专利名称：一种hnRNP A2*蛋白质、编码该蛋白的核酸及用途的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种hnRNP A2*蛋白质、编码该蛋白的核酸及用途，属于生物技术领域。
背景技术：
人染色体末端由TTAGGG重复DNA序列和相关蛋白组成的端粒所保护。端粒DNA的不完全末端复制在双链区外留下了一个3’端的单链突出末端，并使得端粒DNA随着细胞分裂而变短。端粒酶向3’端添加端粒重复序列是补偿端粒损耗(Telomere erosion)的主要方式。在出芽酵母中，端粒延长是由Cdcl3介导的。Cdcl3是一个单链端粒DNA结合蛋 白，同时也与端粒酶RNA(Tlcl)结合蛋白Estl结合。这样，Est2(酵母端粒酶的催化亚基)通过以下相互作用被募集至端粒处突出末端一Cdc13 — Estl — Tlcl — Est2。类似的情况也发生在四膜虫中，Tebl建立起端粒酶与端粒之间的相互作用，使得端粒酶能够高效地延长端粒。但是在哺乳动物细胞中，端粒酶经由卡佳尔体(cajal body)被募集至端粒处，端粒与端粒酶相互作用的机制尚不清楚，介导这一相互作用过程的因子也还是未知的。四个TTAGGG重复序列可以形成一种四链的G-四链体结构。虽然分子间的G-四链体可以作为纤毛虫端粒酶的底物，但是分子内的G-四链体却不能。对于脊椎动物端粒DNA，分子内G-四链体(以下均称为G-四链体)会优先在3’端最远处形成，使得端粒酶无法靠近，从而抑制端粒的延伸。到现在为止，已经发现了一些可以解开端粒G-四链体结构的蛋白。POTl是一种对端粒突出末端具有高亲和力的端粒结合蛋白(shelterin),具有解开端粒G-四链体的作用。当端粒DNA和POTl的复合体3’端存在不小于8个核苷酸尾端时可以被端粒酶延伸。由于POTl优先与3’端5’ -TAGGGTTAG-3'的最小结合位点(MBS)结合，POTl与端粒DNA的结合会留下的3’尾端小于5个核苷酸的尾巴，从而抑制线性端粒底物的延伸，但是略微增强对G-四链体底物的延伸。hnRNP家族的一部分蛋白质也具有解开端粒G-四链体的作用，它们在体外实验中能与单链端粒DNA和端粒酶的相互作用，说明它们可能在端粒功能中起一定的作用。hnRNP家族主要在RNA代谢中起作用，是细胞中最丰富的蛋白之一。例如，hnRNP的A2/B1和Al在单个细胞中分子数超过IO7,远超过一个细胞中仅有的数十个端粒末端和端粒酶分子。一个HEK-293人胚肾细胞中只含有约20 50个端粒酶分子，92个端粒，而酵母中则只含有29个端粒酶分子，64个端粒。这些事实质疑这些蛋白会与端粒与端粒酶直接发生相互作用，因为它们在理论上只会饱和结合端粒与端粒酶，从而阻止端粒与端粒酶之间的相互作用。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是提供一种hnRNP A2*蛋白质、编码该蛋白的核酸及用途，hnRNP A2*能高效地解开端粒G-四链体，显著增强端粒酶的催化活性和进行性，使端粒DNA得以延长，将会防止细胞进入复制性衰老，维持细胞的分裂潜能。这一点对于扩增有用细胞，用于细胞治疗和生产有重要的价值。本发明解决上述技术问题的技术方案如下一种hnRNP A2*蛋白质，所述蛋白质包含有SEQ ID NO. I所示的氨基酸序列的蛋白质、蛋白质片段、蛋白质的类似物或衍生物。在上述技术方案的基础上本发明还做了如下改进进一步，所述蛋白质片段、类似物或衍生物的氨基酸序列具有与SEQ ID NO. I所示的氨基酸序列至少95%的相同性。进一步，所述蛋白质包含具有SEQ ID NO. I所示的氨基酸序列的蛋白质。
本发明解决上述技术问题还提供了一种核酸，所述核酸编码具有SEQ ID NO. I所示的氨基酸序列的蛋白质、蛋白质片段、蛋白质的类似物或衍生物的核酸。在上述技术方案的基础上本发明还做了如下改进进一步，所述核酸包含编码具有SEQ ID NO. I所示的氨基酸序列的核酸。进一步，所述核酸包含有SEQ ID NO. 2中的1_762位的序列。本发明解决上述技术问题还提供了一种hnRNP A2*蛋白质的用途，所述hnRNP A2*蛋白质用于解开端粒G-四链体，促进端粒酶对端粒的延长。在上述技术方案的基础上本发明还做了如下改进进一步，所述hnRNP A2*蛋白质能够识别端粒5’ -TAGGGTTAGG-3’的核酸序列，hnRNP A2*蛋白质与端粒DNA结合后，解开端粒G-四链体的结构，并暴露出5’ -GTTAG-3’的末端，所述5’ -GTTAG-3’能和脊椎动物端粒酶RNA模板5’ -CUAAC-3’配对，使端粒酶对端粒进行延长，维持端粒长度。