一种有效脱除甘薯SPFMV和SPLCV病毒的方法与流程

本发明属于植物组织培养技术中植物脱毒技术领域，具体涉及一种有效脱除甘薯spfmv和splcv病毒的方法。

背景技术：

甘薯(ipomoeabatataslam)既是重要的粮食作物之一，也是重要的工业原料和饲料作物，在世界范围广泛种植。甘薯又名山芋、红芋、番薯、红薯、地瓜，为旋花科属一年生或多年生蔓性草本植物，富含蛋白质、淀粉、果胶、纤维素及多种矿物质，有“长寿食品”之誉。

甘薯病毒是一种世界性的甘薯病害，广泛存在于世界甘薯产区，对甘薯的品质和产量造成了巨大的危害。甘薯病毒种类多，新病毒多，复合侵染现象严重，单一病毒侵染比例仅为31.9％，大多数为3-5种病毒侵染，而且甘薯是无性繁殖作物，主要利用块根和茎蔓进行繁殖，造成病毒在植株体内代代相传与积累，甚至引起种性的退化，商品性的丧失等严重危害。其中，甘薯羽状斑驳病毒(sweetpotatofeatherymottlevirus，spfmv)和甘薯卷叶病毒(sweetpotatoleafcurlvirus，splcv)是侵染我国甘薯的两种主要病毒，近年来在我国主要甘薯产区严重发生，给甘薯生产造成严重危害。为了防治病毒病，多年来，植物保护学家从各方面寻求解决的方法，但是由于病毒复制与植物代谢过程密切相关，迄今为止还没有一种药物能够有选择地抑制病毒而不伤害植物。人们发现对植物进行脱毒，不但可以减轻病毒危害，增加产量而且不伤害植物。

现在植物的脱毒技术应用最广泛的有三种：热处理法、茎尖培养法、抗病毒药剂法。

1、热处理法

热处理是利用病毒和寄主植物对高温的忍耐性的差异，使植物的生长速度超过病毒的扩散速度，通常温度越高，时间越长，脱毒效果就越好，但是同时植物的生存率却呈下降趋势。热处理脱毒法主要缺点是脱毒时间长，脱毒不完全。

2、茎尖培养脱毒法

植物的茎尖分生组织是由分生细胞构成，分生区域内无维管束，细胞壁的胞间连丝也不发达，病毒很难进入，所以生长点往往不含病毒或含有极少量的病毒，因而采取茎尖分生组织培养技术就能实现无病毒或去病毒植株的快速繁殖。

茎尖培养时切取过大则不能保证完全除去病毒，茎尖愈小携带的病毒越少。考虑到脱毒效果及提高成活率，一般是取带1～2个叶缘基的顶端分生组织进行培养，不同植物的茎尖的剥取难易程度有差异，在双子叶植物中生长素大概是在第二对年幼的叶原基中合成的，茎尖的分生组织生长素不能自给，因此幼小茎尖培养较一般芽培养更困难，必须提供适合浓度的外源生长素与细胞分裂素。研究表明，脱除病毒的效果与茎尖大小成反比，但是茎尖太小不易成活。茎尖培养脱毒法脱毒率高，脱毒速度快，能在较短的时间内得到许多原种繁殖材料，但这种方法存在的缺点是植物的存活率低。

3、抗病毒药剂法

化学合成类小分子植物病毒抑制剂有：有机酸类，如羧酸类的阿司匹林、十二烷基乙酸、乙酰水杨酸和聚丙烯酸(pa)，对tmv都有很好的抑制作用，它们的抗病毒机理是诱导植物获得系统抗病性，产生病程相关蛋白(pathogenesis-relatedprotein，pr-p)。抗病毒药剂使用方便，对植物病毒有较强的抑制作用，能减少病毒病发生，但抗病毒药剂的抑制作用对病毒有针对性，不能一次性有效去除多种病毒；如果浓度使用过高还会对植物生长造成不良影响。

除了以上脱毒方法以外，花药培养法、愈伤组织培养法、胚珠培养法也可用于脱毒。

技术实现要素：

本发明的目的在于公开了一种有效脱除甘薯spfmv和splcv病毒的方法。

本发明的目的是通过以下技术方案实现的：

一种有效脱除甘薯spfmv和splcv病毒的方法，所述方法包括下述步骤：

(1)、茎尖培养脱毒：

剪取甘薯芽端顶部2cm～3cm长的茎段，剪去已经展开的叶片，倒入洗衣粉用刷子进行洗涤，流水冲洗30min；在无菌操作台上用70％的酒精浸泡30s，再用2％的次氯酸钠消毒5分钟，无菌水冲洗3次，得到消毒后的芽段；

