一种年青煤降解液综合效价检测方法与流程

本发明涉及一种年青煤降解液综合效价检测方法，尤其是涉一种评价年青煤降解液调节植物生长活性的综合效价的检测方法，属于生物检测技术领域。

背景技术：

研究人员在用氧化剂对褐煤、泥炭等年青煤进行氧化降解时，发现了一种无色透明的蒸馏液，其ph在2.0到2.6之间，呈弱酸性，将其称为年青煤降解液。初步研究发现该降解液在调节土壤酸碱度，提高种子发芽率，增强作物抗逆性（抗盐、抗旱），促进作物生长发育，增加作物产量等方面都具有极好的效果，可作为一种新型的多功能农作物调理剂。其制备方法及作为植物生长调节剂的应用已申请国家发明专利，并获得授权（申请号：201410006333.5）。目前，年青煤降解液作为一种作用显著的新型作物生长调节剂已进入商品化阶段，但其调节植物生理活性的评价方法一直是其推广应用和商品化的瓶颈。到现在为止还没有行之有效的针对该降解液活性的化学或生物的标准化检测方法出现。一方面，降解液含有大量小分子的酸性物质，极性极强，且性质近，难以使用常见的hplc、gc等技术手段对其进行分离鉴定及定量分析；另一方面，对于一种新型的天然活性物质，即使实现了部分化学成分的定量分析，因其活性的物质基础不明，也难以确定哪些是活性物质，是否具有代表性，不同成分之间是否具有协同作用等。再者，以作物生长发育程度或产量作为检测指标的常规方法，因影响因素多、周期长、成本高，也不适于标准化方法的建立及推广应用，这些原因使年青煤降解液活性测定标准化方法的建立面临巨大挑战。

更进一步的研究发现，年青煤降解液上述诸多活性之间存在很大的关联性，即通过提高种子发芽率、调节发育过程、增强作物抗逆性（抗盐、抗旱）等作用从整体上促进作物生长发育，最终增加作物产量。但对于不同来源或不同稀释浓度的降解液样品，各种作用之间并不是完全的正相关，例如可能存在某一样品可以增加作物种子发芽率，却抑制胚根伸长及降低幼苗重量的情况，或者说整体活性相似的不同样品对植物不同生长参数的调节强度是不一致的，所以单一的活性指标难以准确地评价降解液的整体活性。

技术实现要素：

针对以上问题，本发明建立了一套综合效价检测方法，即检测盐胁迫环境下年青煤降解液对作物种子萌发和生长过程中多种代表性优选参数的影响，通过对比研究转化为生物效价来表征降解液对作物生长发育的整体调节作用；相对于化学分析法，该方法可以更直观、准确地表征年青煤降解液调节植物生长的活性，在其生物检测方面取得突破，填补了年青煤降解液这一新型天然产物活性检测方法的空白。

本发明提供一种年青煤降解液综合效价检测方法，特别是一种生物检测的标准化方法，具体内容如下：

（1）取籽粒饱满的白菜种子用水漂洗，经10%naclo消毒8-10min后用无菌蒸馏水冲洗6-8次，用蒸馏水或稀释一百倍的年青煤降解液将白菜种子浸泡5-6h进行致敏；

（2）取步骤（1）同批用蒸馏水浸泡致敏一致的白菜种子240粒，整齐摆放到3个直径为15cm的底部铺有1层滤纸的培养皿中，每皿80粒（即平行试验三次），各加入15ml含120mmol/lnacl的hoagland's培养液，记为蒸馏水组；

（3）另取步骤（1）同批用年青煤降解液浸泡致敏一致的白菜种子240粒，整齐摆放到3个直径为15cm的底部铺有1层滤纸的培养皿中，每皿80粒（即平行试验三次），各加入15ml含120mmol/lnacl的hoagland's培养液，记为降解液组；

（4）将步骤（2）的蒸馏水组和步骤（3）的降解液组种子在相同环境下用恒温培养箱进行培养，昼夜温度保持在25-30℃，平均光周期为12h，每12h用称重法在培养皿中注水补充蒸发失去的水分，保证盐浓度的恒定；

（5）以种子胚根长度超过种子长度的1/2作为种子发芽的标准，在培养60h后计算种子发芽率；在培养108h后测量胚根长度；在培养156h后测量幼苗鲜重；

（6）通过对比蒸馏水组种子与降解液组种子的发芽率、胚根长度和幼苗鲜重，分别计算年青煤降解液的发芽效价（f）、胚根伸长效价（p）和幼苗质量效价（y），最后计算得综合效价（z），f=（降解液组发芽率/蒸馏水组发芽率－1）×100；p=（降解液组胚根长度/蒸馏水组胚根长度－1）×100；y=（降解液组幼苗鲜重/蒸馏水组幼苗鲜重－1）×100；z=a×f+b×p+c×y，其中a、b、c为效价指数，对于白菜种子a=2.8，b=3.0，c=4.2，效价正值表示促进作用，负值表示抑制作用；绝对值越大表示调节植物生长的作用越强。

