一种虎杖根部愈伤组织的诱导培养基及其应用的制作方法

1.本发明涉及植物组织培养技术领域，尤其是涉及一种虎杖根部愈伤组织的诱导培养基及其应用。


背景技术：

2.虎杖(reynoutria japonica houtt.)，蓼科，多年生草本植物。根据记载，虎杖的根茎具有活血化瘀，清热利湿、化痰止咳的作用，同时也具有止血、抗炎等功效。有研究表明虎杖的提取物中主要的活性成分为白藜芦醇和大黄素，白藜芦醇具有抑制黑色素细胞的活性、促进巨噬细胞活性的作用、对降低血脂、抑制血小板活性等具有相关药理作用。同时，白藜芦醇还具有抗氧化、抗自由基，抗菌、消炎、抗过敏等多种有益功效。
3.虎杖根部作为主要的药用部位，根部白藜芦醇的含量也显著高于茎、叶。通过根部诱导得到的愈伤组织中的白藜芦醇含量也明显高于茎、叶诱导得到的愈伤组织。因此通过虎杖根部诱导愈伤组织是一种有效获取高产量白藜芦醇的途径。
4.目前，大量的研究报道了通过虎杖叶片、叶柄、茎等组织诱导愈伤组织的方法，对虎杖根部愈伤组织的诱导研究较少，并且还面临着虎杖根部愈伤组织诱导率低的问题。