在解剖镜下对消毒后的芽段进行剥离茎尖处理，剪去较小未展开叶片和较大的叶原基，切下带有1～2个叶原基的生长点，长度为0.2mm～0.3mm，用解剖针将茎尖挑到装有培养基的三角瓶中进行茎尖培养，每接种一个茎尖换一次手术刀及解剖针，以降低污染；茎尖培养的培养基为ms基本培养基加入6-ba1.0mg/l、iaa0.5mg/l、蔗糖30g/l和琼脂6g/l，ph值5.8；培养条件为温度25℃、光照强度2000lx、光照时间12h/d；培养30d后转到mso培养基分化成苗；

(2)、病毒检测：

当步骤(1)中培养的茎尖苗分化成两棵以上，采叶子4～6片采用rt-pcr检测甘薯羽状斑驳病毒和甘薯卷叶病毒；所述rt-pcr的程序为：预变性：94℃5min；变性：94℃30s；复性：60℃30s；延伸：72℃60s；30个循环；最后延伸：72℃10min；

经检测得到的脱毒苗直接用于组培苗生产；经检测得到的带毒的组培苗进入高温处理和抗病毒药剂处理；

(3)、高温处理或抗病毒药剂处理：

对步骤(2)中经检测得到的带毒的组培苗进行高温处理或抗病毒药剂处理；

其中高温处理的具体步骤为：在40℃条件下处理2h～8h后，按照步骤(2)进行病毒检测，得到脱除甘薯spfmv和splcv病毒的组培苗；

其中抗病毒药剂处理的具体步骤为：在带毒的组培苗培养基中分别加入50mg/l～200mg/l的毒氟磷、阿泰灵、新奥甘肽或宁南霉素培养1个月～5个月，按照步骤(2)进行病毒检测，得到脱除甘薯spfmv和splcv病毒的组培苗。

上述技术方案所述的一种有效脱除甘薯spfmv和splcv病毒的方法，其中，在步骤(1)茎尖培养脱毒步骤之前还包括接种材料处理步骤，具体步骤为：将甘薯薯块萌发苗或扦插苗进行盆栽，盆栽基质为草炭与蛭石以1∶1比例混合；甘薯苗达到20cm～30cm时，开始取样开展茎尖培养。

上述技术方案所述的一种有效脱除甘薯spfmv和splcv病毒的方法，其中，所述步骤(2)中rt-pcr检测的引物为：

spfmvf5-ggattayggtgttgacgac-3，

spfmvr5-tcgggactgaargayacgaatttaa-3；

splcvf5-cccckgtgcgwraatccat-3，

splcvr5-atccvaaywtycagggagctaa-3。

本发明具有以下有益效果：

甘薯产量和品质长期受到病毒的影响。由于甘薯的繁殖特性，病毒在植株体内大量积累，甘薯种性严重退化。本发明通过利用茎尖培养、高温脱毒及药剂处理的脱毒方法高效快速的脱除甘薯两种主要病毒spfmv和splcv，为后续脱毒甘薯苗的大量生产提供技术支持。

附图说明：

1.图1为甘薯茎尖培养脱毒的流程图。

2.图2为甘薯组培苗高温处理脱毒。

3.图3为甘薯组培苗抗病毒药剂处理脱毒。

具体实施方式：

为使本发明的技术方案便于理解，以下结合具体实施例对本发明一种有效脱除甘薯spfmv和splcv病毒的方法作进一步的说明。

实施例1：一种有效脱除甘薯spfmv和splcv病毒的方法：

甘薯羽状斑驳病毒(sweetpotatofeatherymottlevirus，spfmv)和甘薯卷叶病毒(sweetpotatoleafcurlvirus，splcv)，是侵染我国甘薯的两种主要病毒。本发明根据对病毒病在甘薯体内的寄生特性和传播途径研究，病毒很难在甘薯分生组织细胞新陈代谢剧烈的茎尖部位造成侵染和繁殖，因此切取甘薯顶端0.2-0.3mm茎尖培养成再生苗进行脱毒培养成为防治甘薯病毒的主要方法。

一、材料和方法：

1、试验材料：

试验所用甘薯品种12个，分别为：龙薯9、济薯26、京6、商薯19、138、烟薯25、黄玫瑰、心香、普薯32、28-1(农大28)、28-3(农大白)和c16-2(黄香蕉)，试验材料由北京农业技术推广站和中国农业大学提供。

2、茎尖培养脱毒：

分别剪取每个品种芽端顶部2cm～3cm长的茎段，剪去已经展开的叶片，放入烧杯中，倒入洗衣粉用刷子进行洗涤，流水冲洗30min。在无菌操作台上用70％的酒精浸泡30s，再用2％的次氯酸钠消毒5分钟，无菌水冲洗3次。

