一种北冬虫夏草的规模化培育方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于真菌培养技术领域，具体涉及一种北冬虫夏草的规模化培育方法。
【背景技术】
[0002] 北冬虫夏草，也叫蛹虫草或踊虫草、蛹草，是一种久负盛名的食、药用真菌，含有虫 草酸（D~甘露醇）、虫草素（3'~脱氧腺苷）、虫草多糖和超氧化物歧化酶（SOD)等特殊物 质，据《本草纲目拾遗》称北冬虫夏草能治百虚百损，有补肺益肾之功效。北冬虫夏草除对 多种疾病具有显著疗效外，还有优良的滋补作用，并有抗菌、抗病毒、抗癌、抗疲劳、抗衰老 等特殊功效，已越来越受到国内外研宄者的重视和消费者的青睐。在我国已有的70多个虫 草品种中，研宄最为深入的是北冬虫夏草。
[0003] 蛹虫草中富含虫草酸、虫草素、虫草多糖和SOD酶等多种生物活性物质。虫草酸 (甘露醇）有软化血管，改善微循环，具有降血脂、镇咳、祛痰、平喘的作用。可以显著地降 低颅压，促进机体新陈代谢，因而使脑溢血和脑血栓病症得到缓解。虫草酸是一种具有抗菌 活性的核苷类物质：对核多聚腺苦酸聚合酶有很强的抑制作用。在DNA转录mRNA过程中使 mRNA成熟障碍，抑制癌细胞的生长。虫草素是一种抗菌、抗癌的活性物质，具有抗生和抑制 细胞分裂的作用。对人体的内分泌系统、神经系统有调节作用。虫草多糖是一种高度分枝 的半乳甘露聚糖，它能促进淋巴细胞转化，提高血清IgG的抗体含量和机体的免疫功能，增 强机体自身抗癌抑癌的能力，为免疫调节剂。
[0004] SOD酶（超氧化物歧化酶）可以消除机体内超氧自由基，具有抗衰老、抗癌抑癌的 作用。
[0005] 冬虫夏草是一种传统的名贵滋补中药材，有调节免疫系统功能，和抗肿瘤、抗疲劳 等多种功能。由于野生冬虫夏草分布地区狭窄、自然寄生率低、对生活环境条件要求苛刻， 所以本身资源比较有限。近年来又由于冬虫夏草主产地生态环境遭到人为严重破坏，大量 盲目不合理采挖致使资源日趋减少，产量逐年下降。冬虫夏草可以药食两用，人们不断发现 其新的药理作用，所以人们对它的需要倍增，价格逐年上涨。目前市场上一等冬虫夏草每 公斤高达30万元左右，许多人望而却步。北冬虫夏草虽然药效只有冬虫夏草十分之一，但 每公斤价格只有冬虫夏草百分之一是冬虫夏草最理想的代替品。为了满足市场的需求，目 前许多地区如吉林、辽宁、山东、江苏、河南等省都相继开展了对北冬虫夏草的研宄、栽培工 作，但都达不到规模化栽培技术要求。发明的目的是提供一整套规模化生产北冬虫夏草的 培育方法，具有成本低、僵化率高、出草齐、生产周期短的优点和特点。
【发明内容】
[0006] 本发明针对目前人工栽培北冬虫夏草存在的生产技术缺陷，提供了一整套规模化 生产北冬虫夏草先进的、科学的栽培北冬虫夏草技术和方法，通过人工采集野生北冬虫夏 草，通过分离、提纯、接种、培养等，培育获得北冬虫夏草新个体。
[0007] 本发明具体通过以下技术方案实现：
[0008] -种北冬虫夏草的规模化培育方法，包括以下步骤：
[0009] 步骤1北冬虫夏草一级、二级母种斜面培养
[0010] 步骤I. 1配置培养基，培养基配方为：土豆200g、琼脂20g、柞蚕蛹100g、葡萄糖 20g、蛋白胨8g、磷酸二氢钾I. 5g、硫酸镁0. 75g，1000毫升水；
