一种干细胞快速冷冻方法及其使用的冷冻液的制作方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及生物技术领域，尤其涉及一种干细胞快速冷冻的方法及其使用的冷冻 液。
【背景技术】
[0002] 现有的干细胞冷冻方法通常是采用慢速冷冻法，也就是依靠程序式降温仪进行程 序降温，慢速冷冻，这个冻存过程会显著改变细胞的热力学、化学和物理环境，并伴随造成 生物性损伤，采用这种方法即使干细胞成功复苏但是其全能性也会受损害。
[0003] 近几年随着科学技术的发展，玻璃化冷冻因为在降温冷冻过程中不形成冰晶而受 到大家的关注。玻璃化是指液体转变为非晶态（玻璃态）的固化过程。玻璃态固体分子之 间的关系和液态无明显区别，在降温冷冻过程中不形成冰晶，细胞结构不会受到破坏从而 细胞得以存活，是一种理想的冷冻保存途径。
[0004] 目前，在干细胞的玻璃化冷冻领域，很多企业和研发人员主要关注冷冻液，而对于 干细胞的快速冷冻方法关注很少，实际上，干细胞经过玻璃化冷冻后复苏的存活率除了与 冷冻液有很大的关系之外，其与整个干细胞玻璃化冷冻和复苏的方法也有很大的关系；现 有本技术领域使用的干细胞玻璃化冷冻的方法与程序降温冷冻的方法相比，复苏后干细胞 的存活率已有很大的提高，但是对于一些数量极少的干细胞，复苏存活率还不够，使其在后 续使用复苏后的干细胞时因为数量小，也起不到很好的作用。
【发明内容】
[0005] 针对以上技术问题，本发明提供了一种干细胞快速冷冻方法及其使用的冷冻液， 进一步提高了干细胞经过玻璃化冷冻后的复苏存活率。
[0006] 对比，本发明提供了一种干细胞快速冷冻的方法，主要包括以下步骤：
[0007] 步骤A :将干细胞在36~39 °C预热的冷冻基础液中平衡1~5分钟；让干细胞与 冷冻基础液充分接触。
[0008] 步骤B :将干细胞转至36~39 °C预热的1号冷冻液中平衡2~5分钟；
[0009] 步骤C :将干细胞转至36~39°C预热的2号冷冻液中平衡20~60s后，提取含有 干细胞的混合液转移到载体管中；
[0010] 步骤D :将装载了干细胞的载体管进行玻璃化冷冻：将装载了干细胞的载体管保 持水平状态靠近液氮蒸汽层至距离液氮液面5~10_，将载体管以载体管任一端为圆心向 液氮液面进行旋转至竖直于液氮液面，并使载体管中装载了细胞的部分浸入到液氮中，旋 转时间不大于5s ;
[0011] 其中，所述1号冷冻液和2号冷冻液均为包含相同冷冻基础液的冷冻液，所述1号 冷冻液中冷冻基础液的浓度大于所述2号冷冻液中冷冻基础液的浓度，即所述1号冷冻液 中其他物质的浓度小于所述2号冷冻液中其他物质的浓度，这样，干细胞在1号冷冻液中平 衡后，转移到浓度较高的2号冷冻液中平衡，逐步适应和平衡，这个过程更利于使干细胞中 的水分子游离出来进入到冷冻液中，在后续干细胞的玻璃化冷冻时，减少对干细胞的损害， 更好的提高干细胞经过玻璃化冷冻后的复苏存活率。
[0012] 所述冷冻基础液可以采用现有技术中已知的预冻液，所述1号冷冻液和2号冷冻 液可以采用现有技术中已知的冷冻液，满足1号冷冻液中冷冻基础液的浓度大于2号冷冻 液中冷冻基础液的浓度即可；可以为1号冷冻液和2号冷冻液中的组成物质相同，只是配比 不同，1号冷冻液中冷冻基础液的浓度大于2号冷冻液中冷冻基础液的浓度，1号冷冻液中 其他物质浓度小于2号冷冻液中其他物质的浓度。
[0013] 所述步骤A中，冷冻基础液的用量为每个干细胞群不小于5 y L ;所述步骤B中，1 号冷冻液的用量为每个干细胞群不小于5 y L ;所述步骤C中，2号冷冻液的用量为每个干 细胞群不小于10 U L。较优的，所述冷冻基础液的用量为每个干细胞群5~25 y L，所述1 号冷冻液的用量为每个干细胞群10 y L~50 y L ;所述2号冷冻液的用量为每个干细胞群 10 y L ~100 y L0
[0014] 所述步骤D中将载体管以载体管任一端为圆心向液氮液面进行旋转时，优选以载 体管口径较大的一端为圆心向液氮液面进行旋转；进一步优化，载体管为OPS，以大口径端 为圆心向液氮液面进行旋转。
