一种紫纹兜兰非共生萌发培养基及培养方法

1.本发明涉及植物种子繁殖技术领域，特别涉及一种紫纹兜兰非共生萌发培养基及培养方法。


背景技术：

2.紫纹兜兰(paphiopedilum purpuratum)隶属于兰科(orchidaceae)兜兰属(paphiopedilum)，是国家ⅰ级重点保护野生植物。主要分布于广东南部、广西南部、香港以及云南东南部等地。紫纹兜兰在野外可通过种子繁殖和分株繁殖，自然条件下细小如尘的种子需要与真菌共生才能萌发，萌发率较低，且分株繁殖的方式使得紫纹兜兰种群分布狭窄，极容易被成片采挖，造成种群的消失。有学者通过调查研究发现，由于生境的破坏以及人为的采挖，紫纹兜兰在野外的种群数量已经十分稀少，处于濒危状态，亟待人工辅助其繁殖。
3.无菌萌发是繁殖兜兰最有效的一种方法，目前，已有多个研究报道了多种兜兰通过无菌萌发成功获得试管苗。例如王莲辉等(2010年)的报道表明，1/2ms+椰乳的组合对小叶兜兰的种子的萌发率较高；周丽等(2012年)的报道发现格力兜兰种子萌发最佳培养基为1/2re+6-ba+naa+椰乳+水解酪蛋白组合；胡琦敏等(2016年)对海伦兜兰无菌播种与组培的研究发现,最适种子萌发培养基为1/2ms+香蕉泥。由此可见，某种兜兰成功萌发的无菌播种方法对其它兜兰并不具有适应性，兜兰属中包括紫纹兜兰在内的多个种仍未探索到较为理想的无菌萌发方法。


技术实现要素：

4.本发明的目的在于提供一种紫纹兜兰非共生萌发培养基及培养方法，提高紫纹兜兰种子的萌发率，减少萌发过程中原球茎发生褐化和死亡的现象，达到了有效提高成苗率的效果。
5.本发明为了解决上述技术问题，提供以下技术方案：
6.本发明提供一种紫纹兜兰非共生萌发培养基，所述培养基配方为：1/4ms+20～30g/l蔗糖+7～8g/l琼脂粉+100～150ml/l新鲜椰汁+0.1～0.3mg/l6-ba+0.05～0.15mg/l naa，ph6.0～7.0。
7.优选的，所述培养基的配方为1/4ms+20g/l蔗糖+7g/l琼脂粉+100ml/l新鲜椰汁+0.2mg/l 6-ba+0.1mg/l naa，ph6.0。
8.本发明还提供了一种紫纹兜兰种子非共生萌发的培养方法，将紫纹兜兰种子散落在上述萌发培养基上进行培养，待种子分化成带有2-3片叶片的原球茎时，转培养基进行生根壮苗培养，直至长出小苗。
9.优选的，所述培养的条件为：光照时间9～11h/d，光照强度1600-1700lux，温度25-26℃。
10.优选的，所述种子萌发的时间为90-100天。
11.优选的，所述原球茎的培养时间为90-100天。
12.优选的，所述紫纹兜兰种子的获取方法包括：采集生长时间为9-10个月的紫纹兜兰果荚，低温存放后，去除果荚表面绒毛，消毒后切开，得到紫纹兜兰的种子。
13.优选的，所述小苗经炼苗后移栽至基质中，所述基质配方为等体积比混合的腐殖土和松树皮。
14.进一步优选的，所述炼苗的时间为10-15天，炼苗时的空气湿度为60％～80％，双层75％的遮荫网遮荫。
15.优选的，所述小苗在移栽前用多菌灵浸泡消毒。
16.相对于现有技术，本发明具有如下技术效果：
17.本发明的紫纹兜兰非共生萌发培养基通过在培养基中添加有机物椰汁和一定浓度的激素，给紫纹兜兰种子提供丰富的营养物质，种子萌发率能够达到78.13％，同时促进原球茎的分化。当原球茎分化出2-3片叶片(植株生长至2～4mm)时转培养基进行生根壮苗培养，此时换瓶能明显减少原球茎发生褐化的现象，提高成苗率。
18.本发明还提供了紫纹兜兰种子非共生萌发的培养方法，通过将紫纹兜兰的种子接种于特定的萌发培养基下，使其萌发成原球茎，将所得到的原球茎转接至新的培养基上进行生根壮苗，得到紫纹兜兰无菌试管苗。本发明的方法能提高紫纹兜兰种子的萌发率，减少萌发过程中原球茎发生褐化和死亡的现象，达到了有效提高成苗率的效果，可为紫纹兜兰的保育研究提供一定的技术基础。