在解剖镜下对消毒后的芽段进行剥离茎尖处理，剪去较小未展开叶片和较大的叶原基，切下带有1～2个叶原基的生长点，长度为0.2mm～0.3mm，用解剖针将茎尖挑到装有培养基的三角瓶中进行茎尖培养，每瓶接种3～5个外植体，每接种一个茎尖换一次手术刀及解剖针，以降低污染；茎尖培养的培养基为ms基本培养基加入6-ba1.0mg/l、iaa0.5mg/l、蔗糖30g/l和琼脂6g/l，ph值5.8；培养条件为温度25℃，光照强度2000lx，光照时间12h/d。培养30d后转到mso培养基分化成苗。茎尖培养脱毒的流程图如图1所示。

3、病毒检测：

茎尖苗一般分化成两棵以上，就可以采叶子4～6片进行病毒检测。委托北京扶舆生物科技有限公司采用rt-pcr技术检测甘薯的病毒，检测的病毒为甘薯羽状斑驳病毒(spfmv)和甘薯卷叶病毒(splcv)；

rt-pcr的程序为：预变性：94℃5min；变性：94℃30s；复性：60℃30s；延伸：72℃60s；30个循环；最后延伸：72℃10min；

rt-pcr的引物为：

spfmvf5-ggattayggtgttgacgac-3，

spfmvr5-tcgggactgaargayacgaatttaa-3；

splcvf5-cccckgtgcgwraatccat-3，

splcvr5-atccvaaywtycagggagctaa-3；

4、带病毒茎尖培养苗高温处理脱毒：

将茎尖剥离后经病毒检测仍携带spfmv和splcv病毒的烟薯25和京6茎尖培养苗置于40℃恒温培养箱中分别处理2h，4h，8h，之后进行病毒检测。病毒检测参照步骤4。甘薯高温处理如图2所示。

5、带病毒茎尖培养苗抗病毒药剂处理脱毒：

以茎尖剥离后经病毒检测仍携带spfmv病毒的烟薯25、同时携带spfmv与splcv病毒的京6和龙薯9组培苗为材料进行脱毒试验，处理药剂为毒氟磷、阿泰灵、新奥甘肽或宁南霉素；处理浓度为50mg/l、100mg/l、200mg/l；将各甘薯组培苗转入添加药剂的培养基中。分别处理1个月，2个月，3个月，4个月，5个月后，转入不添加药剂的mso培养基中进行培养，再进行病毒检测。病毒检测参照步骤4。甘薯抗病毒药剂处理如图3所示。

二、结果与分析：

1、不同甘薯品种茎尖培养成活与脱毒情况：

试验结果表明，不同品种茎尖出苗存在差异，烟薯25出苗率最高，达到80.2％，其次是138和黄玫瑰，分别达到了73.9％和61.2％，出苗率最低的是商薯19，只有10.7％，其它均在40％～50％之间；各个品种茎尖的死亡率也存在差异，出苗率最高的三个品种烟薯25、138和黄玫瑰，茎尖死亡率都低于10％，出苗率最低的商薯19，死亡率高达22.5％。

单独茎尖培养脱毒效果不好，脱毒率多在10％～30％之间。

2、带病毒茎尖培养苗高温处理脱毒：

试验结果表明，高温处理脱毒结果如表1所示，烟薯25与京6在40℃条件下处理2h、4h、8h后，spfmv病毒脱除率均为100％；烟薯25携带的splcv病毒，处理2h、8h均可100％脱除，而处理4h，不能完全脱除，脱毒率为66.7％；京6携带的splcv病毒在40℃条件下经2h、4h、8h处理，脱毒率均为85.7％。

表1茎尖培养苗高温处理对不同甘薯脱毒率的影响(％)

3、带病毒茎尖培养苗抗病毒药剂处理脱毒：

试验结果表明，携带spfmv病毒的烟薯25、同时携带spfmv与splcv病毒的京6和龙薯9组培苗，在加入50mg/l～200mg/l抗病毒药剂(抗病毒药剂选自毒氟磷、阿泰灵、新奥甘肽或宁南霉素中的一种)培养基中培养1个月～5个月，均能有效脱除spfmv和splcv病毒。但抗病毒药剂会对组培苗生长产生不良影响。

以上所述，仅为本发明的较佳实施例，并非对本发明作任何形式上和实质上的限制，凡熟悉本专业的技术人员，在不脱离本发明技术方案范围内，当可利用以上所揭示的技术内容，而作出的些许更动、修饰与演变的等同变化，均为本发明的等效实施例；同时，凡依据本发明的实质技术对以上实施例所作的任何等同变化的更动、修饰与演变，均仍属于本发明的技术方案的范围内。