一种阔鳞鳞毛蕨组织培养技术的制作方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及植物生物技术中植物组织培养的方法，具体地说，涉及一种阔鳞鳞毛蕨组织培养技术。
【背景技术】
[0002]蕨类植物也称羊齿植物，是介于最原始的高等植物——苔藓植物和种子植物之间的一个类群。蕨类植物和苔藓植物一样具有配子体和孢子体之间的世代交替现象。蕨类植物享有“无花之美”的美称，观赏蕨类植物以其优雅的线条美和高雅的姿态美深受各国人民的喜爱。蕨类植物因有性生殖对水的依赖作用，对生境的要求较为苟刻，生长区域受限。近年来，由于气候变暖，自然灾害等外部原因和人类对蕨类植物的过度开发造成很多蕨类物种瀕临灭绝。蕨类植物作为一类优良的室内观叶植物和耐阴地被植物，目前主要依赖于国外品种的引进，而我国作为世界上蕨类植物资源最丰富的地区之一，许多优秀的蕨类品种没有得到应用和推广。因此，对蕨类植物繁殖技术的研究和应用推广很为迫切。
[0003]阔鳞鳞毛蕨是鳞毛蕨科鳞毛蕨属植物，分布于山东、河南等全国大部分地区。叶色鲜绿有光泽，耳状小羽片，能适应多种生境。耐旱喜光，也耐荫可做林下片植或与山石配植，是一种优良的地被植物。目前已有对其盆栽引种试验的研究，但其组培繁殖技术尚未见报道。因此，建立阔鳞鳞毛蕨组织培养技术体系将有助于对这种植物的保护，更可以应用于规模化生产以促进其在园林中的广泛应用。
【发明内容】
[0004]本发明的目的在于提供出一种阔鳞鳞毛蕨组织培养技术，本发明以阔鳞鳞毛蕨成熟孢子为外植体，通过孢子萌发、原叶体增殖、愈伤组织诱导、丛生芽分化、生根、移栽等步骤建立了阔鳞鳞毛蕨组织培养技术体系，从而实现了本发明的目的。
[0005]本发明的一种阔鳞鳞毛蕨组织培养技术，其特征在于包括以下步骤:
(I)孢子处理及萌发培养:将具有成熟孢子囊且孢子尚未脱落的叶片采集下来，用清水轻轻冲洗叶面的灰尘及杂质，轻轻擦干后放于纸袋中自然风干，收集脱落的孢子于硫酸纸袋内，并放置于4°c冰箱保存备用。将适量孢子置于1.5mL离心管中并加入50?10mg/mL的赤霉素溶液，浸泡5?1min,以4000r/min速度以离心3?6min,去上清液。然后再加入2%?5%次氯酸钠溶液消毒5?15min,以4000r/min速度以离心3?6min,去上清液，用无菌水冲洗4?5次后转入1mL离心管中，加入无菌水稀释至密度约为3X 13个mg/L的孢子悬浊液并接种于萌发培养基上进行孢子萌发培养。接种后置于每天光照12?15小时，光照强度为2000?30001x，培养温度为25?28°C的条件下培养直至孢子萌发。
[0006](2)原叶体增殖培养:将步骤(I)孢子萌发后的原叶体剪切至增殖培养基中进行原叶体增殖培养。接种后置于每天光照12?16小时，光照强度为1500?25001x，培养温度为25?28°C的条件下培养，每两周更换一次培养基。
[0007](3 )愈伤组织诱导:将步骤(I)或(2 )获得原叶体接种到诱导培养基上进行愈伤组织诱导。接种后置于每天光照12?16小时，光照强度为2000?25001x，培养温度为25?28°C的条件下培养直至形成愈伤组织。
[0008](4)丛生芽诱导:将步骤(3)获得的愈伤组织切割成大小一致的团块(3mmX3mmX3mm)并转接到分化培养基中进行丛生芽诱导。接种后置于每天光照12?16小时，光照强度为2000?25001x，培养温度为25?28°C的条件下培养直至形成丛生芽。
(5)生根培养:将步骤(4)培养得到的丛生芽转移至生根培养基中进行诱导生根。接种后置于每天光照12?16小时，光照强度为2000?25001x，培养温度为25?28°C的条件下培养直至生根。
[0009](6)炼苗移栽:当步骤(5)的幼孢子苗的茎长到约3?4cm，根长到约2?3cm时，将封口膜打开，在培养室内炼苗5?7天后取出试管苗，洗去根部附着的培养基，将幼孢子苗移栽到经过高温灭菌的草炭:蛭石=1:1的混合基质中。移栽后，定期给小苗浇水，并保持湿度90%以上。
