专利名称：一种从香鳞毛蕨中分离纯化四种间苯三酚类化合物的方法
技术领域：
本发明涉及一种从香鳞毛蕨中分离纯化绵马酚、绵马素PB、香鳞毛蕨素和绵马素BB四种间苯三酚类化合物的方法，属于植物活性成分分离纯化技术领域。
背景技术：
香鳞毛蕨[Dryopterisfragrans (L.) Schott.]是一种多年生蕨类植物,系鳞毛蕨科鳞毛蕨属，又名香叶鳞毛蕨，主要分布于我国东北、华北、华中，俄罗斯(远东地区)、朝鲜、日本及北美洲等一些国家。香鳞毛蕨具有较高的药用价值，民间常用其来治疗多种皮肤疾病(如牛皮癖、皮疫、皮炎、痤疮等)，用其洗头还可达到去屑，止痒的目的，被称为“皮肤病的克星”(沈志滨等，2002)。此外，香鳞毛蕨对风湿性关节炎也有明显的治疗作用(常缨，2009)。近年来，多项药理研究结果表明，香鳞毛蕨具有消炎、镇痛、抑制真菌、抗肿瘤、抗氧化、治疗银屑病等多种功效。目前，香鳞毛蕨中已有报道的活性成分包括间苯三酚类、黄酮类、萜类、苯丙素类和挥发油类，其中间苯三酚类居多，主要包括绵马酚、绵马素PB、香鳞毛蕨素和绵马素BB等(常缨，2009 ；Hisada S.etal, 1974; Ito H.etal, 1997)。已报道的香鳞毛蕨间苯三酚类化合物具有良好的抗肿瘤、抗菌、抗病毒和抗炎活性(沈志滨等，2007 ;吴寿金等，1993)，并且由于香鳞毛蕨中间苯三酚类化合物可来源于天然植物资源，安全性高、选择性高、活性强、毒副作用小，成为当今社会研究的重点。绵马酚、绵马素PB、香鳞毛蕨素和绵马素BB单体均具有良好的药理活性。绵马素PB和香鳞毛蕨素均为鱼毒素类化合物,对非洲淋巴瘤病毒的早期抗原有潜在抑制效果(Ito H.etal, 1997)。此外，绵马素BB还具有广泛的抗肿瘤、抗炎等活性(KrivutBV.etal, 1973)。近年来，香鳞毛蕨的抗菌活性得到证实，并且是鳞毛蕨属中抗菌活性最强的，对葡萄球菌以及真菌具有较好的抗菌活性，常被应用于牛皮癣、皮疹、皮炎和痤疮等的治疗(沈志滨，2006)。尽管从天然植物中获得的绵马酚、绵马素PB、香鳞毛蕨素和绵马素BB单体活性突出，但是目前有关其生产过程的报道较少，已有的提取绵马酚、绵马素PB、香鳞毛蕨素和绵马素BB单体的方法主要是传统的技术手段，需要多次硅胶柱层析。传统的提纯过程漫长且目标化合物损失较多，并且毒性较大的有机溶剂使用量较多，不利于健康生产。综上所述，在利用植物提取物分离纯化绵马酚、绵马素PB、香鳞毛蕨素和绵马素BB单体的传统过程中，分离过程耗时较长，目标化合物损失较大，导致成本提高。因此，寻找一种简便经济高效且安全的分离纯化绵马酚、绵马素PB、香鳞毛蕨素和绵马素BB单体的方法就显得尤为必要。本发明旨在建立多种现代分离纯化技术手段相结合的方法，实现简单快速、经济安全且损失较少的提取纯化绵马酚、绵马素PB、香鳞毛蕨素和绵马素BB单体。
发明内容
本发明目的在于提供一种以干燥的香鳞毛蕨为原料，采用匀浆诱导技术和酶水解技术增加游离的活性成分含量，同时用乙醇为溶剂，通过超声波辅助提取、冷浸提取、 负压空化提取、微波辅助提取得到提取物，将提取物采用超声波振荡絮凝技术、负压空化混悬液固萃取技术、大孔吸附树脂柱色谱富集技术、凝胶分离、正相硅胶中压柱层析分离技术及低温析晶和重结晶技术得到绵马酚、绵马素PB、香鳞毛蕨素和绵马素BB四种单体，该方法分离纯化工艺简单易行，操作安全，产品得率高，纯度高，并且香鳞毛蕨资源丰富易得，适用于工业应用。