[0011] 步骤1. 2采集野生北冬虫夏草用质量浓度0. 1 %的汞溶液消毒，无菌水清洗，取其 内部组织1立方毫米的小块移接至培养基斜面，放入20°C的恒温箱中培养15天即得北冬虫 夏草一级母种斜面；
[0012] 步骤1. 3选择僵化率高、出草整齐的一级母种斜面试管再进行扩大培养，得二级 母种斜面。
[0013] 步骤2北冬虫夏草液体菌种的制作与培养
[0014] 步骤2. 1配置培养基，按质量分数培养基配方为：活柞蚕蛹10%、葡萄糖1%、蛋白 胨1%、速溶奶粉1%、磷酸二氢钾0. 15%，硫酸镁0. 075g，1000ml水，1只鸡蛋清；
[0015] 步骤2. 2接种二级母种，在21°C恒温箱内静止培养24h后，用150r/min往复式摇 床进行振荡培养96h后，选取合格菌种。
[0016] 步骤3注射接种
[0017]选取蚕蛹在发酵终了前Id进行注射接种，注入菌种0. 08~0. 15ml，送发菌室内发 菌。
[0018] 步骤4菌丝培养
[0019] 步骤4. 1低温避光环境下培养，温度前3d控制为16°C，3d~8d控制为18°C，湿度 60%以上；
[0020] 步骤4. 2将僵化好的蚕蛹21~22°C避光条件下培养，促使菌丝后熟，转向生殖生 长阶段。
[0021] 步骤5诱导原基形成与出草管理
[0022] 步骤5. 1将生殖生长阶段的僵蛹的三分之一处划刀口，划口后的僵蛹不立即见 光，在温度21~22°C，湿度80%以上的暗室培养中3天，待僵蛹的环节及划口处长出白色 菌丝，再装瓶见光出草；
[0023] 步骤5. 2将菌丝营养生长结束的蚕蛹，用2g/L臭氧水蛹体表面消毒lOmin，控净表 面自由水后在无菌室上瓶，送到出草室培养出草；
[0024]步骤5. 3待原基形成后温度控制在19~22°C，蛹虫草长到Icm高时，将室内的相 对湿度调高至75 %~80 %，经过15~17d，蛹虫草生长高度接近瓶口即可采收；
[0025] 本发明步骤I. 1所述的培养基通过以下方法制备：将土豆块和柞蚕蛹加水煮沸至 土豆软而不烂时，滤去土豆残渣，在汁液中加入剩余组分并搅拌均匀，加热至琼脂完全溶化 后分装试管，培养基的量与试管的体积比是1 : 5,高压锅灭菌，加热到压力达到0.5Kg/m2 时，排出冷空气，然后继续加热至125°C时保压35分钟后停止加热降温，排气，并趁热把试 管摆成斜面，得固体试管斜面备用。
[0026] 本发明所述的二级母种斜面的培养基与一级母种斜面的培养基相同。
[0027]本发明步骤2. 1所述的培养基通过以下方法制备：将活蚕蛹手撕开放入1000 ml 冷水中，沸煮25min，收集滤液，开水定溶1000ml，依次加入硫酸镁、磷酸二氢钾、蛋白 胨和奶粉，充分溶解后，冷却至30°C，加入泡沫鸡蛋清，充分搅拌均匀，高压灭菌器，在 0. 137Mpal25°C条件下灭菌20min，滤出澄清液，加入葡萄糖搅拌溶解后灭菌。
[0028] 本发明步骤2. 2所述的合格菌种标准为：菌液澄清不混浊，菌球多，形状一致，发 育齐一，晃动后浮起的菌球5min不下沉，经显微镜检查，无和虫草菌丝不一样的微生物。
[0029] 步骤3所述的发菌室在使用前3d用3%甲醛进行消毒，室外过道用1%消特灵水 洗刷封闭地面，发菌室的门窗用黑红布窗帘遮挡。