技术实现要素：

5.本发明的目的在于克服上述现有技术的不足之处而提供一种虎杖根部愈伤组织的诱导培养基及其应用，本发明以虎杖根部分生组织为材料，对诱导培养基进行相应优化，该诱导培养基可以显著提高虎杖根部愈伤组织的诱导率，有利于愈伤组织的生长。
6.为实现上述目的，本发明采取的技术方案为：
7.第一目的，本发明提供了一种虎杖根部愈伤组织的诱导培养基，包括以下浓度的组分：
8.大量元素3.75～5.19g/l、微量元素38.82～50.64mg/l、铁盐60～70mg/l、有机物质101.56～201.94mg/l和激素1.8～2.5mg/l；
9.有机物质为肌醇、烟酸、盐酸吡哆醇、盐酸硫胺素、甘氨酸、谷氨酸和白藜芦醇。
10.本发明以虎杖根部分生组织为材料，通过设计虎杖根部愈伤组织的诱导培养基的配方，以提高虎杖根部愈伤组织的诱导率。
11.诱导培养基中加入白藜芦醇，白藜芦醇具有较强的抗氧化，及自由基清除能力，可缓解植物愈伤组织诱导过程中的氧化，防止外植体褐变，有效提高诱导率。
12.作为本发明所述诱导培养基的优选实施方式，诱导培养基包括以下浓度的组分：
13.大量元素5.04g/l、微量元素40.36mg/l、铁盐65.1mg/l、有机物质101.7mg/l和激素2.0mg/l。
14.当诱导培养基选自上述配方时，虎杖根部愈伤组织的诱导率最高。
15.作为本发明所述诱导培养基的优选实施方式，所述有机物质为100～200mg/l肌醇、0.5～0.6mg/l烟酸、0.55～0.6mg/l盐酸吡哆醇、0.15～0.2mg/l盐酸硫胺素、0.12～
0.18mg/l甘氨酸、0.12～0.18mg/l谷氨酸和0.12～0.18mg/l白藜芦醇。
16.作为本发明所述诱导培养基的优选实施方式，所述有机物质为100mg/l肌醇、0.5mg/l烟酸、0.6mg/l盐酸吡哆醇、0.15mg/l盐酸硫胺素、0.15mg/l甘氨酸、0.15mg/l谷氨酸和0.15mg/l白藜芦醇。
17.作为本发明所述诱导培养基的优选实施方式，所述大量元素为2.0～3.0g/l硝酸钾、0.3～0.35g/l硫酸镁、0.3～0.4g/l氯化钙、0.8～1.0g/l氯化铵、0.15～0.20g/l磷酸二氢钾和0.20～0.24g/l磷酸氢二钠中的至少一种；所述微量元素为8.0～10mg/l h3bo3、25～30mg/l mnso4·
4h2o、5.5～7.2mg/l znso4·
7h2o、0.3～3.4mg/l na2moo4·
2h2o、0.01～0.02mg/l cuso4·
5h2o、0.01～0.02mg/l cocl2·
6h2o中的至少一种。
18.更优选地，所述大量元素为3.0g/l硝酸钾、0.3g/l硫酸镁、0.3g/l氯化钙、1.0g/l氯化铵、0.20g/l磷酸二氢钾和0.24g/l磷酸氢二钠的复配；所述微量元素为9.0mg/l h3bo3、25mg/l mnso4·
4h2o、6.0mg/l znso4·
7h2o、3.4mg/l na2moo4·
2h2o、0.01mg/l cuso4·
5h2o、0.01mg/l cocl2·
6h2o的复配。
19.本发明诱导培养基中加入大量元素和微量元素有利于虎杖根部的分化培养，提高虎杖根部愈伤组织的诱导率。
20.作为本发明所述诱导培养基的优选实施方式，所述激素包括萘乙酸和/或2，4-d。
21.更优选地，激素为0.4～0.9mg/l萘乙酸和1.4～1.6mg/l 2，4-d的复配。
22.当采用上述激素种类时，可以提高虎杖根部的出愈时间和诱导率。
23.更优选地，铁盐为27.8mg/l feso4·
7h2o、37.3mg/l na2-edta
·
2h2o。
24.第二目的，本发明提供了一种如上述诱导培养基的制备方法，包括以下步骤：
25.取纯化水，依次加入大量元素、微量元素、铁盐、有机物质、激素混合，定容至1000ml，使用酸或碱调节体系的ph值至5.8～6.0，分装灭菌，即得诱导培养基。灭菌条件为：121℃，15min。
26.第三目的，本发明提供了一种诱导虎杖干细胞的方法，包括以下步骤：
27.s1、取幼嫩虎杖的根尖，浸泡、清洁，使用消毒液对根尖消毒，蒸馏水冲洗，获得预处理的外植体；
28.s2、将经过预处理的外植体剪切，然后接种于如上述的诱导培养基中诱导培养；
29.s3、于黑暗条件下培养3～4周。
30.作为本发明所述诱导虎杖干细胞的方法的优选实施方式，所述消毒液包括以下浓度的组分：0.10～0.12％hgcl2、20～50mm k2hpo4、20～50mm kh2po4、50～100mm nacl；ph6.0～6.5，渗透压330～350mosm/kg。
31.采用本发明配方的消毒液可以对虎杖根部进行有效消毒，污染率仅为5～7％，且褐变率控制在10～12％。
32.所述消毒液包括以下浓度的组分：0.10％hgcl2、20mm k2hpo4、20mm kh2po4、50mm nacl；ph6.0，渗透压330mosm/kg。
33.采用上述优选的消毒液对虎杖根部进行消毒，可以降低污染率，且褐变率控制在12％以内。
34.现有技术通常采用的培养基为ms培养基添加不同浓度的激素进行诱导，诱导率仅为80％左右。且现有的消毒方法常用2.5％naclo和0.10％hgcl2进行消毒，褐变和污染率两
者不可兼得。
35.与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
36.本发明提供了一种虎杖根部愈伤组织的诱导培养基及其应用，本发明以虎杖根部分生组织为材料，对诱导培养基进行相应优化，可以显著提高虎杖根部愈伤组织的诱导率，诱导培养基的组分之间相互协同，促进愈伤组织的生长繁殖，有利于愈伤组织的生长。消毒效果与现有技术相比褐变率和污染率低。
具体实施方式
37.为更好的说明本发明的目的、技术方案和优点，下面将结合具体实施例对本发明作进一步说明。
38.在以下实施例和对比例中，所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法，所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
39.实施例1～19、一种虎杖根部愈伤组织的诱导培养基及其制备方法
40.实施例1
41.一种虎杖根部愈伤组织的诱导培养基的制备方法，包括以下步骤：
42.1)铁盐200倍母液：称量feso4·
7h2o、na2-edta
·
2h2o溶解于900ml纯化水中，电磁炉加热，边加热边搅拌，防止剧烈沸腾，加热1h后，冷却至室温，容量瓶定容至1000ml。