本发明目的是通过以下方案来实现的:将干燥的香鳞 毛蕨进行匀浆诱导，然后以80%乙醇作为溶剂进行提取，在所得提取物中加入40-50°C温水，通过超声波振荡、静止絮凝，将所得到的粘稠絮凝物经乙酸乙酯负压空化混悬液固萃取、大孔吸附树脂柱色谱富集、凝胶分离和一次正相硅胶中压柱层析后分别得到绵马酚、绵马素PB、香鳞毛蕨素和绵马素BB粗品，经过低温析晶和重结晶分别得到以上四种纯度均大于95%的化合物单体。上述绵马酚、绵马素PB、香鳞毛蕨素和绵马素BB单体的提取纯化方法，其特征在于，取干燥的香鳞毛蕨为原料进行匀浆诱导，匀浆诱导所用的溶剂为水，温度30-50°C，体积为固体质量的3-6倍，连续匀浆诱导3次，每次5-15min。然后用乙醇为溶剂，通过超声波辅助提取、冷浸提取、负压空化提取、微波辅助提取得到提取物，加入6-8倍体积的40-50°C的温水，于超声波振荡提取器中80-100KHZ条件下振荡絮凝15-20min，静止10_20min，得到粘稠絮凝物，以-0.05MPa负压为动力用乙酸乙酯进行负压空化混悬液固萃取，萃取所用的溶剂体积为提取物质量的0.05-0.1 (L:g)，萃取次数为3-5次，所用溶剂包括乙酸乙酯、正己烷、三氯甲烷和正丁醇，浓缩萃取至干，将所得固形物用乙醇溶解，加入固形物2-5倍树脂，然后将拌样树脂加载到预置的树脂柱顶层，加入乙醇-水溶液梯度洗脱，具体包括用5-20BV体积分数10%-30%的乙醇溶液洗脱杂质，10-50BV体积分数50%_95%的乙醇溶液依次洗脱组份，收集洗脱液，每份100-150mL浓缩至干得到固形物。采用S印hadexLH-20凝胶，将大孔吸附树脂富集浓缩的产物用2-8%甲醇溶解，配制成料液浓度为5-20mg/mL的样品液，经0.45 μ m滤膜过滤后，按照100_150mg样品/mL凝胶,注入Sephadex LH-20凝胶柱，用水-甲醇体系梯度洗脱，先用20%甲醇2-5倍柱体积洗脱、然后用40%_70%甲醇3-7倍柱体积洗杂质、最后用80%-90%甲醇4-7倍柱体积洗脱，收集洗脱液。预先称取质量为提取物质量10-20倍的硅胶，采用湿法装柱，所用溶剂包括乙酸乙酯和正己烷。将所得固形物用有机溶剂溶解，加入与浸膏质量比为1.2:l(w/w)的层析硅胶拌匀、减压旋干，装入预先装好的硅胶柱中，先后以1-30BV正己烷或石油醚、3-20BV正己烷或石油醚:乙酸乙酯或氯仿、丙酮=80:1-15:1洗脱，收集洗脱液，每份250-500mL，用硅胶薄层层析检测洗脱液成分，合并相同部分，展开剂为正己烷:乙酸乙酯=100:1-10:1，紫外波长为254nm和365nm，依此得到绵马酚、绵马素PB、香鳞毛蕨素和绵马素BB溶液，低温析晶得到粗品，重结晶后得到纯品O上述的香鳞毛蕨中绵马酚、绵马素PB、香鳞毛蕨素和绵马素BB的提取纯化方法所用的大孔吸附树脂为 H1020、H103、D101、D3520、HPD-D、FL-3、AL-l、AB-8、HPD-826、HPD-600、NKA2 或 FL-1。上述的香鳞毛蕨中绵马酚、绵马素PB、香鳞毛蕨素和绵马素BB的提取纯化方法所用硅胶为300-400目。硅胶柱流动相包括(正己烷、石油醚)-(乙酸乙酯、氯仿、丙酮)的不同比例梯度。重结晶所用的溶剂为乙酸乙酯、石油醚、正己烷、二氯甲烷、乙腈、丙酮和甲醇中的两种，以100:1-10:1的比例混合，温度为-5-200C O本发明的优点:(I)本发明首次采用匀浆-酶诱导技术，诱导增加游离绵马酚、绵马素PB、香鳞毛蕨素和绵马素BB的含量，并诱导粉碎样品，破坏细胞壁，缩短提取时间；(2)本发明首次采用凝胶分离技术对绵马酚、绵马素PB、香鳞毛蕨素和绵马素BB进行纯化，能有效除去样品中杂质，降低后期纯化难度，并减少有机溶剂实用，降低成本；(3)本发明采 用负压空化混悬萃取的方法对提取样品进行萃取，一方面萃取效率高，另一方面以负压为动力，清洁环保，污染较小；(4)本发明高效简单易行，周期短，可大规模投入生产。