附图说明
19.图1为本发明采用的紫纹兜兰果荚示意图。
20.图2为体视镜下的紫纹兜兰种子示意图。
21.图3为紫纹兜兰种子在萌发分化阶段获得的绿色原球茎示意图。
22.图4为紫纹兜兰在生根壮苗阶段发生增殖分化的示意图。
23.图5为紫纹兜兰移栽前的示意图。
24.图6为紫纹兜兰移栽后正常生长的示意图。
具体实施方式
25.本发明提供了一种紫纹兜兰非共生萌发培养基，所述培养基配方为：1/4ms+20～30g/l蔗糖+7～8g/l琼脂粉+100～150/l新鲜椰汁+0.1～0.3mg/l6-ba+0.05～0.15mg/l naa，ph6.0～7.0。进一步优选的，所述培养基配方为1/4ms+20g/l蔗糖+7g/l琼脂粉+100～150ml/l新鲜椰汁+0.2mg/l6-ba+0.1mg/l naa，ph6.0。
26.本发明的紫纹兜兰非共生萌发培养基中添加有机物椰汁和一定浓度的激素，给紫纹兜兰种子提供丰富的营养物质，提高了紫纹兜兰种子的非共生萌发率，同时促进了原球茎的分化，降低了褐化率。
27.本发明还提供了一种紫纹兜兰种子非共生萌发的培养方法，将紫纹兜兰种子散落在上述萌发培养基上进行培养，待种子分化成带有2-3片叶片的原球茎时，转培养基进行生根壮苗培养，直至长出小苗。
28.本发明对紫纹兜兰种子的来源没有特别限定，优选采集生长时间为9-10个月的紫
纹兜兰果荚低温存放后，去除果荚表面绒毛，消毒后切开，得到紫纹兜兰的种子。本发明将紫纹兜兰果荚低温存放促进种子萌发，优选低温存放的时间为24-48h。作为一种实施方式，本发明将低温存放的果荚用大量自来水冲洗，同时用柔软的毛刷刷去表面绒毛，便于果荚的消毒。作为一种实施方式，本发明紫纹兜兰果荚的消毒方式为先用酒精消毒，再用升汞消毒；具体的，在超净工作台上用75％的酒精棉球擦拭5-10min，再用0.13％的升汞浸泡15-20min，无菌水洗去药剂后用滤纸擦干果荚。最后用无菌刀将果荚对半切开，得到紫纹兜兰的种子。
29.作为一种实施方式，本发明用无菌镊子蘸取少量种子，轻敲培养瓶瓶口使种子均匀的散落在萌发培养基上进行培养。优选培养条件为光照时间9～11h/d，光照强度1600-1700lux，温度25-26℃。当种子膨大至出现白色或浅绿色的原球茎时，萌发率能够达到78.13％。作为一种实施方式，本发明中所述萌发率的计算方式为萌发率(％)＝已萌发种子/具有萌发力的种子。
30.作为一种实施方式，本发明在原球茎分化出2-3片叶片，植株生长至2～4mm时转培养基进入生根壮苗阶段的培养，优选培养条件为光照时间9.5h/d，光照强度1600-1700lux，温度25-26℃。此时换瓶能明显减少原球茎发生褐化的现象，提高成苗率。本发明原球茎在上述条件下培养90-100d，长出3.5～5cm的紫纹兜兰试管苗小苗。
31.本发明将紫纹兜兰试管苗小苗经炼苗后移栽至基质中栽培。本发明对炼苗的方式没有特别限定，采用本领域中的常规炼苗方法即可。作为一种实施方式，所述炼苗方法为：从无菌培养室中取出培养瓶，于温室大棚中放置5-7d后，打开瓶盖再放置5-7d，空气湿度60％～80％，双层遮荫网遮荫，优选为75％的遮荫网。作为一种实施方式，炼苗结束后用清水洗净培养基，再用0.1％的多菌灵溶液浸泡小苗5-10min，清水洗净药剂晾干后移入基质中。本发明所述移栽的基质优选为等体积比混合的腐殖土和松树皮。该基质下紫纹兜兰试管苗的成活率100％，生长正常，根系生长迅速，抓土性强。
32.本发明紫纹兜兰非共生萌发的方法，紫纹兜兰种子萌发率高，原球茎无褐化情况，植株生长较快，90天左右即可得到成株的紫纹兜兰小苗。移栽成活率高，生长情况良好。
33.下面结合具体实施例对本发明的技术方案做进一步详细的介绍，本发明的技术方案包括但不限于以下实施例。
34.实施例1
35.本实施例提供一种紫纹兜兰种子非共生萌发的方法，包括以下步骤：
