1。

实施例3：

与实施例1不同的是，继代培养的培养基原料（以1l为例）：包括蔗糖20g、琼脂粉20-24g、大量元素母液20ml、氯化钙母液10ml、金属元素母液10ml、微量元素母液10ml、维生素母液1ml、肌醇母液10ml，萘乙酸（naa）终浓度0.1mol/l、2.4-二氯苯氧乙酸（2.4-d）终浓度0.1mol/l、6-苄氨基嘌呤（6-ba）终浓度0.2mol/l，制备方法同实施例1。

实施例4：

愈伤组织萌芽的培养基由以下原料组成（以1l为例）：蔗糖20g、琼脂粉20-24g、大量元素母液20ml、氯化钙母液10ml、金属元素母液10ml、微量元素母液10ml、维生素母液1ml、肌醇母液10ml、萘乙酸（naa）终浓度0.1mol/l、2.4-二氯苯氧乙酸（2.4-d）终浓度0.1mol/l、6-苄氨基嘌呤（6-ba）终浓度3mol/l。制备方法同实施例1。

实施例5：

试管苗生根的培养基原料（以1l为例）：蔗糖20g、琼脂粉20-24g、大量元素母液10ml、氯化钙母液5ml、金属元素母液5ml、微量元素母液5ml、维生素母液0.5ml、肌醇母液5ml，吲哚丁酸(iba)1.0mg/l，制备方法同实施例1。

对于本领域技术人员而言，显然本发明不限于上述示范性实施例的细节，而且在不背离本发明的精神或基本特征的情况下，能够以其它的具体形式实现本发明。因此，无论从哪一点来看，均应将实施例看作是示范性的，而且是非限制性的，本发明的范围由所附权利要求而不是上述说明限定，因此旨在将落在权利要求的等同要件的含义和范围内的所有变化囊括在本发明内。