植物源萜烯化合物在防治甜菜夜蛾方面的应用的制作方法

[0001]
本发明属于植物保护领域，具体涉及植物源次生代谢产物在防治甜菜夜蛾方面的应用，更具体涉及三种植物源萜烯化合物的新用途。


背景技术：

[0002]
甜菜夜蛾spodoptera exigua(h
ü
bner)属鳞翅目夜蛾科，是一种杂食性、迁移能力强、分布范围广的世界性害虫，其寄主种类众多，且多在蔬菜、棉花等经济作物中爆发，造成巨大经济损失。甜菜夜蛾在我国爆发频率逐年增高，呈现高频率、高危害等特点，爆发高频地区主要集中在华东地区。这些地区土地肥沃，农作物种类繁多、种植方式多样、设施蔬菜面积大，使甜菜夜蛾具有了频繁爆发的条件，防治工作迫在眉睫。
[0003]
甜菜夜蛾对蔬菜等经济作物危害极大，其幼虫危害刚成熟的蔬菜，低龄幼虫一般危害菜叶，高龄幼虫则可危害菜叶、花，而严重时叶片、花心、花等均可被啮食光。甜菜夜蛾危害具有间歇性、隐蔽性、暴食性和突发性等特点，可隐藏在农作物中，并在短时间内突然爆发，使农户措手不及，造成严重损失。目前，生产上农户对这种害虫的防治手段主要依靠化学防治，而大面积喷洒农药对环境伤害较大，并可能引起“3r”问题。因此，在生产上，研发针对甜菜夜蛾高效绿色的防治手段迫在眉睫。
[0004]
植物次生代谢产物是指植物体中一大类非生长发育所必需的小分子有机化合物，可以帮助植物防御病害，虫害及环境胁迫。萜烯是植物次生代谢产物中最大的一类，如(e)-β-法尼烯、α-葎草烯、橙花叔醇、石竹烯、柠檬烯等。前期研究表明，这些植物次生代谢产物及其衍生物通过挥发性气味诱集害虫从而降低对植物的危害。
[0005]
在本发明之前尚未有对于甜菜夜蛾生长发育及生殖产卵具有显著作用的化合物的报道，此项研究对于甜菜夜蛾新型绿色防治具有重要意义。


技术实现要素：

[0006]
发明目的：基于上述存在的问题，我们首先通过室内y型嗅觉仪实验研究发现，(e)-β-法尼烯、α-葎草烯、橙花叔醇这三种植物次生代谢物质的单品，对于甜菜夜蛾雌成虫产卵选择及三龄幼虫的行为没有显著影响(p＞0.05)，也就是该(e)-β-法尼烯、α-葎草烯、橙花叔醇这三种植物次生代谢物质并不能通过气味诱集甜菜夜蛾。进一步地，预实验通过饲料拌毒生测法，初步明确了众多植物源次生代谢产物如(e)-β-法尼烯、α-葎草烯、橙花叔醇、石竹烯(caryophyllene)、柠檬烯(limonene)之中，(e)-β-法尼烯、α-葎草烯、橙花叔醇对于甜菜夜蛾生长发育与生殖产卵具有显著的抑制作用(p＜0.05)，而其它的代谢产物种类作用并不显著(p＞0.05)。因此，我们看到了利用(e)-β-法尼烯、α-葎草烯、橙花叔醇开发针对甜菜夜蛾新型杀虫剂的可能。同时，本实验室分别在水稻、紫花苜蓿中克隆得到(e)-β-法尼烯、α-葎草烯、橙花叔醇生物合成关键酶类基因，可以利用转基因超表达的方法在靶标植物中超表达，提高其含量。结合农药研发技术，我们进而可以利用(e)-β-法尼烯、α-葎草烯、橙花叔醇调控甜菜夜蛾种群数量进而开展综合防治。因此，本发明所要解决的技术问题
是提供了植物源萜烯化合物防治甜菜夜蛾方面的新应用。
[0007]
技术方案：为了解决上述技术问题，本发明提供了植物源萜烯化合物在防治甜菜夜蛾方面的应用。
[0008]
本发明内容还包括植物源萜烯化合物在制备甜菜夜蛾产卵抑制剂中的应用本发明内容还包括植物源萜烯化合物在制备甜菜夜蛾幼虫致死剂中的应用。
[0009]
其中，所述植物源萜烯化合物为(e)-β-法尼烯、α-葎草烯或橙花叔醇中的一种或几种。