36.果荚的消毒处理：采集生长时间为9-10个月的紫纹兜兰果荚，低温存放24h后，用大量自来水冲洗，同时用刷子刷去表面绒毛。在超净工作台上用75％的酒精棉球擦拭5min，再用0.13％的升汞浸泡15min，无菌水洗去药剂后用滤纸擦干果荚，用无菌刀将果荚对半切开，得到紫纹兜兰的种子。
37.萌发培养基的配制：取1l容量瓶，加入1/3蒸馏水，依次取1/4ms、20g蔗糖、100ml椰汁、0.2ml 6-苄氨基嘌呤、0.1ml 1-萘乙酸，定容至1l，玻璃棒搅拌均匀，ph调至6.0，最后称取7g琼脂粉，玻璃棒搅拌均匀后，边搅拌边分装至28个透明玻璃瓶中。
38.培养基的消毒处理：将分装好的培养基置于高压灭菌锅中灭菌，灭菌完成后放置于无菌室中冷却，冷却至常温即可进行接种。
39.种子播种及萌发分化培养：超净工作台上用无菌镊子蘸取紫纹兜兰的种子，轻敲
培养瓶口，使种子均匀散落在培养基上，每瓶播种约100粒种子。播种完成后，置于无菌室中培养，培养室条件为光照时间9.5h/d，光照强度1600lux，温度25℃。种子培养至出现白色或淡绿色原球茎，90天时统计萌发率为78.13％。
40.同样条件下继续培养原球茎，绿色原球茎在生长至1.5-2mm时开始分化，随后生长较快。至原球茎长出2-3片小叶片时，准备转接至新的培养基中继续进行生根壮苗培养。此时更换培养基能明显减少褐化，死亡以及污染的现象。
41.生根壮苗培养：在超净工作台上，于原培养基中将长至2-3片叶片(植株2～4mm)后的紫纹兜兰小苗用镊子小心夹出，以根部朝下的方式放于上述培养基中，每个培养基中放置3棵小苗。转接完成后置于无菌室下继续培养，培养条件为光照时间9.5h/d，光照强度1600lux，温度25℃。培养期间无褐化情况，植株生长较快，尤其根系生长迅速。培养90d左右，小苗高度长至3.5～5cm。
42.试管苗移栽：从无菌培养室中取出培养瓶，于温室大棚中放置7d后，打开瓶盖再放置7d，炼苗结束后用清水洗净培养基，再用0.1％的多菌灵溶液浸泡小苗5min，清水洗净药剂晾干后移入腐殖土和松树皮配比1:1的基质中。成活率100％，生长正常，根系生长迅速，抓土性强。
43.实施例2
44.本实施例提供一种紫纹兜兰种子非共生萌发的方法，除下述步骤外，其余方法均同实施例1。
45.萌发培养基的配制：取1l容量瓶，加入1/3蒸馏水，依次取1/4ms、25g蔗糖、150ml椰汁、0.3ml 6-苄氨基嘌呤、0.15ml 1-萘乙酸，定容至1l，玻璃棒搅拌均匀，ph调至6.5，最后称取8g琼脂粉，玻璃棒搅拌均匀。
46.培养条件均为光照时间9.5h/d，光照强度1700lux，温度26℃。
47.培养结果：种子培养至出现白色或淡绿色原球茎，90天时统计萌发率为68.5％，转入生根壮苗培养基后，无褐化现象，紫纹兜兰小苗根系和叶片均生长迅速；移栽时根系发达，叶片肥厚，植株适应性强，成活率100％。
48.实施例3
49.本实施例提供一种紫纹兜兰种子非共生萌发的方法，除下述步骤外，其余方法均同实施例1。
50.萌发培养基的配制：取1l容量瓶，加入1/3蒸馏水，依次取1/4ms、30g蔗糖、100ml椰汁、0.1ml 6-苄氨基嘌呤、0.05ml 1-萘乙酸，定容至1l，玻璃棒搅拌均匀，ph调至7，最后称取7g琼脂粉，玻璃棒搅拌均匀。
51.培养结果：种子培养至出现白色或淡绿色原球茎，100天时统计萌发率为56.5％。转入生根壮苗培养基后，无褐化现象，紫纹兜兰小苗根系和叶片均生长迅速；移栽时根系发达，叶片肥厚，植株适应性强，成活率100％。
52.对比例1
53.除下述步骤外，其余方法均同实施例1。
54.萌发培养基的配制：取1l容量瓶，加入1/3蒸馏水，依次取1/4ms、20g蔗糖、100ml椰汁、0.5g活性炭，定容至1l，玻璃棒搅拌均匀，ph调至6.0，最后称取7g琼脂粉，玻璃棒搅拌均匀。
55.培养结果：75天时统计萌发率为76.25％，95％以上已萌发的种子在出现白色原球茎时发生褐化。