本检测方法所述白菜的品种为黄心菜，是十字花科芸苔属芸苔种大白菜亚种的一个栽培品种，为不结球白菜，优选黄心菜的种子作为试验材料，其发芽时间短，发芽温度要求不高，盐胁迫下发芽率适中、稳定，最大程度地减少了检测时间，提高了方法的稳定性和适用性。

本检测方法所测定的样品——年青煤降解液，特指已授权的发明专利“一种年青煤降解液的生产方法及其用途”（申请号cn201410006333.5）中所述的年青煤降解液，其含义及制备方法可参考该专利的内容。

在本方法中，所有试验参数为优化后的最佳条件，但种子消毒时间、蒸馏水冲洗次数、种子浸泡时间、培养温度等参数在所规定范围内变动不影响检测结果的稳定性及方法的标准化，而允许非关键因素小范围的变化可增加方法的适应性，降低成本。

本发明的优势与创新：

（1）首次通过检测年青煤降解液对作物种子萌发和生长过程中代表性优选参数的影响并与空白组对比研究，成功构建年青煤降解液活性检测的综合效价模型。

（2）相对于化学分析法，该生物检测方法可以更直观、准确地检测年青煤降解液对植物生长发育的整体调节作用的大小。

（3）该方法稳定性好，适用性强，标准化程度高；同时易操作、时间短、成本低，适于大规模推广使用，填补了年青煤降解液活性检测方法的空白，为其产品的推广应用和产业化开发扫除一大障碍。

附图说明

图1为样品综合效价与白菜单株均重（产量）的变化趋势对比；

图2为样品综合效价与白菜单株均重（产量）的回归分析。

具体实施方式

下面通过实施例对本发明作进一步详细说明，但本发明保护范围不局限于所述内容。

实施例1

本实施例以云南昭通褐煤为原料，按专利“一种年青煤降解液的生产方法及其用途”（申请号cn201410006333.5）中实施例1的方法制备年青煤降解液（样品1），测定其ph，对此年青煤降解液调节植物生长活性综合效价进行检测，具体方法如下：

（1）取籽粒饱满的白菜种子用水漂洗，经10%naclo消毒8min后用无菌蒸馏水冲洗6次，用蒸馏水或稀释一百倍的年青煤降解液将白菜种子浸泡5h进行致敏；

（2）取步骤（1）同批用蒸馏水浸泡致敏一致的白菜种子240粒，整齐摆放到3个直径为15cm的底部铺有1层滤纸的培养皿中，每皿80粒（即平行试验三次），各加入15ml含120mmol/lnacl的hoagland's培养液，记为蒸馏水组；

（3）另取步骤（1）同批用年青煤降解液浸泡致敏一致的白菜种子240粒，整齐摆放到3个直径为15cm的底部铺有1层滤纸的培养皿中，每皿80粒（即平行试验三次），各加入15ml含120mmol/lnacl的hoagland's培养液，记为降解液组；

（4）将步骤（2）的蒸馏水组和步骤（3）的降解液组种子在相同环境下进行用恒温培养箱进行培养，昼夜温度保持在25℃，平均光周期为12h，每12h用称重法在培养皿中注水补充蒸发失去的水分，保证盐浓度的恒定；

（5）以种子胚根长度超过种子长度的1/2作为种子发芽的标准，在培养60h后计算种子发芽率；在培养108h后测量胚根长度；在培养156h后测量幼苗鲜重；

（6）通过对比蒸馏水组种子与降解液组种子的发芽率、胚根长度和幼苗鲜重，分别计算年青煤降解液的发芽效价（f）、胚根伸长效价（p）和幼苗质量效价（y），最后计算得综合效价（z），f=（降解液组发芽率/蒸馏水组发芽率－1）×100；p=（降解液组胚根长度/蒸馏水组胚根长度－1）×100；y=（降解液组幼苗鲜重/蒸馏水组幼苗鲜重－1）×100；z=2.8×f+3.0×p+4.2×y。

试验结束后，白菜幼苗再培养15天，将其移植到温室的土壤中继续生长，每隔10天叶面喷施稀释一百倍的本实施例制备得到的年青煤降解液一次，待移植后第50天采摘，测定白菜单株均重。