本发明的有益效果是I)本发明公开了一个在哺乳动物细胞中新发现的端粒与端粒酶相互作用的蛋白(称为hnRNP A2*),它可以与端粒酶共定位于卡佳尔体(kajal body)和端粒,它通过主动高效地解开端粒G-四链体，在端粒3’末端结合最小结合位点，将端粒3’端的一个长约5个核苷酸的尾巴暴露出来，从而使得它可以和端粒酶的RNA模板配对，显著增强了端粒酶的催化活性和进行性，延长了细胞的端粒，有效补偿细胞分裂导致的端粒缩短，改善和解决细胞扩增的问题。2)本发明也为控制细胞分裂寿命提供了技术启示。通过控制hnRNPA2*蛋白的表达可以改变细胞的端粒长度，进而调节细胞的分裂能力，满足增加有用细胞群体的寿命和扩增能力，或者诱导有害细胞如癌细胞的衰老。细胞分裂潜能的维持取决于细胞是否能够有效地补偿它在分裂过程中所发生的端粒DNA缩短，维持端粒长度的平衡。hnRNP A2*能够识别5’ -TAGGGTTAGG-Si的核酸序列。由于这一序列的3’末端比天然的端粒DNA的3’末端多出一个G核苷酸，所以它结合端粒DNA后会解开端粒G-四链体结构，并暴露出其最末端的GTTAG五个核苷酸，提供给端粒酶进行端粒延长，维持端粒长度。3)本发明hnRNP A2*与hnRNP蛋白质具有不同的功能，并对端粒延长具有特异性。hnRNP A2*的低丰度和细胞内位置证明它与其它hnRNP蛋白有功能上的区分。相较于hnRNP的高丰度，hnRNP A2*转录本的丰度极低，它的mRNA只有在hnRNP A2和它的衍生物的外显子7被完全切除后才能用RT-PCR检测到(图1C)。4)本发明的hnRNP A2*蛋白质和编码该蛋白质的核酸序列对涉及hnRNP A2*表达改变的疾病如癌症，早老症提供了建立诊断工具的手段，这些诊断工具包括针对hnRNP A2*核酸序列的核酸探针杂交和针对hnRNP A2*蛋白的抗体反应。
图I :28kD 大小的 hnRNP A2* 的鉴定。(A) (TTAGGG) 3 亲和纯化蛋白 SDS-PAGE结果(左)，32P-(TTAGGG) 3 标记的 Southern-western 印迹(右)。(B) 28kD 的 hnRNP A2* 的MALDI-T0F质谱分析肽段图谱。(C)使用或未使用使用核酸内切酶Xho I处理的hnRNP A2和hnRNP A2*cDNA的PCR结果。hnRNP A2的cDNA和其他变体与外显子7处的互补DNA退火后使用Xho I切割，使其不被扩增。(D)hnRNP A2*和hnRNP A2的mRNA。(E)使用接点弓丨物(junction primer)的RT-PCR在大鼠小鼠以及人细胞中检测到的hnRNPA2*的mRNA。图2:在电泳迁移率实验(EMSA)中hnRNP A2*特异性结合于端粒DNA。(A)使用大肠杆菌表达并纯化后的hnRNP A2*。(B)hnRNP A2*与hnRNP A2功能基团对比。(C)在竞争性DNA逐渐提高的浓度梯度下(下方图像表示)，hnRNP A2*对(TTAGGG)3的结合。(D)hnRNPA2*与TAGGGTTAGG最小结合位点结合。(E)单核苷酸突变对hnRNP A2*与TAGGGTTAGGGTTAG 结合的影响。使用的DNA有野生型序列(W)和具有图示突变的单突变序列。星号表示使其无法结合的突变。图3:hnRNP A2*高效解开端粒G-四联体,与端粒DNA的3’端的最小结合位点结合，暴露出一个5核苷酸的尾部而激活端粒酶。(A) hnRNP A2*介导的G-四联体的高效解开与在互补富C的DNA链存在下G-四联体的自发解开的对比。hnRNP A2*或过量富C的DNA序列加入过程中供体荧光的实时监测。(B) hnRNP A2*对不形成G-四联体的端粒DNA的结合偏好性。5’端使用32P标记的DNA与hnRNP A2*共孵育后，使用可以从3’末端切除核苷酸的T4聚合酶消化。小写字母表示用于控制最小结合位点(由方括号表示)的数量和位置的突变。(C) hnRNP A2*和POTl对形成G-四联体的端粒DNA的结合偏好性。实线方括号表不hnRNP A2*的最小结合位点，而虚线方括号则表不POTl的最小结合位点。其他条件与(B)中相同。(D，E)使用TRAP分析在hnRNP A2*或POTl存在的情况下，大鼠细胞或海拉(HeLa)细胞裂解液中端粒酶分别对(D)中非端粒的端粒酶底物以及(E)中G-四联体的TSG4底物的催化活性。(E)中插入的图像表示自由的TSG4 (左)和TSG4/hnRNP A2*复合物(右)的电泳迁移实验结果。(F)在40% (质量体积比)的PEG200存在下，使用改进TRAP分析海拉(HeLa)细胞裂解液中端粒酶对非端粒的MTS底物的持续合成能力的结果。图4:hnRNP A2*在体内和体外试验中均可以与端粒酶相互作用。(A)大鼠细胞裂解液中使用镍珠免疫固化His6标记的hnRNP A2*后，TRAP分析得到的端粒酶活性下降。(B)在逐渐提高的浓度(0，O. 25，O. 5，ImM)下hnRNP A2*对大鼠端粒酶结合的电泳迁移率实验结果。