具体实施例方式实施例1以干燥的香鳞毛蕨为原料，称量lOOOg，加入6倍体积的40°C温水连续诱导3次，每次8min，将匀浆诱导好的液体用柠檬酸调节pH为5.0 ;取0.3%的固形物重量的复合酶(纤维素酶，果胶酶)，溶于PH为5.0的缓冲溶液中，在50°C水浴上激活lOmin，然后与匀浆液混匀，在40°C下酶解3h。诱导液分离后固形物采用微波提取的方法，用80%乙醇为溶剂进行提取，诱导液及乙醇提取液合并浓缩后将固体物质加入50°C温水1.5L，于超声波提取器中IOOKHz条件下振荡絮凝15min，静止lOmin，取粘稠絮凝物，以-0.05MPa负压为动力用等体积乙酸乙酯进行负压空化混悬液固萃取，浓缩萃取液，将固形物用乙醇溶解，加入2.5倍AB-8树脂，使样品吸附，待溶剂挥干后上样，洗脱步骤为:水洗脱至无色，30%乙醇溶液8BV，50%乙醇溶液10BV、70%乙醇溶液18BV、80%乙醇溶液30BV和95%乙醇溶液20BV。洗脱完毕后收集含有目标成分的馏分，浓缩后分别进行凝胶分离。将树脂洗脱的50%、70%、80%以及95%部分分别浓缩，并将浓缩物用5%的甲醇溶解，配成15mg/mL的样品溶液，用Sephadex LH-20洗脱，，经0.45 μ m滤膜过滤后，按照IOOmg样品/mL凝胶,注入Sephadex LH-20凝胶柱,用水-甲醇体系梯度洗脱，先用20%甲醇3倍柱体积洗脱、然后用40%甲醇7倍柱体积洗杂质、最后用90%甲醇7倍柱体积洗脱，收集洗脱液并浓缩得到固体。将树脂50%对应的凝胶洗脱部分用正己烷溶解，称取提取物质量1.2倍的300-400目硅胶均匀拌样。按质量比1:20称取硅胶湿法装柱，最后将拌好样品的硅胶装入中压柱内，然后以正己烷:乙酸乙酯=50:l(v/v)进行洗脱，TLC监测收集流分，浓缩得到绵马酚粗品，用石油醚:乙酸乙酯=5:1体系进行低温析晶得到产品，重结晶后得到纯度96.2±0.2%的绵马酚 26.72±0.52mg。 将树脂70%对应的凝胶洗脱部分用正己烷溶解，称取提取物质量1.2倍的300-400目硅胶均匀拌样。按质量比1:20称取硅胶湿法装柱，最后将拌好样品的硅胶装入中压柱内，然后以正己烷:乙酸乙酯=50:l(v/v)开始洗脱，待棕色样品流出后开始收集组分并采用TLC进行监测，浓缩得到绵马素PB粗品，用正己烷:乙酸乙酯=20:1体系进行低温析晶得到产品，重结晶后得到纯度95.1 + 0.2%的绵马素PB 75.09 + 0.14mg。将树脂80%对应的凝胶洗脱部分用正己烷溶解，称取提取物质量1.2倍的300-400目硅胶均匀拌样。按质量比1:20称取硅胶湿法装柱，最后将拌好样品的硅胶装入中压柱内，然后以正己烷:乙酸乙酯=50:l(v/v)开始洗脱，先用IOBV正己烷洗脱，然后采用IOBV正己烷:乙酸乙酯=50:1 (v/v)，IOBV正己烷:乙酸乙酯=30:l(v/v)进行洗脱，最后用正己烷:乙酸乙酯=15:1 (v/v)开始洗脱，待棕黄色色带流出后，收集流分并用TLC监测，至收集液中不含目标成分的部分，将样品浓缩得到香鳞毛蕨素粗品，用正己烷:乙酸乙酯=30:1体系进行低温析晶得到产品，重结晶后得到纯度97.7±0.4%的香鳞毛蕨素355.43±0.51mg。