43.2)大量元素100倍母液：依次称量硝酸钾，硫酸镁，氯化钙，氯化铵，磷酸二氢钾，磷酸氢二钠，依次溶解在900ml水中，磁力搅拌器搅拌溶解，当其中一种完全溶解后，再加入下一种化合物，全部溶解后，容量瓶定容至1000ml。
44.3)微量元素100倍母液配制：称量约900ml纯化水，用浓度为8～10n hcl调节ph至2.0，分别称取h3bo3、mnso4·
4h2o、znso4·
7h2o、na2moo4·
2h2o、cuso4·
5h2o、cocl2·
6h2o，依次溶解于ph2.0的水中，容量瓶定容至1000ml。
45.4)取适量700～800ml纯化水，依次加入大量元素、微量元素、铁盐、有机物质，激素，定容至1000ml，采用1mol/l盐酸或1mol/l氢氧化钠调节ph至5.8，添加7g/l的琼脂粉分装后，121℃，15min灭菌，即得诱导培养基。
46.一种虎杖根部愈伤组织的诱导培养基，由以下浓度的组分组成：
47.3.0g/l硝酸钾、0.3g/l硫酸镁、0.3g/l氯化钙、1.0g/l氯化铵、0.20g/l磷酸二氢钾、0.24g/l磷酸氢二钠、9.0mg/l h3bo3、25mg/l mnso4·
4h2o、6.0mg/l znso4·
7h2o、0.34mg/l na2moo4·
2h2o、0.01mg/l cuso4·
5h2o、0.01mg/l cocl2·
6h2o、27.8mg/l feso4·
7h2o、37.3mg/l na2-edta
·
2h2o、100mg/l肌醇、0.55mg/l烟酸、0.6mg/l盐酸吡哆醇、0.15mg/l盐酸硫胺素、0.15mg/l甘氨酸、0.15mg/l谷氨酸、0.15mg/l白藜芦醇、0.5mg/l萘乙酸、1.5mg/l 2，4-d；7g/l的琼脂粉。
48.实施例2～19改变表1组分或组分含量，其余组分及含量与实施例1相同，诱导培养基的制备方法也与实施例1相同。
49.表1 试验设计
[0050][0051]
对上述不同培养基对虎杖愈伤组织诱导率进行测试。
[0052]
取新鲜的幼嫩虎杖根用自来水浸泡1h，加入少量洗洁精，用软毛刷轻柔清洗根部，用无菌手术剪，将根尖剪下，在75％酒精中浸泡10～30s进行初步消毒，蒸馏水冲洗3次后，选用消毒液(0.10％hgcl2、20mm k2hpo4、20mm kh2po4、50mm nacl；ph6.0)对根部进行消毒10min。蒸馏水冲洗5～6次后，接种至上述实施例1～19制备的诱导培养基中，于黑暗条件下培养3～4周，观察愈伤生长情况，统计愈伤组织诱导率，愈伤组织诱导率＝诱导出愈伤组织的外植体块数/接种外植体块数
×
100％。试验结果见表2。
[0053]
表2
[0054]
[0055][0056]
试验例一、不同激素水平对虎杖根尖愈伤组织诱导率的影响
[0057]
在实施例1的基础上改变激素的浓度作为实施例20(0.2mg/l萘乙酸、1.6mg/l 2，4-d)和实施例21(1.0mg/l萘乙酸、1.5mg/l 2，4-d)，其制备的诱导培养基对虎杖根尖愈伤组织诱导的影响如表3所示。
[0058]
表3
[0059]
组别出愈时间/d诱导率/％实施例11595实施例202277实施例211983
[0060]
试验例二、不同浓度的白藜芦醇对虎杖愈伤组织诱导率的影响
[0061]
在实施例1的基础上改变白藜芦醇的浓度作为实施例22(浓度为0.12mg/l)和实施例23(浓度为0.18mg/l)，不加白藜芦醇作为对比例1，其制备的诱导培养基对虎杖根尖愈伤组织诱导的影响如表4所示。白藜芦醇具有较强的抗氧化，及自由基清除能力，可缓解植物愈伤组织诱导过程中的氧化，防止外植体褐变，添加适当浓度的白藜芦醇可以显著提高虎杖根部愈伤组织的诱导率，有利于组织的生长。
[0062]
表4
[0063]
组别ph培养条件诱导率/％
实施例15.825℃，暗培养95实施例225.825℃，暗培养87实施例235.825℃，暗培养90对比例15.825℃，暗培养54
[0064]
试验例三、不同培养条件对虎杖愈伤组织诱导率的影响
[0065]
通过对比光培养与暗培养两种环境条件来探究对虎杖根尖愈伤组织诱导的影响，愈伤组织形成前的植株一半采用光培养，一半采用暗培养，愈伤组织形成后全部采用光培养。培养基为实施例1制备的培养基结果如表5所示。
[0066]
表5 不同培养条件对虎杖愈伤组织诱导率的影响
[0067]
组别ph培养条件诱导率/％实施例15.8光培养79实施例15.8暗培养95
[0068]
试验例四、不同消毒液对虎杖根尖消毒的影响
[0069]
取新鲜的幼嫩虎杖根用自来水浸泡1h，加入少量洗洁精，用软毛刷轻柔清洗根部，用无菌手术剪，将根尖剪下，在75％酒精中浸泡10～30s进行初步消毒，蒸馏水冲洗3次后，选用消毒液(0.10％hgcl2、20mm k2hpo4、20mm kh2po4、50mm nacl；ph6.0，渗透压330mosm/kg)对根部进行消毒10min。蒸馏水冲洗5～6次后，接种至实施例1的培养基中作为实验组1，选用消毒液(0.12％hgcl2、50mm k2hpo4、50mm kh2po4、100mm nacl；ph6.5，渗透压350mosm/kg)作为实验组2，采用2.5％naclo和0.10％hgcl2分别作为对照组接种至实施例1的培养基中为对照组1、2，采用2.5％naclo和0.10％hgcl2分别作为对照组接种至ms培养基其余方法与实验组相同，为对照组3、4。结果见表6。
[0070]
表6
[0071]
组别消毒时间褐变率％污染率/％对照组110min2327对照组210min329对照组310min1628对照组410min219实验组110min127实验组210min105
[0072]
本发明提供的消毒液可有效对虎杖根尖进行消毒，污染率控制在5～7％，且褐变率控制10～12％。本发明在消毒液中添加了一定浓度的缓冲溶液，其渗透压可维持植物细胞的稳定，维持植物细胞的活性，从而在消毒过程中减小消毒剂对植物细胞的损伤，降低褐变率。同时本发明提供的诱导培养基中添加了白藜芦醇具有抗氧化作用，也具有防止褐变的作用。
[0073]
最后所应当说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对本发明保护范围的限制，尽管参照较佳实施例对本发明作了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的实质和范围。