[0015] 所述载体管较优为一端为毛细管开口的麦管，这样便于干细胞快速的载入到载体 管中。进一步优化，所述载体管为OPS。
[0016] 上述步骤，较优在环境温度为25~27度下操作。
[0017] 采用上述技术方案，将干细胞在冷冻基础液、1号冷冻液和2号冷冻液进行分步平 衡，使干细胞与冷冻液之间逐渐缓慢平衡，缩小两者之间的浓度差，能更好的保护干细胞， 使其尽可能的减少损害；采用步骤D的方法让装载了干细胞的载体管旋转，使其先接触液 氮蒸汽，然后再渐渐的接触液氮液面，直至完全浸入到液氮中，让干细胞逐渐适应低温的液 氮环境，减少对干细胞的损害，有利于提高干细胞经过玻璃化冷冻后的复苏存活率。
[0018] 作为本发明的进一步改进，所述步骤D中，将载体管以载体管任一端为圆心向液 氮液面进行旋转时，先旋转至载体管与水平面夹角为30~45度，停留0. 5~2s，然后旋 转成垂直于液氮液面。采用此技术方案，先将装载了干细胞的载体管旋转至更接近液氮液 面的状态，在温度更低的液氮蒸汽中停留〇. 5~2s，逐步适应低温环境，然后再旋转直到浸 入到液氮中，再适应更低温度的液氮，采用这种阶梯式的逐渐适应液氮，减少对干细胞的损 害，更好的提高干细胞经过玻璃化冷冻后的复苏存活率。
[0019] 作为本发明的进一步改进，所述步骤D中，将载体管以载体管任一端为圆心向液 氮液面进行旋转时，先旋转至载体管与水平面夹角为30~45度，停留0. 5~I. 5s，然后继 续旋转至与水平面夹角60~70度，停留0. 5~I. 5s，最后旋转成垂直于液氮液面。采用更 进一步的阶梯式旋转，逐渐适应液氮，减少了对干细胞的损害，更好的提高干细胞经过玻璃 化冷冻后的复苏存活率。
[0020] 作为本发明的进一步改进，所述步骤D，载体管中装载了细胞的部分浸入到液氮中 后，将载体管在液氮中保持2~5s，然后将载体管沉入到液氮中保存。较优的，将载体管在 液氮中保持2~3s。采用此技术方案，可以更进一步的适应液氮环境，提高降温速度，减少 接触液氮后与液氮温度平衡的时间，达到快速玻璃化的目的，更好的保护干细胞，提高干细 胞经过玻璃化冷冻后的复苏存活率，使复苏后干细胞全能性不受影响。
[0021] 作为本发明的进一步改进，所述步骤D，载体管中装载了细胞的部分浸入到液氮中 后，将载体管在液氮中划动2~5s，然后将载体管沉入到液氮中保存。较优的，将载体管在 液氮中划动2~3s。采用此技术方案，可以更进一步的适应液氮环境，提高降温速度，减少 接触液氮后与液氮温度平衡的时间，达到快速玻璃化的目的，更好的保护干细胞，提高干细 胞经过玻璃化冷冻后的复苏存活率，使复苏后干细胞全能性不受影响。
[0022] 作为本发明的进一步改进，还包括步骤E :将载体管密封，然后沉入到液氮中保 存。采用此技术方案，可以避免干细胞在冷冻保存时受到污染，更好的冷冻保存干细胞；较 优的，可将载体管装入到保护管中密封，然后沉入到液氮中保存。
[0023] 作为本发明的进一步改进，所述步骤B中，将干细胞转至1号冷冻液平衡时，将干 细胞放在1号冷冻液的液面或液滴顶部，让干细胞自然下沉。采用此技术方案，让干细胞自 然下沉、慢慢地接触冷冻液，减少对干细胞的刺激，更有利于保护干细胞，提高干细胞经过 玻璃化冷冻后的复苏存活率，使复苏后干细胞全能性不受影响。
[0024] 作为本发明的进一步改进，所述步骤C中，将干细胞转至2号冷冻液中进行分步平 衡，所述2号冷冻液分成第一 2号冷冻液和第二2号冷冻液，先将干细胞转至第一 2号冷冻 液中混合，第一混合时间为10~60s ;然后将干细胞转至第二2号冷冻液中混合，第二混合 时间为10~60s。采用此技术方案，使干细胞在冷冻液中逐步平衡，使干细胞的水分子进一 步游离出来进入到冷冻液中，使得在后续干细胞的快速玻璃化冷冻中，不易形成冰晶，更好 的保护干细胞，提高干细胞经过玻璃化冷冻后的复苏存活率，并使复苏后干细胞全能性不 受影响。其中，所述第