56.对比例2
57.除下述步骤外，其余方法均同实施例1。
58.萌发培养基的配制：取1l容量瓶，加入1/3蒸馏水，依次取1/4ms、20g蔗糖、100ml香蕉汁、0.2ml 6-苄氨基嘌呤、0.1ml 1-萘乙酸，定容至1l，玻璃棒搅拌均匀，ph调至6.0，最后称取7g琼脂粉，玻璃棒搅拌均匀。
59.培养结果：105天时统计萌发率为58.55％，但生长缓慢，绿色原球茎在生长至0.8-1mm时开始分化。原球茎分化出2-3片叶片(植株生长至2～4mm)时更换培养基，无褐化情况出现，但植株生长缓慢，叶片瘦小。
60.对比例3
61.除下述步骤外，其余方法均同实施例1。
62.萌发培养基的配制：取1l容量瓶，加入1/3蒸馏水，依次加入溶解的1g花宝一号(美国花宝公司eh0001)、20g蔗糖、100ml香蕉汁、0.2ml 6-苄氨基嘌呤、0.1ml 1-萘乙酸，定容至1l，玻璃棒搅拌均匀，ph调至6.0，最后称取7g琼脂粉，玻璃棒搅拌均匀。
63.培养结果：105天时统计萌发率为22.22％，但生长缓慢，绿色原球茎在生长至0.8-1mm时分化出叶子。原球茎分化出2-3片叶片(植株生长至2～4mm)时更换培养基，植株成活率90％，植株生长缓慢，根系短且少，叶片瘦小。
64.对比例4
65.除下述步骤外，其余方法均同实施例1。
66.萌发培养基的配制：取1l容量瓶，加入1/3蒸馏水，依次取1/4ms、20g蔗糖、100ml椰汁，定容至1l，玻璃棒搅拌均匀，ph调至6.0，最后称取7g琼脂粉，玻璃棒搅拌均匀。
67.培养结果：90天时统计萌发率为5％，极少量种子萌发，萌发后约50％发生褐化。
68.对比例5
69.除下述步骤外，其余方法均同实施例1。
70.萌发培养基的配制：取1l容量瓶，加入1/3蒸馏水，依次取1/4ms、20g蔗糖、0.2ml 6-苄氨基嘌呤、0.1ml 1-萘乙酸，定容至1l，玻璃棒搅拌均匀，ph调至6.0，最后称取7g琼脂粉，玻璃棒搅拌均匀。
71.培养结果：基本不萌发。
72.对比例6
73.除下述步骤外，其余方法均同实施例1。
74.生根壮苗培养基的配制：取1l容量瓶，加入1/3蒸馏水，依次取1/4ms、20g蔗糖、100ml椰汁、0.5ml 6-苄氨基嘌呤、0.5ml 1-萘乙酸，定容至1l，玻璃棒搅拌均匀，ph调至6.0，最后称取7g琼脂粉，玻璃棒搅拌均匀。
75.培养结果：由于激素浓度过高，原球茎在更换培养基后褐化率达95％以上。
76.对比例7
77.除下述步骤外，其余方法均同实施例1。
78.萌发培养基替换为专利cn104186295b中公开的兜兰种子萌发培养基，配方如下：1/4ms、100mg/l抗坏血酸、50mg/l赤霉素、2g/l活性炭、50g/l香蕉泥、6g/l琼脂粉和30g/l白
砂糖。
79.培养结果：萌发时间长，且萌发率仅10％左右。
80.对比例8
81.除下述步骤外，其余方法均同实施例1。
82.萌发培养基替换为专利cn1541519a中公开的兜兰种子萌发培养基，配方如下：ndm培养基维生素成分的改良r培养基附加10％的椰子汁、0.5mg/l6-苄基嘌呤、0.5mg/l萘乙酸及2g/l活性炭。
83.培养结果：基本不萌发。
84.对比例9
85.除下述步骤外，其余方法均同实施例1。
86.种子培养至出现白色或淡绿色原球茎即转接至生根壮苗培养基中进行培养。
87.培养结果：褐化情况严重，褐化率80％。
88.对比例10
89.除下述步骤外，其余方法均同实施例1。
90.移栽培养基为松树皮。移栽的紫纹兜兰小苗容易因缺水死亡，根系几乎不生长，叶片发黄。
91.对比例11
92.除下述步骤外，其余方法均同实施例1。
93.移栽培养基为等体积比混合的泥炭土和松树皮。移栽成活率为80％，紫纹兜兰小苗生长缓慢。
94.以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。