将树脂95%对应的凝胶洗脱部分用正己烷溶解，称取提取物质量1.2倍的300-400目硅胶均匀拌样。按质量比1:20称取硅胶湿法装柱，最后将拌好样品的硅胶装入中压柱内，然后用正己烷:乙酸乙酯=50:1 (v/v)开始洗脱，TLC监测收集流分，浓缩得到绵马素BB粗品，用正己烷:乙酸乙酯=80:1体系进行低温析晶得到产品，重结晶后得到纯度95.3±0.3% 的绵马素 BB 473.97±0.36mg。实施例2以干燥的香 鳞毛蕨为原料，称量lOOOg，加入6倍体积的40°C温水连续诱导3次，每次lOmin，将匀浆诱导好的液体用柠檬酸调节pH为4.0 ;取0.5%的固形物重量的复合酶(纤维素酶，果胶酶)，溶于pH为4.0的缓冲溶液中，在55°C水浴上激活lOmin，然后与匀浆液混匀，在40°C下酶解4h。诱导液分离后固形物采用超声波提取方法，用80%乙醇为溶剂进行提取，诱导液及乙醇提取液合并浓缩后将固体物质，加入50°C温水2L，于超声波提取器中IOOKHz条件下振荡絮凝20min，静止15min，取粘稠絮凝物，以-0.05MPa负压为动力用等体积乙酸乙酯进行负压空化混悬液固萃取，浓缩萃取液，将固形物用乙醇溶解，加入3倍AB-8树脂，使样品吸附，待溶剂挥干后上样，洗脱步骤为:水洗脱至无色，30%乙醇溶液10BV，50%乙醇溶液12BV、70%乙醇溶液20BV、80%乙醇溶液30BV和95%乙醇溶液22BV。洗脱完毕后收集含有目标成分的馏分，浓缩后分别进行凝胶分离。将树脂洗脱的50%、70%、80%以及95%部分分别浓缩，并将浓缩物用5%的甲醇溶解，配成12mg/mL的样品溶液,用Sephadex LH-20洗脱,经0.45 μ m滤膜过滤后，按照IOOmg样品/mL凝胶，注入S印hadex LH-20凝胶柱，用水-甲醇体系梯度洗脱,先用20%甲醇5倍柱体积洗脱、然后用40%甲醇6倍柱体积洗杂质、最后用90%甲醇6倍柱体积洗脱，收集洗脱液并浓缩得到固体。将树脂50%对应的凝胶洗脱部分用正己烷溶解，称取提取物质量1.1倍的300-400目硅胶均匀拌样。按质量比1:15称取硅胶湿法装柱，最后将拌好样品的硅胶装入中压柱内，然后以正己烷:乙酸乙酯=50:1 (v/v)进行洗脱，TLC监测收集流分，浓缩得到绵马素PB粗品，用石油醚:乙酸乙酯=5:1体系进行低温析晶得到产品，重结晶后得到纯度95.1±0.2% 的绵马酚 28.81 ±0.47mg。将树脂70%对应的凝胶洗脱部分用正己烷溶解，称取提取物质量1.1倍的300-400目硅胶均匀拌样。按质量比1:15称取硅胶湿法装柱，最后将拌好样品的硅胶装入中压柱内，然后以正己烷:乙酸乙酯=50:1 (v/v)开始洗脱，待棕色样品流出后开始收集组分并采用TLC进行监测，浓缩得到绵马素PB粗品，用正己烷:乙酸乙酯=20:1体系进行低温析晶得到产品，重结晶后得到纯度96.4 + 0.3%的绵马素PB 79.14 + 0.37mg。将树脂80%对应的凝胶洗脱部分用正己烷溶解，称取提取物质量1.1倍的300-400目硅胶均匀拌样。