实施例2

本实施例以云南峨山褐煤为原料，按专利“一种年青煤降解液的生产方法及其用途”（申请号cn201410006333.5）中实施例1的方法制备年青煤降解液（样品2），测定其ph，对此年青煤降解液调节植物生长活性综合效价进行检测，具体方法如下：

（1）取籽粒饱满的白菜种子用水漂洗，经10%naclo消毒10min后用无菌蒸馏水冲洗6次，用蒸馏水或稀释一百倍的年青煤降解液将白菜种子浸泡6h进行致敏；

（2）取步骤（1）同批用蒸馏水浸泡致敏一致的白菜种子240粒，整齐摆放到3个直径为15cm的底部铺有1层滤纸的培养皿中，每皿80粒（即平行试验三次），各加入15ml含120mmol/lnacl的hoagland's培养液，记为蒸馏水组；

（3）另取步骤（1）同批用年青煤降解液浸泡致敏一致的白菜种子240粒，整齐摆放到3个直径为15cm的底部铺有1层滤纸的培养皿中，每皿80粒（即平行试验三次），各加入15ml含120mmol/lnacl的hoagland's培养液，记为降解液组；

（4）将步骤（2）的蒸馏水组和步骤（3）的降解液组种子在相同环境下进行用恒温培养箱进行培养，昼夜温度保持在30℃，平均光周期为12h，每12h用称重法在培养皿中注水补充蒸发失去的水分，保证盐浓度的恒定；

（5）以种子胚根长度超过种子长度的1/2作为种子发芽的标准，在培养60h后计算种子发芽率；在培养108h后测量胚根长度；在培养156h后测量幼苗鲜重；

（6）通过对比蒸馏水组种子与降解液组种子的发芽率、胚根长度和幼苗鲜重，分别计算年青煤降解液的发芽效价（f）、胚根伸长效价（p）和幼苗质量效价（y），最后计算得综合效价（z），f=（降解液组发芽率/蒸馏水组发芽率－1）×100；p=（降解液组胚根长度/蒸馏水组胚根长度－1）×100；y=（降解液组幼苗鲜重/蒸馏水组幼苗鲜重－1）×100；z=2.8×f+3.0×p+4.2×y。

试验结束后，白菜幼苗再培养15天，将其移植到温室的土壤中继续生长，每隔10天叶面喷施稀释一百倍的本实施例制备得到的年青煤降解液一次，待移植后第50天采摘，测定白菜单株均重。

实施例3

本实施例以云南寻甸褐煤为原料，按专利“一种年青煤降解液的生产方法及其用途”（申请号cn201410006333.5）中实施例1的方法制备年青煤降解液（样品3），测定其ph，对此年青煤降解液调节植物生长活性综合效价进行检测，具体方法如下：

（1）取籽粒饱满的白菜种子用水漂洗，经10%naclo消毒9min后用无菌蒸馏水冲洗6次，用蒸馏水或稀释一百倍的年青煤降解液将白菜种子浸泡6h进行致敏；

（2）取步骤（1）同批用蒸馏水浸泡致敏一致的白菜种子240粒，整齐摆放到3个直径为15cm的底部铺有1层滤纸的培养皿中，每皿80粒（即平行试验三次），各加入15ml含120mmol/lnacl的hoagland's培养液，记为蒸馏水组；

（3）另取步骤（1）同批用年青煤降解液浸泡致敏一致的白菜种子240粒，整齐摆放到3个直径为15cm的底部铺有1层滤纸的培养皿中，每皿80粒（即平行试验三次），各加入15ml含120mmol/lnacl的hoagland's培养液，记为降解液组；

（4）将步骤（2）的蒸馏水组和步骤（3）的降解液组种子在相同环境下进行用恒温培养箱进行培养，昼夜温度保持在28℃，平均光周期为12h，每12h用称重法在培养皿中注水补充蒸发失去的水分，保证盐浓度的恒定；

（5）以种子胚根长度超过种子长度的1/2作为种子发芽的标准，在培养60h后计算种子发芽率；在培养108h后测量胚根长度；在培养156h后测量幼苗鲜重；

（6）通过对比蒸馏水组种子与降解液组种子的发芽率、胚根长度和幼苗鲜重，分别计算年青煤降解液的发芽效价（f）、胚根伸长效价（p）和幼苗质量效价（y），最后计算得综合效价（z），f=（降解液组发芽率/蒸馏水组发芽率－1）×100；p=（降解液组胚根长度/蒸馏水组胚根长度－1）×100；y=（降解液组幼苗鲜重/蒸馏水组幼苗鲜重－1）×100；z=2.8×f+3.0×p+4.2×y。