(C)培养的大鼠细胞中使用三种荧光分析hnRNP A2*，TERT和Rapl/Coilin的共定位。RAPl和Coilin分别作为端粒和卡佳尔体的标志。最右边的泳道表示了细胞数量和每一种共定位类型位点。图5:体内试验中hnRNP A2*与端粒酶活性和端粒长度的关系。(A)七周大鼠组织中hnRNP A2*表达水平和与hnRNP A2, TERT以及端粒酶活性的关系。hnRNP A2*，hnRNPA2,和TERT的表达水平使用RT-PCR分析，而端粒酶活性则使用TRAP分析。相对丰度先通过对肌动蛋白的标准条带强度作归一化，然后在对脑组织条带强度作归一化获得.IS :内标。(B)hnRNP A2*过表达提高了海拉(HeLa)细胞中端粒长度。使用HA标记的hnRNP A2*表达载体或对照的空载体转染细胞后，使用药物筛选出克隆并培养至所示的细胞群体倍增数(PDs)。分别使用Southern印迹(左)和泳道数字化分析(右)分析了端粒限制酶切片段。M:DNA分子量标记。图6 hnRNP A2*蛋白专一性解开端粒DNA四链体结构。(A) DNA四链体结构荧光共振转移实验中的荧光强度变化。(B)DNA四链体结构和游离单链随机DNA结合hnRNP A2*蛋白或互补DNA后电泳迁移率改变。(C) POTl蛋白结合端粒DNA序列3’末端的MBS位点并封闭末端。5’端32P标记的DNA与POTl蛋白孵育，之后再用T4多聚酶消化处理，T4多聚酶消化可以除去DNA3’末端暴露的核苷酸。小写字母表示引入的突变以改变MBS的数量和位置。方括号状表示MBS位置。(D)在不添加hnRNP A2*蛋白情况下端粒DNA序列被T4多聚酶完全消化。第一个泳道是用DNaseI消化TTAGGGTTAGGGTTAGGGTTAG所得到的I个核苷酸大小梯度参照。其它泳道情况与图3B完全一致。图7: (A) hnRNP A2*蛋白增强海拉(HeLa)细胞和大鼠BRL细胞的端粒酶催化活性。TRAP实验用非端粒的TS序列检测端粒酶活性。hnRNP A2*蛋白的浓度如图3D所示。 最后一个泳道表示端粒酶缺失。(B)TRAP实验中hnRNP A2*蛋白增强从海拉(HeLa)细胞和大鼠BRL细胞获得的端粒酶催化活性。实验使用在延伸反应前就能形成四链体结构的TSG4序列作为底物。hnRNP A2*蛋白的浓度如图3E所示，最后一个泳道表示端粒酶缺失。(C)hnRNP A2*蛋白增强从海拉(HeLa)细胞和大鼠BRL细胞获得的端粒酶的持续延伸活性。用我们改进的TRAP方法在添加40%(w/v)PEG 200条件下以非端粒序列MTS为底物进行持续延伸活性检测实验。最后一个泳道表示端粒酶缺失；is泳道表示内部参照。图8: (A)hnRNP A2蛋白的亲水性作图。图中含有hnRNP A2*蛋白所缺失的片段。
(B)在不同的大鼠细胞亚细胞成分中蛋白质杂交检测hnRNP A2*蛋白。HA_hnRNP A2*蛋白在大鼠细胞中表达，用抗HA的抗体检测HA-hnRNP A2*蛋白。Y-tubulin和p84蛋白分别是细胞质胞浆和细胞核基质的标志分子，它们分别用相应的抗体检测。图9: (A)TRAP方法检测固定于镍珠的hnRNP A2蛋白从大鼠细胞拖拽下来的端粒酶活性。(B)用电泳迁移率实验(EMSA)方法检测hnRNP A2蛋白在增加浓度(O, O. 25，O. 5，ImM)条件下结合大鼠端粒酶RNA成分的情况。实心箭头表示rTR和hnRNPA2*复合物，空心箭头表示游离的rTR。实验进行的条件分别和图4A、图4B相一致。图10: (A)用免疫荧光法检测hnRNP A2*和RAP1、TERT、Coilin在培养的大鼠细胞中的共定位。RAPl和Coilin分别是端粒和卡佳尔体(Cajal body)的标志分子。(B)突光免疫法用抗HA的抗体分别染色培养的表达HA-hnRNP A2*蛋白(上部分)和不表达HA-TTAP的大鼠培养细胞。(C)荧光免疫法检测表明大鼠TERT蛋白的表达受到了 TERT干扰RNA的抑制。所示的实验结果图片都是从三次独立的实验中获得，所有的图片都是在相同的曝光时间下拍摄。图11: (A)三色荧光标记染色观察大鼠细胞内RAPUTERT和hnRNP A2*典型共定位。RAPl是端粒的标志分子。(B)三色荧光标记观察在大鼠细胞内Coilin、TERT和hnRNPA2*的典型共定位。Coilin是卡佳尔体(Cajalbody)的标志分子。图12: (A) 11个月年龄大鼠组织中hnRNP A2*表达量和hnRNP A2表达量、TERT表达量、端粒酶活性的相关性。hnRNP A2*、hnRNP A2和TERT的表达量用RT-PCR方法检测，端粒酶的活性用TRAP检测。相对丰度先通过对肌动蛋白的标准条带强度作归一化，然后在对脑组织条带强度作归一化获得。IS表示内部参照。(B)大鼠细胞端粒的长度随hnRNPA2*蛋白过表达量增加而增加。每个泳道的密度峰用白色箭头标示。HA-hnRNP A2*蛋白的表达用蛋白质杂交的方法检测。其它实验条件和图5B—样。
