合液转移到冷冻管中；
[0072] 上述步骤A、步骤B和步骤C均在25~27度的室温环境下进行。
[0073] 步骤D :将装载了干细胞的冷冻管保持水平状态靠近液氮蒸汽层，至距离液氮液 面5~10mm，将冷冻管以冷冻管的大口径端为圆心向液氮液面进行旋转，如图1所示，先旋 转至冷冻管与水平面夹角为30~45度处，停留0. 5~Is ;然后继续旋转至与水平面夹角 60~70度，停留0. 5~ls，最后旋转成垂直于液氮液面，并使装载了细胞的冷冻管小口径 端浸入到液氮中，将冷冻管在液氮中划动2~3s ;
[0074] 步骤E :将冷冻管装入到保护管中，将保护管的管口用密封钳进行加热密封，然后 沉入到液氮中保存。
[0075] (2)干细胞复苏过程：
[0076] 复苏液准备：
[0077] 本例中复苏液包括复苏基础液、1号复苏试剂和2号复苏试剂；
[0078]所述复苏基础液包含的组分及其体积含量为：血清替代补充液15%，含有0. 22g/ L 丙酮酸钠（Sodium pyruvate)和 0.0461g/L 左旋谷氨酰胺（L-Glutamin)的 Hepes_TCM199 缓冲液85% ;
[0079] 1号复苏试剂包含的组分及其体积含量为：0. 2mol/L蔗糖的基础液；
[0080] 2号复苏试剂包含的组分及其体积含量为：0. lmol/L蔗糖的基础液；
[0081] 干细胞复苏操作包括以下步骤：
[0082] 步骤A):预热试剂，将2号复苏试剂预热达到25_27°C，注入到四孔板的孔2中，得 到2号复苏试剂A ;然后将预热达到25-27°C的复苏基础液注入到四孔板的孔3和孔4中， 得到复苏基础液B和复苏基础液C，四孔板的孔1空置；
[0083] 步骤B):将1号复苏试剂保持密封进行预热，并将培养装置预热，预热温度均为 36~39度，预热时间60min ;将预热好的试剂注入到预热好的培养装置中，并将装好试剂的 培养装置放在显微镜下；
[0084] 步骤C):取出载体管，进行复温；
[0085] 将保护管从液氮中取出，剪开密封端，将冷冻管取出；然后将冷冻管含有细胞的的 小口径端置于1号复苏试剂上方2s，然后以相对于水平面20°至30°的角度浸入到1号复 苏试剂中，并使冷冻管中含有细胞的部分完全浸没到1号复苏试剂中；上述整个浸入操作 在立体显微镜下操作；
[0086] 步骤D):取出载体管中的细胞；
[0087] 步骤C完成后，冷冻管中的玻璃化的物质融化后，培养皿中的试剂倒流进入冷冻 管中，此时，将冷冻管的大口径端堵住，冷冻管里的溶液就从冷冻管中流入到装有1号复苏 试剂的培养皿中；或者采用移液装置从冷冻管的大口径端打入空气排除含有干细胞的溶 液；
[0088] 步骤E):进行细胞恢复；
[0089] 将干细胞转至四孔板的2号复苏试剂A中，停留1分钟；
[0090] 然后将干细胞转至复苏基础液B中，停留5分钟；
[0091] 再将干细胞转至复苏基础液C中，停留5分钟；
[0092] 最后将干细胞放入到新鲜的培养基中。所述培养基为常规用于细胞培养的培养 基。
[0093] 按照上述方法将16批次状态良好的干细胞分别进行冷冻，每个批次设置4个平行 试验；并按照上述的复苏方法对各批次的冷冻干细胞进行复苏，然后检查干细胞的存活情 况，对数据进行统计，详见表1。
[0094] 同时，设置了对照组，对照组采用现有技术常规的冷冻液和冷冻方法进行冷冻，并 对复苏后的干细胞存活情况进行统计，详见表1。
[0095] 表1实施例2和对照组的干细胞经冷冻后复苏后的存活情况
【主权项】