[0010]
其中，所述应用具体包括将植物源萜烯化合物饲喂幼虫期的甜菜夜蛾。
[0011]
其中，所述植物源萜烯化合物为(e)-β-法尼烯、α-葎草烯或橙花叔醇中的一种或几种。
[0012]
其中，所述(e)-β-法尼烯的添加量为4.310～8.62g/kg饲料，所述α-葎草烯的添加量为4.445～8.89g/kg饲料，所述橙花叔醇的添加量为4.375～8.75g/kg饲料。关于所述三种植物源次生代谢产物在防治甜菜夜蛾方面应用的具体措施如下：
[0013]
(1)甜菜夜蛾幼虫的养殖与含有不同浓度的植物次生代谢产物饲料配置；
[0014]
(2)分别采用(e)-β-法尼烯、α-葎草烯、橙花叔醇饲料处理下，甜菜夜蛾的生物测定。
[0015]
具体地，将同一批发育整齐的甜菜夜蛾2龄幼虫置于培养皿中，分别用以上三种饲料进行处理，每个处理3次重复，每个重复5皿，每皿5头。
[0016]
本发明内容还包括一种甜菜夜蛾产卵抑制剂，所述甜菜夜蛾产卵抑制剂包括(e)-β-法尼烯、α-葎草烯或橙花叔醇中的一种或几种。
[0017]
其中，所述(e)-β-法尼烯、α-葎草烯或橙花叔醇浓度均为5μl/ml-10μl/ml。
[0018]
本发明内容还包括一种甜菜夜蛾幼虫致死剂，所述甜菜夜蛾2龄幼虫及整个幼虫期的致死剂包括(e)-β-法尼烯、α-葎草烯或橙花叔醇中的一种或几种。
[0019]
其中，所述(e)-β-法尼烯、α-葎草烯或橙花叔醇浓度均为5μl/ml-10μl/ml。
[0020]
有益效果：本发明首次鉴定出含有三种特异性植物源次生代谢产物的饲料饲喂可以显著提高甜菜夜蛾幼虫的死亡率(p＜0.05)，并显著抑制甜菜夜蛾的单雌产卵量(p＜0.05)，相关实验表明这三种植物源次生代谢产物可以显著降低甜菜夜蛾的种群数量，降低其危害，并有益于甜菜夜蛾田间新型杀虫剂的研发及综合防治。
附图说明
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图1不同植物次生代谢产物处理下甜菜夜蛾2龄幼虫的死亡率；
[0022]
图2不同植物次生代谢产物处理下甜菜夜蛾幼虫期总的死亡率；
[0023]
图3不同植物次生代谢产物处理下甜菜夜蛾单雌产卵量。
具体实施方式
[0024]
下面结合具体的实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。此外应理解在阅读了本发明讲授的内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于申请所附权利要求书所限定的范围。
[0025]
除非特别说明，本发明采用的试剂、方法和设备为本技术领域常规试剂、方法和设备。
[0026]
(e)-β-法尼烯、α-葎草烯、橙花叔醇标准样品购于sigma-aldrich公司。
[0027]
实施例1甜菜夜蛾人工饲料配制以及甜菜夜蛾幼虫的养殖
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甜菜夜蛾人工饲料配制过程：
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第一步：进行各组分的准备工作，取1200g麦胚粉和400g大豆粉，加入4000ml水，混合均匀后放入灭菌锅煮熟(条件121℃，35min)，配制成组份1；取100g琼脂加入2000ml水，微波30min，其间需要从微波炉中取出并搅拌2-3次；然后用相应用量的山梨酸10g、酵母粉120g、链霉素0.6g、对羟基甲酸甲酯20g、vc 40g、肌醇2g和复合维生素0.37g与200ml凉开水混合配制成组份2，待用；