按质量比1:15称取硅胶湿法装柱，最后将拌好样品的硅胶装入中压柱内，然后以正己烷:乙酸乙酯=50:l(v/v)开始洗脱，先用10BV正己烷洗脱，然后采用10BV正己烷:乙酸乙酯=50:1 (v/v)，IOBV正己烷:乙酸乙酯=30:1 (v/v)进行洗脱，最后用正己烷:乙酸乙酯=15:1 (v/v)开始洗脱，待棕黄色色带流出后，收集流分并用TLC监测，至收集液中不含目标成分的部分，将样品浓缩得到香鳞毛蕨素粗品，用正己烷:乙酸乙酯=30:1体系进行低温析晶得到产品，重结晶后得到纯度95.2±0.1%的香鳞毛蕨素345.42±0.72mg。将树脂95%对应的凝胶洗脱部分用正己烷溶解，称取提取物质量1.1倍的300-400目硅胶均匀拌样。按质量比1:15称取硅胶湿法装柱，最后将拌好样品的硅胶装入中压柱内，然后用正己烷:乙酸乙酯=50:1 (v/v)开始洗脱，TLC监测收集流分，浓缩得到绵马素BB粗品，用正己烷:乙酸乙酯=80:1体系进行低温析晶得到产品，重结晶后得到纯度95.7±0.5% 的绵马素 BB 413.24±0.48mg。
图1为绵马酚分子结构式图2为绵马素PB分子结构式图3为香鳞毛蕨素分子结构式图4为绵马素BB分子结构式。
权利要求
1.本发明涉及一种从香鳞毛蕨中分离纯化四种间苯三酚类化合物的方法，其特征在于，具体步骤如下: (1)诱导:以干燥的香鳞毛蕨为原料，通过匀浆诱导技术和酶水解技术得到固体物质； (2)提取:将诱导后的固体物质通过以乙醇为溶剂，采用超声波辅助、冷浸、负压空化、微波辅助的方法提取，诱导液及乙醇提取液合并浓缩后通过超声波振荡絮凝技术得到絮凝物，将絮凝物经负压空化混悬液固萃取技术萃取； (3)分离:将萃取得到溶液浓缩后通过大孔吸附树脂柱色谱富集技术、凝胶分离技术及正相硅胶中压柱层析分离技术后得到绵马酚、绵马素PB、香鳞毛蕨素和绵马素BB粗品； (4)结晶:将绵马酚、绵马素PB、香鳞毛蕨素和绵马素BB的粗制品经过低温析晶和重结晶技术得到纯度大于95%的纯品。
2.按照权利要求1步骤(I)所述的匀浆诱导技术，其特征在于:匀浆诱导所用的溶剂为水，温度30-50°C，体积为固体质量的3-6倍，连续匀浆诱导3次，每次5-15min。
3.按照权利要求1步骤(I)所述的酶水解技术，其特征在于:在提取过程中使用酶对新鲜或干燥的香磷毛蕨进行水解，将匀浆诱导后的浆液用柠檬酸、冰醋酸或盐酸调PH为3.0-6.0 ;取0.2-3%固形物重量的纤维素酶和果胶酶的复合酶，溶于pH为3.0-6.0的缓冲液中，在40-60 V水浴中激活8-15min，将激活后的复合酶缓冲液加入匀浆诱导浆液中，在温度为30-50°C的水浴中酶解3-5h。
4.按照权利要求1步骤(2)所述的乙醇提取液，其特征在于:乙醇提取液所提物质为匀浆诱导和酶水解后的固形物，提取方法为超声波辅助提取、冷浸提取、负压空化提取和微波辅助提取，所用溶剂为60-85%乙醇。
5.按照权利要求1步骤(2)所述的超声波振荡絮凝技术，其特征在于:将香鳞毛蕨乙醇提取物置于温度为40-50°C的水中，体积为提取物体积的6-8倍，超声波振荡絮凝时间为15-20min，频率为 80_100kHz，静置时间为 10_20min。
6.按照权利要求1步骤(2)所述的负压空化混悬液固萃取技术，其特征在于:对粘稠絮凝物进行负压空化混悬液固萃取，所用溶剂包括乙酸乙酯、正己烷、三氯甲烷和正丁醇，萃取所用的溶剂体积为提取物质量的0.05-0.1倍，萃取次数为3-5次，所用的压力为-0.05Mpa。