1. 一种干细胞快速冷冻方法，其特征在于，包括以下步骤： 步骤A :将干细胞在36~39°C预热的冷冻基础液中平衡1~5分钟； 步骤B :将干细胞转至36~39°C预热的1号冷冻液中平衡2~5分钟； 步骤C :将干细胞转至36~39°C预热的2号冷冻液中平衡20~60s后，提取含有干细胞的 混合液转移到载体管中； 步骤D :将装载了干细胞的载体管保持水平状态靠近液氮蒸汽层，至距离液氮液面 5~10mm，将载体管以载体管任一端为圆心向液氮液面进行旋转至竖直于液氮液面，并使载 体管中装载了细胞的部分浸入到液氮中，旋转时间不大于5s ; 其中，所述1号冷冻液中冷冻基础液的浓度大于所述2号冷冻液中冷冻基础液的浓度。
2. 根据权利要求1所述的干细胞快速冷冻方法，其特征在于：所述步骤D中， 将载体管以载体管任一端为圆心向液氮液面进行旋转时，先旋转至载体管与水平面夹 角为30~45度，停留0. 5~2s，然后旋转成垂直于液氮液面。
3. 根据权利要求1所述的干细胞快速冷方法，其特征在于：所述步骤D中，将载体管以 载体管任一端为圆心向液氮液面进行旋转时，先旋转至载体管与水平面夹角为30~45度， 停留0. 5~1. 5s，然后继续旋转至与水平面夹角60~70度，停留0. 5~1. 5s，最后旋转成垂直于 液氮液面。
4. 根据权利要求1至3任意一项所述的干细胞快速冷冻方法，其特征在于：所述步骤 D的载体管中装载了细胞的部分浸入到液氮中后，将载体管在液氮中保持2~5s，然后将载 体管沉入到液氮中保存。
5. 根据权利要求4所述的干细胞快速冷冻方法，其特征在于：所述步骤D的载体管中 装载了细胞的部分浸入到液氮中后，将载体管在液氮中划动2~5s，然后将载体管沉入到液 氮中保存。
6. 根据权利要求1至3任意一项所述的干细胞快速冷冻方法，其特征在于，还包括步 骤E :将载体管密封，然后沉入到液氮中保存。
7. 根据权利要求1所述的干细胞快速冷冻方法，其特征在于：所述步骤B中，将干细胞 转至1号冷冻液平衡时，将干细胞放在1号冷冻液的液面或液滴顶部，让干细胞自然下沉。
8. 根据权利要求1至3任意一项所述的干细胞快速冷冻方法，其特征在于：所述步骤 C中，将干细胞转至2号冷冻液中进行分步平衡，所述2号冷冻液分成第一 2号冷冻液和第 二2号冷冻液，先将干细胞转至第一 2号冷冻液中混合，第一混合时间为10~60s ;然后将干 细胞转至第二2号冷冻液中混合，第二混合时间为10~60s。
9. 根据权利要求8所述的干细胞快速冷冻方法，其特征在于：所述第一混合时间为 15~25s，所述第二混合时间为15~30s。
10. -种如权利要求1~9任意一项所述干细胞快速冷冻方法中使用的冷冻液，其特征 在于：所述冷冻液包括冷冻基础液、1号冷冻液和2号冷冻液；所述冷冻基础液包含的组分 及其体积含量为：血清替代补充液15-25%，Ifepes-TCM199缓冲液75-85% ; 所述1号冷冻液包含的组分及其体积含量为：乙二醇5-15%、二甲基亚砜5-15%和冷冻 基础液75-85% ; 所述2号冷冻液包含的组分及其体积含量为：乙二醇15-25%、二甲基亚砜15-25%和含 有0? 5mol/L蔗糖的冷冻基础液55-65%。
【专利摘要】本发明提供了一种干细胞快速冷冻方法及其使用的冷冻液，所述干细胞快速冷冻方法包括以下步骤：将干细胞在冷冻基础液中平衡；将干细胞转至1号冷冻液中平衡；将干细胞转至2号冷冻液中平衡后，将干细胞转移到载体管中；将载体管保持水平状态靠近液氮蒸汽层，并以载体管任一端为圆心向液氮液面进行旋转至竖直于液氮液面，使载体管中装载了细胞的部分浸入到液氮中。本发明的技术方案能够在进行快速玻璃化冷冻时更好地保护干细胞，有效地提高干细胞经过玻璃化冷冻后的复苏存活率，并且保持冷冻复苏后干细胞的生长分化和表达能力等全能性不受影响；特别是对于一些很敏感的干细胞，复苏存活率可以提高到95%以上。
【IPC分类】A01N1-02
【公开号】CN104738028
【申请号】CN201510112445
【发明人】林小贞, 吴洁, 常海龙, 咖博·瓦吉塔
【申请人】深圳普若赛斯生物科技有限公司
【公开日】2015年7月1日
【申请日】2015年3月13日