具体实施例方式以下结合本发明的原理和特征进行描述，所举实例只用于解释本发明，并非用于限定本发明的范围。本发明通过以下实验阐述本发明的研究思路，揭示hnRNP A2*蛋白的分离纯化过程，分析hnRNP A2*解开DNA四链体结构的原理等等。
亲和纯化端粒DNA结合蛋白的实验用文献(MaH, Siegel AJ, Berezney R(1999)Association of chromosometerritories with the nuclear matrix. Disruption of human chromosome territoriescorrelates with the release of a subset of nuclear matrix proteins. J CellBioll46:531-542.)中的方法从大鼠的肝脏中分离出与维持染色体相关的核基质蛋白。这些核基质蛋白用来与生物素标记的并且结合在链霉素亲和素包被的琼脂糖珠子上的端粒DNA寡聚核苷酸序列(TTAGGG) 3做亲和纯化分离实验。纯化分离实验是在有竞争性酵母tRNA和超声破碎的鲑精DNA存在的条件下进行。最后用2M的氯化钠溶液将结合在珠子上的蛋白洗脱下来。亲和分离的蛋白质产物上样到12%十二烷基磺酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳，切取28kD分子量大小的蛋白，用胰蛋白酶消化处理。再用MALDI-T0F质谱来分析胰蛋白酶消化所得到的片段，之后将得到的数据提交到MS-Fit网站(http://prospector, ucsf.edu/ucsfhtml4. 0/msfit. htm),返还的9个片段信息表明它们与hnRNP A2蛋白上的片段匹配。hnRNP A2*蛋白cDNA的克隆和蛋白质的分离纯化用poly-T做引物以DNase处理过的大鼠肝脏mRNA做模板做逆转录反应得到cDNA。然后用一条与hnRNP A2的7号外显子互补配对的寡聚核苷酸链使之与hnRNP A2cDNA部分互补配对，在用核酸内切酶XhoI切断配对部分。hnRNP A2*蛋白的mRNA逆转录得到的 cDNA 用引物 5’ -TAGCTAGCATGGAGAGAGAAAAGGAA-3’ 和 5' -AAGAGCTCTCAATATCGGCTCCTTCCA~3/ 根据文献(Wang F，Zhao Y, Hao YH, Tan Z (2008) Identification of low-abundancealternatively spliced mRNA variants by exon exclusive reverse transcriptasepolymerase chain reaction. Anal Biochem 383:307-310.)中我们所建立的外显子去除方法扩增hnRNP A2*基因。扩增出来的片段被克隆到pET28_b质粒的Nhel/SacI酶切之间，然后将得到的质粒转化到大肠杆菌BL21(DE3)菌株细胞(北京百泰克生物技术有限公司)内。转化的细胞在37°C条件下LB培养基中培养4小时，然后用ImM的异丙基-β -D-硫代半乳糖苷诱导重组的带HiS6标签的hnRNP A2*蛋白表达，诱导2小时后收集大肠杆菌细胞，再在一个容器里用缓冲液A (50mM磷酸二氢钠，pH 8. O, 300mM氯化钠，40mM咪唑，ImM 二巯基苏糖醇，ImM苯甲磺酰氟)在4°C条件下超声破碎细胞。所得细胞裂解液在4°C 20000Xg离心力下离心20分钟，所得到的上清液上柱到HisTrap亲和柱上。再用10倍柱子体积的缓冲液A漂洗后，结合在柱子上的His-hnRNP A2*用缓冲液B (50mM磷酸二氢钠，pH 8. O, 300mM氯化钠，400mM咪唑)洗脱下来。 制备大鼠端粒酶RNA序列大鼠端粒酶RNA序列逆转录后用聚合酶链式反应扩增，然后克隆到PMD19-T质粒中。再用限制性内切酶Crf 131, Rsa I, FspB I, BamH I切割rTR序列中存在酶切位点，线性化质粒，然后把线性化质粒作为模板用T7转录试剂盒转录，再在T4多核苷酸激酶作用下用[Y-32P]ATP标记转录产物。电泳迁移率改变实验80nM 5’端被[Y -32PlATP标记的寡聚核苷酸链与400nM的重组hnRNPA2*蛋白在4°C结合缓冲液(IOmM三羟甲基氨基甲烷，pH 8.0，ImM乙二胺四乙酸，150mM氯化钾)条件下孵育30分钟,然后上样在8%非变性聚丙烯酰胺胶中电泳,再在Typhoon phosphorimager上放射性自显影。T4聚合酶水解实验 50nM 5’ [ y -32PlATP标记的寡聚核苷酸链与I. 