[0030]
第二步：将配制好的组份1取出稍放凉，加入琼脂搅匀至凝固，再放凉至六十度左右；加入配好的组份2和16ml 10％甲醛，搅拌均匀后倒入泡沫盒或塑料杯中，待饲料冷却后盖上纱布，置于4℃冰箱中保存即得。
[0031]
甜菜夜蛾幼虫的养殖供试虫源及饲养方法：
[0032]
供试甜菜夜蛾虫源由江苏省农科院植保所赵静老师提供，甜菜夜蛾种群扩繁，试虫各虫态均饲养于安徽师范大学生科院养虫室内，设置温度为27
±
1℃，相对湿度65
±
5％，光周期l∶d＝14∶10。甜菜夜蛾整个幼虫期均在室内不接触药剂，及时补充更换饲料并注意保持环境的清洁，所有器具都及时清洗消毒，同时使用紫外线灭菌，采用人工饲料继代饲养。
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结论：此甜菜夜蛾饲料配方有效，可以用于大量繁殖甜菜夜蛾。
[0034]
实施例2 y型嗅觉实验测定(e)-β-法尼烯、α-葎草烯、橙花叔醇对甜菜夜蛾幼虫及成虫的嗅觉识别实验
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利用室内y型嗅觉仪对甜菜夜蛾三龄幼虫以及雌成虫进行实验，将同一批发育整齐的甜菜夜蛾3龄幼虫置于y型管一端，一侧管分别加入10μl矿物油以及5μl(e)-β-法尼烯、5μl α-葎草烯或5μl橙花叔醇挥发物，另一侧管加入15μl矿物油作为溶剂对照。结果如表1所示。
[0036]
表1
[0037][0038]
(e)-β-法尼烯、α-葎草烯和橙花叔醇对甜菜夜蛾幼虫及雌成虫的吸引力
[0039]
结论：根据表1，(e)-β-法尼烯、α-葎草烯和橙花叔醇处理下甜菜夜蛾幼虫及雌成虫选择百分率分析，表明三种挥发物对于甜菜夜蛾幼虫及成虫均没有显著吸引效果(p＞0.05)；同时，不选择甜菜夜蛾的百分率甚至超过了选择的比率。表明植物次生代谢产物对于甜菜夜蛾幼虫及成虫均没有诱集作用。
[0040]
实施例3含有不同浓度的植物次生代谢产物饲料配制
[0041]
利用500μl乙醇分别对500μl(e)-β-法尼烯、α-葎草烯和橙花叔醇标准样品进行溶解配制成母液，然后再使用双蒸水配制甜菜夜蛾人工饲料至100ml(注意：实际操作中，实施例1的配方，甜菜夜蛾人工饲料配制初始，不加琼脂，最后双蒸水定容100ml后再加琼脂至凝固)，同时，设置含有500μl/100ml人工饲料的乙醇对照及无添加对照。
[0042]
配制含有(e)-β-法尼烯、α-葎草烯、橙花叔醇、乙醇对照及无添加对照的人工饲料，浓度分别为4.310g/kg饲料，4.445g/kg饲料，4.375g/kg饲料，3.945g/kg饲料，以及无添加对照人工饲料，并成功开展生测试验。
[0043]
5μl/ml饲料浓度(e)-β-法尼烯、α-葎草烯、橙花叔醇、石竹烯、柠檬烯的千克比分别为4.310g/kg饲料，4.445g/kg饲料，4.375g/kg饲料，4.510g/kg饲料；4.210g/kg饲料。
[0044]
1μl/ml饲料浓度(e)-β-法尼烯、α-葎草烯、橙花叔醇的千克比分别为0.862g/kg饲料，0.889g/kg饲料，0.875g/kg饲料。
[0045]
10μl/ml饲料浓度(e)-β-法尼烯、α-葎草烯、橙花叔醇的千克比分别为8.62g/kg饲料，8.89g/kg饲料，8.75g/kg饲料。
[0046]