试验结束后，白菜幼苗再培养15天，将其移植到温室的土壤中继续生长，每隔10天叶面喷施稀释一百倍的本实施例制备得到的年青煤降解液一次，待移植后第50天采摘，测定白菜单株均重。

实施例4

本实施例以黑龙江宝清褐煤为原料，按专利“一种年青煤降解液的生产方法及其用途”（申请号cn201410006333.5）中实施例1的方法制备年青煤降解液（样品4），测定其ph，对此年青煤降解液调节植物生长活性综合效价进行检测，具体方法如下：

（1）取籽粒饱满的白菜种子用水漂洗，经10%naclo消毒10min后用无菌蒸馏水冲洗7次，用蒸馏水或稀释一百倍的年青煤降解液将白菜种子浸泡5.5h进行致敏；

（2）取步骤（1）同批用蒸馏水浸泡致敏一致的白菜种子240粒，整齐摆放到3个直径为15cm的底部铺有1层滤纸的培养皿中，每皿80粒（即平行试验三次），各加入15ml含120mmol/lnacl的hoagland's培养液，记为蒸馏水组；

（3）另取步骤（1）同批用年青煤降解液浸泡致敏一致的白菜种子240粒，整齐摆放到3个直径为15cm的底部铺有1层滤纸的培养皿中，每皿80粒（即平行试验三次），各加入15ml含120mmol/lnacl的hoagland's培养液，记为降解液组；

（4）将步骤（2）的蒸馏水组和步骤（3）的降解液组种子在相同环境下进行用恒温培养箱进行培养，昼夜温度保持在27℃，平均光周期为12h，每12h用称重法在培养皿中注水补充蒸发失去的水分，保证盐浓度的恒定；

（5）以种子胚根长度超过种子长度的1/2作为种子发芽的标准，在培养60h后计算种子发芽率；在培养108h后测量胚根长度；在培养156h后测量幼苗鲜重；

（6）通过对比蒸馏水组种子与降解液组种子的发芽率、胚根长度和幼苗鲜重，分别计算年青煤降解液的发芽效价（f）、胚根伸长效价（p）和幼苗质量效价（y），最后计算得综合效价（z），f=（降解液组发芽率/蒸馏水组发芽率－1）×100；p=（降解液组胚根长度/蒸馏水组胚根长度－1）×100；y=（降解液组幼苗鲜重/蒸馏水组幼苗鲜重－1）×100；z=2.8×f+3.0×p+4.2×y。

试验结束后，白菜幼苗再培养15天，将其移植到温室的土壤中继续生长，每隔10天叶面喷施稀释一百倍的本实施例制备得到的年青煤降解液一次，待移植后第50天采摘，测定白菜单株均重。

实施例5

本实施例以黑龙江宝清褐煤为原料，按专利“一种年青煤降解液的生产方法及其用途”（申请号cn201410006333.5）中实施例2的方法制备年青煤降解液（样品5），测定其ph，对此年青煤降解液调节植物生长活性综合效价进行检测，具体方法如下：

（1）取籽粒饱满的白菜种子用水漂洗，经10%naclo消毒8min后用无菌蒸馏水冲洗8次，用蒸馏水或稀释一百倍的年青煤降解液将白菜种子浸泡6h进行致敏；

（2）取步骤（1）同批用蒸馏水浸泡致敏一致的白菜种子240粒，整齐摆放到3个直径为15cm的底部铺有1层滤纸的培养皿中，每皿80粒（即平行试验三次），各加入15ml含120mmol/lnacl的hoagland's培养液，记为蒸馏水组；

（3）另取步骤（1）同批用年青煤降解液浸泡致敏一致的白菜种子240粒，整齐摆放到3个直径为15cm的底部铺有1层滤纸的培养皿中，每皿80粒（即平行试验三次），各加入15ml含120mmol/lnacl的hoagland's培养液，记为降解液组；

（4）将步骤（2）的蒸馏水组和步骤（3）的降解液组种子在相同环境下进行用恒温培养箱进行培养，昼夜温度保持在26℃，平均光周期为12h，每12h用称重法在培养皿中注水补充蒸发失去的水分，保证盐浓度的恒定；

（5）以种子胚根长度超过种子长度的1/2作为种子发芽的标准，在培养60h后计算种子发芽率；在培养108h后测量胚根长度；在培养156h后测量幼苗鲜重；

（6）通过对比蒸馏水组种子与降解液组种子的发芽率、胚根长度和幼苗鲜重，分别计算年青煤降解液的发芽效价（f）、胚根伸长效价（p）和幼苗质量效价（y），最后计算得综合效价（z），f=（降解液组发芽率/蒸馏水组发芽率－1）×100；p=（降解液组胚根长度/蒸馏水组胚根长度－1）×100；y=（降解液组幼苗鲜重/蒸馏水组幼苗鲜重－1）×100；z=2.8×f+3.0×p+4.2×y。