7.按照权利要求1步骤(3)所述的大孔吸附树脂柱色谱富集技术，其特征在于:将树脂填充到玻璃柱中，使之形成以树脂为填料的层析柱，所用树脂包括H1020、H103、D101、D3520、HPD-D, FL-3、AL-U AB-8、HPD-826、HPD-600、NKA2 或 FL-1 广谱性大孔吸附树脂，该方法操作步骤为:预先称取质量为样品量6-8倍的树脂，采用湿法装柱，保留液面，将负压空化混悬液固萃取所得到的固形物加入到乙醇中，充分搅拌溶解后，加入2-5倍量树脂，40-50°C条件下加热至乙醇挥干，样品完全吸附在树脂上，然后将拌样树脂加载到预置的树脂柱顶层，加入乙醇-水溶液梯度洗脱，具体包括用5-20BV体积分数10%-30%的乙醇溶液洗脱杂质，10-50BV体积分数50%-95%的乙醇溶液依次洗脱组份，收集洗脱液，浓缩至干。
8.按照权利要求1步骤(3)所述的凝胶分离技术，其特征在于:所用样品为树脂富集后所得固形物，所用凝胶为S印hadexLH-20凝胶，将大孔吸附树脂富集的50%_95%部分分别浓缩，并将产物用2%-8%甲醇溶解，配制成料液浓度为5-20mg/mL的样品液，经0.45 μ m滤膜过滤后，按照100-150mg样品/mL凝胶,注入Sephadex LH-20凝胶柱,用水-甲醇体系梯度洗脱，先用20%甲醇2-5倍柱体积洗脱、然后用40%_70%甲醇3-7倍柱体积洗杂质、最后用80%-90%甲醇4-7倍柱体积洗脱，收集洗脱液。
9.按照权利 要求1步骤(3)所述的正相硅胶中压柱层析分离技术，其特征在于:所用样品为S印hadexLH-20凝胶所得固形物，所用硅胶为300-400目，预先称取质量为样品量10-20倍的硅胶，采用湿法装柱，所用溶剂包括乙酸乙酯和正己烷，将样品加入有机溶剂溶解，加入与浸膏质量比为1.2:1 (w/w)的层析硅胶拌匀、减压蒸干，装入预先装好的硅胶柱中，先后以1-30BV正己烷或石油醚、3-20BV正己烷或石油醚:乙酸乙酯或氯仿、丙酮=80:1-15:1洗脱，收集洗脱液，每份250-500mL，用硅胶薄层层析检测洗脱液成分，合并相同部分，展开剂为正己烷:乙酸乙酯=100:1-10:1，紫外波长为254nm和365nm。
10.按照权利要求1步骤(4)所述的低温析晶和重结晶技术，其特征在于:重结晶所用的溶剂为乙酸乙酯、石油醚、正己烷、二氯甲烷、乙腈、丙酮和甲醇中的两种，以100:1-10:1的比例混合，温度为-5-20°C。
全文摘要
本发明涉及一种从香鳞毛蕨中分离纯化四种间苯三酚类化合物的方法，目的是提供一种安全经济有效的从香鳞毛蕨中分离纯化绵马酚、绵马素PB、香鳞毛蕨素和绵马素BB单体的方法，本发明所采取的技术方案是以干燥的香鳞毛蕨为原料，采用匀浆诱导技术和酶水解技术增加游离的活性成分含量，同时用乙醇为溶剂，通过超声波辅助提取、冷浸提取、负压空化提取、微波辅助提取得到提取物，将提取物采用超声波振荡絮凝技术、负压空化混悬液固萃取技术、大孔吸附树脂柱色谱富集技术、凝胶分离、正相硅胶中压柱层析分离技术及低温析晶和重结晶技术得到绵马酚、绵马素PB、香鳞毛蕨素和绵马素BB四种单体，其纯度均可达95%以上。该方法分离纯化工艺简单易行，操作安全，产品得率高，纯度高，并且香鳞毛蕨资源丰富易得，适用于工业应用。
文档编号C07C49/723GK103102255SQ201210382918
公开日2013年5月15日 申请日期2012年10月11日 优先权日2012年10月11日
发明者付玉杰, 高畅, 李娜, 李吉, 赵春健, 李春英, 张东阳 申请人:东北林业大学, 付玉杰