5 μ M的hnRNP A2*蛋白或POTl蛋白在4°C 10 μ L结合缓冲液(IOmM三羟甲基氨基甲烷，pH 8.0，ImM乙二胺四乙酸，150mM氯化钾)中孵育15分钟。然后加入O. 5U T4聚合酶，IyL IOX内切酶缓冲液(330mM三(羟甲基)氨基甲烷醋酸盐，PH 7. 8，IOOmM Mg(CH3CO2)2, 5mM 二巯基苏糖醇)，4°C孵育I分钟进行切割。最后用酚氯仿抽提终止反应，产物再用乙醇沉淀，上样到含7M尿素19%聚丙烯酰胺凝胶进行电泳。准备端粒酶提取物用文献(KimNW, Piatyszek MA, Prowse KR, Harley CB, West MD, et al. (1994)Specific association of human telomerase activity with immortal cells andcancer. Science 266:2011-2015.)所描述的方法提取海拉(HeLa)细胞或是RRL-3A大鼠细胞提取物，细胞提取物中的端粒富含鸟嘌呤DNA序列结合蛋白用结合在链霉素亲和素-琼脂糖上的5’端生物素标记的(TTAGGG)3序列亲和结合而除去。端粒酶催化活性分析用端粒重复序列扩增(TRAP)实验方法以TS(5，-AATCCGTCGAGCAGAGTT-3，)或是 TSG4(5’-GGGCTAGGGCTAGGGCTAGGGAGTT-3’)作为底物来分析端粒酶催化活性。端粒酶底物与不同浓度的hnRNP A2*蛋白或是POTl蛋白在5000个细胞的端粒酶提取物在50 μ L中孵育。在添加0. 25mM dNTP后在30°C (TSG4为底物在37°C )进行延伸反应10分钟后75°C加热5分钟终止反应。接着在有内参标准序列(5，-AATCCGTCGAGCAGAGTTAAAAGGCCGAGAAGCGAT-3，和5’-ATCGCTTCTCGGCCTTTT-3’ 用于 TS 组，5' -GGGCTAGGGCTAGGGCTAGGGAGTTAAGCGGCCGAGAAGCGAG-S'和5’-CTCGCTTCTCGGCCGCTT-3’用于TSG4组)存在下用酚氯仿抽提，再用乙醇沉淀。收集获得的产物用聚合酶链式反应33个循环扩增(94°C 30s ；59°C 30s)。TS序列和5’ -GCGCGGCTTACCCTTACCCTTACCCTAACC-3’ 作为 TS 组反应的引物；TSG4 和 5’ -GTGCCCTTACCCTTACCCTTACCCTAA-3’作为TSG4组反应的引物。聚合酶链式反应产物在12%聚丙烯酰胺凝胶上电泳，然后用溴化乙锭染色，用ChemiImager 5500照相。端粒酶的活性用未添加hnRNP A2*或是POTl蛋白的对照组的倍数来表示，应用的公式为(ΤΡ/ΤΡ0) X (ISO/IS)，TPO和ISO分别代表端粒酶催化产物总量和内参的产物总量，TP和IS分别代表在添加了 hnRNP A2*或是POTl蛋白条件下所获得的总产物量。分析端粒酶持续延伸活性本发明用一个改进的端粒重复序列扩增方法专门用来分析端粒酶的持续延伸活性，这个方法如文献(Xue Y, Kan ZY, Wang Q, Yao Y, Liu J, et al. (2007) Human telomericDNA forms parallel-stranded intramolecular G-quadruplex in K+solution undermolecular crowding condition. J Am Chem Soc 129:11185-11191.)介绍的米用 TSNT 作为内部参照。MTS底物在含有O. 25mM dNTP, O. 5μ M hnRNP A2*或POTl蛋白，5000个细胞的端粒酶细胞提取物，含有或不含40%聚乙二醇200和的50 μ L体积中37°C反应10分钟，然后加热到75°C 5分钟终止反应，再加入内部参照序列(5’ -AGCATCCGTCGAGCAGAGTTAAAAGGCCGAGAAGCGAT-3’和5’ -ATCGCTTCTCGGCCTTTT-3’)，用酚氯仿抽提和乙醇沉淀。收集得到的寡聚核苷酸链在添加IOpmol RP, 0. 02pmol RPC 3g和IU Taq DNA聚合酶后进行聚合酶链式反应扩增，先在94°C 30s ；55°C 60s ；72°C 90s条件下2个循环，再在94°C 30s ；63°C 30s ；72°C 30s条件下进行29个循环。聚合酶链式反应产物在12%聚丙烯酰胺凝胶上电泳，然后 用溴化乙锭染色，用ChemiImager 5500照像。准备亚细胞成分和蛋白质杂交检测亚细胞成分的获取的方法是按照文献(Luderus ME, van Steensel B, ChongL,Sibon 0C,Cremers FF,et al. (1996)Structure,subnuclear distribution,andnuclear matrix association of the mammalian telomeric complex. J CellBioll35:867-881.)