[0010]上述步骤(2)所述的萌发培养基为:l/2MS+2.0%?3.5%蔗糖+0.35%?0.5%琼月旨，pH值为5.4?5.8。
[0011]上述步骤(3)所述的增殖培养基为:MS+2.0%?3.5%蔗糖+0.35%?0.5%琼脂，pH值为5.4?5.8。
[0012]上述步骤(4)所述的诱导培养基为:MS+0.1?1.0mg/LKT+1?3mg/L2，4-D+2.0% ?3.5% 蔗糖 +0.35% ?0.5% 琼脂，pH 值为 5.4 ?5.8。
[0013]上述步骤(5)所述的分化培养基为:MS+0.01?0.3mg/L NAA+2.0%?3.5%蔗糖+0.35% ?0.5% 琼脂，pH 值为 5.4 ?5.8。
[0014]上述步骤(5)所述的生根培养基为:MS+0.1?1.0mg/L ΝΑΑ+0.1?0.5mg/LIAA+2.0% ?3.5% 蔗糖 +0.35% ?0.5% 琼脂，pH 值为 5.4 ?5.8。
[0015]本发明的优点是:涉及阔鳞鳞毛蕨通过植物组织培养技术快速繁殖种苗的方法。本发明以阔鳞鳞毛蕨成熟孢子为外植体，通过孢子萌发、原叶体增殖、愈伤组织诱导、丛生芽分化、生根、移栽等步骤建立了阔鳞鳞毛蕨组织培养技术体系，有助于对这种植物的保护，更可以应用于规模化生产以促进其在园林中的广泛应用。
【具体实施方式】
[0016]以下实施例是对本发明的进一步说明，不是对本发明的限制。
[0017]实施例1:
(I)孢子处理及萌发培养:将具有成熟孢子囊且孢子尚未脱落的叶片采集下来，用清水轻轻冲洗叶面的灰尘及杂质，轻轻擦干后放于纸袋中自然风干，收集脱落的孢子于硫酸纸袋内，并放置于4°c冰箱保存备用。将适量孢子置于1.5mL离心管中并加入50mg/mL的赤霉素溶液，浸泡6min，以4000r/min速度以离心4min，去上清液。然后再加入2%次氯酸钠溶液消毒5min，以4000r/min速度以离心5min，去上清液，用无菌水冲洗4次后转入1mL离心管中，加入无菌水稀释至密度约为3X103个mg/L的孢子悬浊液并接种于萌发培养基上进行孢子萌发培养。接种后置于每天光照12小时，光照强度为20001χ，培养温度为25°C的条件下培养17天孢子即萌发，萌发率为83.7%。所述的萌发培养基为:l/2MS+3.5%蔗糖+0.5%琼脂，pH值为5.6。
[0018](2)原叶体增殖培养:将步骤(I)孢子萌发后的原叶体剪切至增殖培养基中进行原叶体增殖培养。接种后置于每天光照12小时，光照强度为15001x，培养温度为25°C的条件下培养45天后增殖系数为4.5。增殖的原叶体颜色是翠绿的，长势旺盛，两翼伸展成叶状。所述的增殖培养基为:MS+3.5%蔗糖+0.35%琼脂，pH值为5.6。
[0019](3)愈伤组织诱导:将步骤(I)或(2)获得原叶体接种到诱导培养基上进行愈伤组织诱导。接种后置于每天光照12小时，光照强度为20001χ，培养温度为25°C的条件下培养28天后即形成愈伤组织，诱导率为71.5%。所述的诱导培养基为:MS+0.lmg/LKT+lmg/L2，4-D+2.0% 蔗糖 +0.35% 琼脂，pH 值为 5.6。
[0020](4)丛生芽诱导:将步骤(3)获得的愈伤组织切割成大小一致的团块(3mmX3mmX3mm)并转接到分化培养基中进行丛生芽诱导。接种后置于每天光照12小时，光照强度为20001x，培养温度为25°C的条件下培养38天后即形成丛生芽，诱导率达到79.4%。所述的分化培养基为:MS+0.0 lmg/L NAA+2.0%蔗糖+0.35%琼脂，pH值为5.6。
[0021](5)生根培养:将步骤(4)培养得到的丛生芽转移至生根培养基中进行诱导生根。接种后置于每天光照12小时，