实施例4(e)-β-法尼烯、α-葎草烯、橙花叔醇饲料处理下，甜菜夜蛾2龄幼虫及幼虫期总死亡率测定
[0047]
取含有不同次生代谢产物的实施例3配制的人工饲料，将同一批发育整齐的2龄初期甜菜夜蛾幼虫置于培养皿中，分别进行5μl/ml浓度的不同次生代谢产物处理，每个处理5
次重复，每个重复10皿，每皿5头，每种药剂处理的甜菜夜蛾幼虫数不少于250头，饲养条件同实施例1。接种后，每天统计幼虫死亡率，直到幼虫化蛹为止，其中以毛笔触动虫体多次无反应视为死亡。
[0048]
结论：如图1所示，相比乙醇对照及无处理对照，三种植物次生代谢产物，(e)-β-法尼烯、α-葎草烯、橙花叔醇可以显著提高甜菜夜蛾幼虫死亡率(p＜0.05)，其中α-葎草烯的效果显著高于(e)-β-法尼烯及橙花叔醇(p＜0.05)，而(e)-β-法尼烯与橙花叔醇之间在提高2龄期幼虫死亡率方面的效果无差别(p＞0.05)。
[0049]
另外，我们通过对5μl/ml饲料浓度的石竹烯、柠檬烯，以及1μl/ml饲料浓度的(e)-β-法尼烯、α-葎草烯、橙花叔醇采用同样的喂饲实验中发现致死率均低于20％，且远低于5μl/ml饲料(e)-β-法尼烯、α-葎草烯、橙花叔醇，故这些试剂及浓度不在本发明保护范围内，在此不作进一步讨论。
[0050]
实施例5(e)-β-法尼烯、α-葎草烯、橙花叔醇饲料处理下，甜菜夜蛾单雌产卵量测定
[0051]
取含有不同次生代谢产物的实施例3配制的人工饲料，将同一批发育整齐的甜菜夜蛾2龄初幼虫置于培养皿中，分别进行5μl/ml浓度的不同次生代谢产物处理，每个处理5次重复，每个重复10皿，每皿5头，每种药剂处理的甜菜夜蛾幼虫数不少于250头，饲养条件同实施例1。接种后，对于单雌产卵量，在每个养虫笼子中，放置10头雄成虫、10头雌成虫，统计产卵量，计算单雌产卵量。
[0052]
结论：如图3所示，相比乙醇对照及无处理对照，三种植物次生代谢产物，(e)-β-法尼烯、α-葎草烯、橙花叔醇可以显著抑制甜菜夜蛾的单雌产卵量(p＜0.05)，其中(e)-β-法尼烯及橙花叔醇的效果显著高于α-葎草烯(p＜0.05)，而(e)-β-法尼烯与橙花叔醇之间无差别(p＞0.05)，揭示了(e)-β-法尼烯、α-葎草烯、橙花叔醇及其衍生物的单品、混合物可以作为甜菜夜蛾的产卵抑制剂，具有很强的应用前景。
[0053]
另外，我们通过对5μl/ml饲料浓度的石竹烯、柠檬烯，1μl/ml饲料浓度的(e)-β-法尼烯、α-葎草烯、橙花叔醇采用同样的喂饲实验中发现对于甜菜夜蛾产卵没有显著的抑制作用(p＞0.05)，且效果远低于5μl/ml饲料(e)-β-法尼烯、α-葎草烯、橙花叔醇，故这些试剂以及浓度也不在本发明保护范围内，不作深入探讨。
[0054]
以上实施例结果证明只有在5μl/ml饲料浓度之上范围内的(e)-β-法尼烯、α-葎草烯以及橙花叔醇才能对甜菜夜蛾幼虫产生强烈致死作用，同时抑制其生殖产卵，低于此浓度效果有限，不在本专利保护范围内。
[0055]
然而，高于10μl/ml饲料浓度的(e)-β-法尼烯、α-葎草烯以及橙花叔醇所需的三种试剂已经十分昂贵，导致防治甜菜夜蛾的性价比极低，没有实际价值，故本发明保护浓度范围为5μl/ml-10μl/ml饲料浓度。
[0056]
(e)-β-法尼烯、α-葎草烯和橙花叔醇，也就是千克比为4.310g/kg-8.62g/kg饲料浓度的(e)-β-法尼烯，4.445g/kg-8.89g/kg饲料浓度的α-葎草烯饲料以及4.375g/kg-8.75g/kg饲料浓度橙花叔醇。