所描述的方法改进而来。简要的说，转染了 hnRNP A2*基因的BRL-3A细胞用冷的Earle’s溶液洗涤两次，然后把细胞重悬于10倍体积的RSB溶液(0. IM氯化钠，I. 5mM氯化镁，IOmM Tris-盐酸(pH 7. 4)，O. 1%洋地黄皂苷)，4°C放置10分钟；然后把让细胞流过一个19. 5gauge的针头来裂解细胞，重复五次。之后细胞裂解液在含10%的甘油的RSB溶液中23000 Xg离心30分钟。离心后的上清液收集作为细胞质提取物。收集沉淀中的细胞核成分后在RSB溶液中37°C孵育20分钟，然后用LIS溶液在室温下作用10分钟裂解细胞核成分，浓度为2 X IO6细胞每毫升LIS溶液。LIS溶液成分为IOmM LIS, IOOmM醋酸锂，ImM乙二胺四乙酸，0. 1%洋地黄皂苷，0. 05mM精胺，0. 125mM亚精胺，0. 25mM苯甲基磺酰氟化物，和20mM H印es-氢氧化钾(pH 7.4)。LIS溶液处理后，20000 X g离心力下离心20分钟，所得的上清液成分和沉淀成分分别收集作为核质成分和核基质成分。这三种细胞组分中的蛋白质分别在10%十二烷基磺酸钠聚丙烯酰胺凝胶上电泳，然后转移到硝化纤维素膜上。HA-hnRNP A2*蛋白用小鼠抗HA的单克隆抗体来检测，hnRNP A2/B1蛋白用山羊抗hnRNP A2/B1的多克隆抗体来检测。不同大鼠组织中端粒酶活性和mRNA含量水平雄性小鼠处死后分离器官，立即用来做端粒酶活性分析和RNA提取。用于端粒酶活性分析时，待检测的组织按0. 5毫克组织每毫升端粒酶提取裂解液的量添加裂解液，用一个灭菌处理过的组织研磨器磨碎组织，在冰上孵育30分钟。然后将细胞裂解物在
40C 12000 X g离心力下离心30分钟。得到的上清液用液氮迅速冻存，保存在_80°C冰箱直至使用。用Bradford方法来测定所得上清液中蛋白质含量,每次端粒酶延伸实验用含200ng蛋白质的提取物的量。RNA含量的检测用RT-PCT的方法，0.05 Ug的总RNA用MMLV逆转录酶做逆转录，然后用聚合酶链式反应扩增。细胞培养方法大鼠BRL-3A细胞和海拉(HeLa)细胞在添加了 10%胎牛血清，100单位/毫升青霉素和O. I毫克/毫升链霉素的DMEM培养基中，5% 二氧化碳浓度37°C条件下培养。逆转录病毒载体和病毒颗粒产生hnRNP A2* 蛋白的 cDNA 用 HM6 正向引物 5’ -GATGGTACCATGGAGAGAGAAAAGGAACAGTTC-3'和 HM6 反向引物 5’ -GACGAATTCATTCTCAATATCGGCTCCTTCCAC-3’ 聚合酶链式反应扩增，扩增产物插入到PHM6表达载体的KpnI/EcoRI酶切位点处。克隆之后质粒上的HA-hnRNPA2*蛋白基因片段用T7启动子正向引物5’ -TAATACGAGTCACTATAGGGA-3’和HM6反向引物扩增。然后把扩增产物克隆到PGEM-T载体上。然后再将片段克隆到pQCXIN逆转录病毒表达载体的Notl-EcoRI酶切位点处(用于BRL-3A细胞)，或者克隆到pMSCV-IThyl-1逆转录病毒载体的EcoRV-KpnI酶切位点处(用于海拉(HeLa)细胞)。获得的重组pGEM_T HA-hnRNP A2* 载体转染到 EcoPack2-293 细胞中，pMSCV-IThy 1-lHA-hnRNP A2* 载体和 pGag-pol、pMD.G-VSVG-env质粒一起转染到293T细胞中用来产生逆转录病毒。转染细胞48小时后收集含有病毒颗粒的培养基。在大鼠BRL-3A细胞中稳定表达HA-hnRNP A2*蛋白将大约生长到70%密度的大鼠BRL-3A细胞暴露到含病毒颗粒培养基和新鲜培养基按I : I比例混合液中，培养12个小时。然后用含有SOOyg/ml G418抗生素的新鲜培养基替换BRL-3A细胞的旧培养基，用含300μ g/ml G418抗生素的新鲜培养基替换海拉(HeLa)细胞的旧培养基。BRL-3A细胞在这个培养基中培养两个星期，而海拉(HeLa)细胞则保持100 μ g/ml G418抗生素浓度条件下培养。BRL-3A使用的克隆，海拉(HeLa)细胞为非克隆的细胞。突光免疫显微法在玻璃盖玻片表面生长的大鼠BRL-3A细胞用含2%的多聚甲醛的PBS (pH7. 4)缓冲液中室温下固定8分钟，然后用含O. 5%Triton X-100的PBS缓冲液做透化处理。之后细胞用同实验所使用二级抗体来源相同的物种的10%浓度正常血清做预封闭处理。实验中用到的一级抗体有以下一些，山羊或兔抗TERT多克隆抗体；兔抗Coilin多克隆抗体；鼠抗HA单克隆抗体；兔抗hRAPl多克隆抗体。