试验结束后，白菜幼苗再培养15天，将其移植到温室的土壤中继续生长，每隔10天叶面喷施稀释一百倍的本实施例制备得到的年青煤降解液一次，待移植后第50天采摘，测定白菜单株均重。

实施例6

本实施例以黑龙江宝清褐煤为原料，按专利“一种年青煤降解液的生产方法及其用途”（申请号cn201410006333.5）中实施例3的方法制备年青煤降解液（样品6），测定其ph，对此年青煤降解液调节植物生长活性综合效价进行检测，具体方法如下：

（1）取籽粒饱满的白菜种子用水漂洗，经10%naclo消毒8min后用无菌蒸馏水冲洗6次，用蒸馏水或稀释一百倍的年青煤降解液将白菜种子浸泡5h进行致敏；

（2）取步骤（1）同批用蒸馏水浸泡致敏一致的白菜种子240粒，整齐摆放到3个直径为15cm的底部铺有1层滤纸的培养皿中，每皿80粒（即平行试验三次），各加入15ml含120mmol/lnacl的hoagland's培养液，记为蒸馏水组；

（3）另取步骤（1）同批用年青煤降解液浸泡致敏一致的白菜种子240粒，整齐摆放到3个直径为15cm的底部铺有1层滤纸的培养皿中，每皿80粒（即平行试验三次），各加入15ml含120mmol/lnacl的hoagland's培养液，记为降解液组；

（4）将步骤（2）的蒸馏水组和步骤（3）的降解液组种子在相同环境下进行用恒温培养箱进行培养，昼夜温度保持在30℃，平均光周期为12h，每12h用称重法在培养皿中注水补充蒸发失去的水分，保证盐浓度的恒定；

（5）以种子胚根长度超过种子长度的1/2作为种子发芽的标准，在培养60h后计算种子发芽率；在培养108h后测量胚根长度；在培养156h后测量幼苗鲜重；

（6）通过对比蒸馏水组种子与降解液组种子的发芽率、胚根长度和幼苗鲜重，分别计算年青煤降解液的发芽效价（f）、胚根伸长效价（p）和幼苗质量效价（y），最后计算得综合效价（z），f=（降解液组发芽率/蒸馏水组发芽率－1）×100；p=（降解液组胚根长度/蒸馏水组胚根长度－1）×100；y=（降解液组幼苗鲜重/蒸馏水组幼苗鲜重－1）×100；z=2.8×f+3.0×p+4.2×y。

试验结束后，白菜幼苗再培养15天，将其移植到温室的土壤中继续生长，每隔10天叶面喷施稀释一百倍的本实施例制备得到的年青煤降解液一次，待移植后第50天采摘，测定白菜单株均重。

实施例1-6分别对不同原料产地及同一产地不同制备方法制备得到的年青煤降解液样品进行综合效价检测，同时测定生长过程中一直施用年青煤降解液的白菜成熟期的产量（以单株均重表示），产量是最直接、最能体现样品调节作用的指标，具体试验数据详见表1。

表1实施例1-6年青煤降解液综合效价的比较及对白菜产量的影响

从表中可知，对比实施例1-4，以不同产地的褐煤为原料，用同一方法制备的年青煤降解液，其ph值不同，对发芽效价、胚根伸长效价、幼苗质量效价、综合效价、单株均重这些指标的影响也有较大差异；对比实施例4-6，同一褐煤产地，提取方法不同时，降解液ph值相近，其综合效价或单株均重差异也不大，说明提取条件的稍微改变基本不影响其活性，同时也表明该评价方法的稳定性较好；对比实施例4和5，即使年青煤降解液对发芽效价、胚根伸长效价、幼苗质量效价这三个指标的影响趋势不一致，但综合效价相近时，单株均重也相近，体现了将不同指标进行统一设计“综合效价”的实际意义；从表中还可以看出，不同样品的综合效价与单株均重的变化趋势基本一致，表明该方法用于评价降解液调节植物生长活性的可靠性较好。

图1更直观地表明了综合效价与单株均重（产量）变化趋势的一致性较好；以单株均重（产量）为因变量，综合效价为自变量，对两者进行回归分析，回归方程见图2，拟合度为0.956，表明综合效价与单株均重（产量）的相关性较佳，证明该检测方法以综合效价表征降解液调节植物生长活性的有效性和可靠性。