用到的二级抗体有以下几种，Cy3标记的驴子抗山羊抗体；f Iuorescein标记的山羊或驴子抗兔抗体，DyLight649标记的驴子抗兔抗体。这些二级抗体都是根据生产商所推荐的稀释浓度使用的。在室温下一级抗体处理I个小时，再二级抗体处理45分钟，之后接着用PBS缓冲液洗涤4次，每次洗涤5分钟。最后，盖玻片用含O. 5 μ g/ml DAPI的VECTASHIELD包埋介质盖好，再用ZEISS 51OMETA共聚焦显微镜的100倍油镜下观察免疫荧光染色结果。POTl蛋白的制备重组人源POTl 蛋白是根据文献(Kelleher C，Kurth I, Lingner J(2005)Humanprotection of telomeres I(POT I)is a negative regulator of telomerase activityin vitro. Mol Cell Biol 25:808-818.)描述的方法准备。质粒 pET-14-POTl 由 JoachimLingner惠赠。把pET-14-POTl质粒转化到大肠杆菌BL21 (DE3)菌株细胞内，然后让细胞在添加了 1%葡萄糖和O. 05mg/ml浓度的羧苄青霉素的TB培养基中37°C培养5小时，再用5μ M浓度的异丙基-β -D-硫代半乳糖苷诱导蛋白表达，在25°C条件下诱导2小时。收集诱导菌体细胞后用含lmg/ml浓度溶菌酶的溶液C在一个容器中重悬细胞，溶液C的成分是20mM磷酸二氢钠，pH 8. O, 200mM氯化钠，O. 2%聚氧乙烯山梨糖醇酐单月桂酸酯，IOmM咪唑，20%甘油，5mM β -巯基乙醇。然后在4°C放置20分钟，再用超声破碎细胞。细胞裂解液在4°C 20000 X g离心力下离心20分钟，所得到的上清液上样到HisTrap HP亲和柱上，接着用10倍柱子体积的溶液A漂洗，然后用400mM咪唑溶液C把结合在柱子上的His-POTl蛋白洗脱下来，接着用溶液D做透析处理，溶液D成分(20mM磷酸二氢钠，pH 8. O, 50mM氯化钠，O. 2%聚氧乙烯山梨糖醇酐单月桂酸酯，20%甘油，5mM β -巯基乙醇)，最后所得蛋白产物保存于_70°C。 分析hnRNP A2*解开DNA四链体结构20nM浓度的5’端标记了作为供体的荧光素和3’端标记了作为受体的四甲基罗丹明荧光染料的GGG (TTAGGG)3寡聚核苷酸链分别与200nM的hnRNP A2*蛋白或是I μ M互补 配对的核酸序列CCC(TAACCC)3在含150mM浓度氯化钾的pH8. O的TE缓冲液中混合。之后在25°C，5nM狭缝下以480nm激发记录515nm处荧光发射，检测在加入hnRNPA2*蛋白或是互补配对DNA链后DNA四链体结构解开的动态变化。在大鼠，小鼠和人细胞中聚合酶链式反应扩增hnRNP A2*基因聚合酶链式反应是在一个25 μ I的体系中进行，以poly (T)为引物逆转录0.2yg大鼠BRL-3A细胞，人海拉(HeLa)细胞，小鼠肝脏细胞的RNA得到cDNA。扩增反应先是在94°C预变性处理2分钟，然后进行94°C 30s ；62°C 30s ；72°C 30s循环。大鼠细胞扩增29个循环，人和小鼠细胞扩增32个循环。端粒酶被hnRNP A2*蛋白拖拽(pull-down)实验端粒酶拖拽(pull-down)实验是按照文献(EversoleA, Maizels N(2000) Invitro properties of the conserved mammalian protein hnRNP D suggest a role intelomere maintenance. Mol Cell Biol 20:5425-5432.)所描述方法改进后进行。IO6 个RL-3A细胞沉淀在100 μ I CHAPS溶液中裂解，CHAPS溶液的成分为0. 5%3_[ (3-胆固醇氨丙基)二甲基氨基]-I-丙磺酸，IOmM三羟甲基氨基甲烷，pH 8.0，ImM氯化镁，0. ImM苯甲基磺酰氟化物。30 μ g的重组含His6标签的hnRNP A2*蛋白被固定在镍珠上，然后用1%牛血清蛋白在4°C做封闭处理，再用冷的CHAPS溶液洗涤两次，最后与100 μ I的细胞裂解物和100 μ I的CHAPS溶液在4°C下孵育2小时。孵育结束之后，用冷的CHAPS溶液洗涤镍珠三次，再用来检测端粒酶活性。对照实验采用未包被的镍珠拖拽的端粒酶或用200 μ g/mlRNase A室温下处理30分钟的细胞裂解物。端粒的限制性片段长度测量按照文献(ZhaoY, Sfeir AJ, Zou Y, Buseman CM, Chow TT, et al. (2009) Telomereextension occurs at most chromosome ends and is uncoupled from fill-in in humancancer cells. Cell 138:463-475.)介绍的方法进行端粒的限制性片段平均长度测量。用干扰RNA敲除大鼠细胞中的TERT两个能与大鼠TERT序列形成双链配对的短RNA序列GCCAGCATGTTAGGAAGAA作为干扰RNA (由RiboBio Co. , Ltd (Guangzhou, China)公司提供)。另外用非革巴向的RNA短链作对照。在6孔细胞培养板中盖玻片上生长的细胞用含50nM的干扰RNA的2mL含Lipofectamine 2000的培养基与之孵育，之后用免疫荧光方法检测TERT蛋白的表达水平，实验中用到的一级抗体抗TERT (D-16)抗体是由Santa Cruz Co.，Ltd提供,FITC标记的驴子抗山羊二级抗体是由Protein Tech Group, Inc提供。实验结果hnRNP A2*，一种来自细胞核基质的单链端粒DNA结合蛋白的鉴定。本发明制备了细胞核基质的蛋白，通过亲和纯化分离出与单链端粒DNA特异性结合的蛋白，并将它们进行了 SDS-PAGE电泳分离(图1A，左)。使用32P标记的单链(TTAGGG)3，Southwestern印迹法证实了它们对端粒DNA的结合活性(图1A，右)。本发明切出了丰度最高的，分子量为28kd处的条带，使用MALDI-T0F质谱分析鉴定出了九条胰蛋白酶肽(表I)。这九条肽链与hnRNP配对，八条位于N端半部，另一条则更靠前C端(图1B)。由于这些肽链的跨度大于28kD，本发明推测这一蛋白可能是hnRNP A2(36kD)的一个缺失了几个外显子的剪接变体。本发明使用了一种发明人新建立的“外显子排除逆转录-聚合酶链式反应”(exon exclusive RT-PCR)(Wang F, Zhao Y, Hao YH, Tan Z (2008)Identification of low-abundance alternativelyspliced mRNA variants by exon exclusive reverse transcriptase polymerase chainreaction. Anal Biochem 383:307-310)方法来选择性扩增这种变体(图1C)。随后的测序鉴定出这是hnRNP A2的一种外显子7-9被剪切掉的新异构体(图1D)。它是存在于大鼠，小鼠，人细胞中的一种保守性蛋白(图1E)。表I. MALDI-T0F mass spectrometry of TTIP.
权利要求
1.一种hnRNP A2*蛋白质，其特征在于，所述蛋白质包含有SEQ ID NO. I所示的氨基酸序列的蛋白质、蛋白质片段、蛋白质的类似物或衍生物。
2.根据权利要求I所述的蛋白质，其特征在于，所述的蛋白质片段、类似物或衍生物的氨基酸序列具有与SEQ ID NO. I所示的氨基酸序列至少95%的相同性。
3.根据权利要求2所述的蛋白质，其特征在于，所述蛋白质包含具有SEQID NO. I所示的氨基酸序列的蛋白质。
4.一种核酸，其特征在于，编码具有SEQ ID NO. I所不的氣基酸序列的蛋白质、蛋白质片段、蛋白质的类似物或衍生物的核酸。
5.根据权利要求4所述的核酸，其特征在于，所述核酸包含编码具有SEQID NO. I所示的氨基酸序列的核酸。
6.根据权利要求4所述的核酸，其特征在于，所述核酸包含有SEQIDNO. 2中的1-762位的序列。
7.一种如权利要求1-3任一所述的hnRNP A2*蛋白质的用途，其特征在于，所述hnRNPA2*蛋白质用于解开端粒G-四链体，促进端粒酶对端粒的延长。
8.根据权利要求7所述的用途，其特征在于，所述hnRNPA2*蛋白质能够识别端粒5’ -TAGGGTTAGG-3’的核酸序列，hnRNP A2*蛋白质与端粒DNA结合后，解开端粒G-四链体的结构，并暴露出5’-GTTAG-3’的末端，所述5’-GTTAG-3’能和脊椎动物端粒酶RNA模板5’ -CUAAC-3’配对，使端粒酶对端粒进行延长，维持端粒长度。
全文摘要
本发明涉及一种hnRNP A2*蛋白质、编码该蛋白的核酸及用途，属于生物领域，本发明hnRNP A2*蛋白质包含有SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列的蛋白质、蛋白质片段、蛋白质的类似物或衍生物。本发明hnRNP A2*蛋白质能主动解开端粒G-四链体，在端粒3'末端结合最小结合位点，并暴露出一个可以与端粒酶RNA模板配对的5个核苷酸尾巴，促进端粒酶对端粒的延长，进而维持细胞的分裂潜能，改善和促进细胞扩增，满足细胞工程和治疗的需要。
文档编号C07K14/47GK102887950SQ20121038313
公开日2013年1月23日 申请日期2012年10月10日 优先权日2012年10月10日
发明者谭铮, 赵勇, 王峰, 郝玉华 申请人:中国科学院动物研究所