[0030] 本发明所述的生殖生长的标志为：菌龄达15~17d;蛹体和环节间膜处长出白色 菌丝；蛹顶由白色变成淡褐色。
[0031] 本发明的有益效果为：解决了现有人工栽培北冬虫夏草出现僵化率低、出草低、不 齐等的技术问题，本发明方法具有成本低、僵化率高、出草齐、生产周期短的优点和特点，便 于大规模推广使用，弥补了冬虫夏草由于资源有限、昂贵而出现的市场空白，具有实际的经 济和社会效益。
【具体实施方式】
[0032] 下面结合实施例对本发明做进一步的说明，以下所述，仅是对本发明的较佳实施 例而已，并非对本发明做其他形式的限制，任何熟悉本专业的技术人员可能利用上述揭示 的技术内容加以变更为同等变化的等效实施例。凡是未脱离本发明方案内容，依据本发明 的技术实质对以下实施例所做的任何简单修改或等同变化，均落在本发明的保护范围内。
[0033] 实施例1
[0034] 通过人工采集野生北冬虫夏草，通过分离、提纯、接种、培养等，培育获得北冬虫夏 草新个体。
[0035] 为了实现上述目的，本发明北冬虫夏草的培育方法，具体操作步骤如下：
[0036] -、北冬虫夏草一级、二级母种斜面培养与选择
[0037] 1?培养基配方：
[0038] 配制1000毫升水需要的材料；
[0039] 土豆200g、琼脂20g、柞蚕蛹100g、葡萄糖20g、蛋白胨8g、磷酸二氢钾I. 5g、硫酸 镁 0. 75g。
[0040] 2?配制方法：
[0041] 将洗净去皮的土豆切成骰子块和洗净的柞蚕蛹撕开加水1000 ml煮沸30分钟，至 土豆软而不烂时，用4层纱布滤去土豆残渣，取汁液于锅中加入琼脂20g、蛋白胨8g、葡萄糖 20g、磷酸二氢钾I. 5g、硫酸镁0. 75g并搅拌均匀，继续加热至琼脂完全溶化，趁热迅速分装 试管，每个试管装培养基的量与试管的体积比是1 : 5,装完后塞上棉塞，然后把试管每5支 或7支扎成一捆，用牛皮纸包好放入高压锅灭菌，加热到压力达到0. 5Kg/m2时，开排气阀， 排出冷空气，使指针回到0点，然后关上排气阀继续加热至125°C时保压35分钟后停止加热 降温，使指针回到〇点时再打开排气阀放气，5分钟后打开高压锅灭菌锅，并趁热把试管摆 成斜面，冷却后得固体试管斜面备用；
[0042] 3.菌种分离培养：
[0043] 将采集到野生北冬虫夏草清洗后用0. 1 %升汞溶液对其进行消毒3分钟处理，再 用无菌水清除其表面的升汞。北冬虫夏草表面消毒处理后，用无菌刀片切去其子座的外层， 用接种刀切取其内部组织1立方毫米的小块迅速移接到试管斜面上，并迅速塞上棉塞，然 后放入20°C的恒温箱中培养15天左右即得北冬虫夏草一级母种斜面。
[0044] 4?见光选择能出虫草菌种
[0045] 将做好的北冬虫夏草一级母种斜面，在散射光下短时间感光，选留全管变黄快且 色深的试管菌株直接进行小区僵化出草试验，再选留试管菌株部分变黄快、变黄深的分离 纯化，再进行见光选择，并做小区僵化出草试验。
[0046] 5.北冬虫夏草二级母种斜面的扩大培养：
[0047] 将小区僵化率高、出草齐一的一级母种斜面试管再进行扩大培养，得二级母种斜 面试管，二级母种斜面试管的培养基与一级母种斜面试管的培养基相同。
[0048] 二、北冬虫夏草液体菌种的制作与培养
[0049] 1 ?培养基配方：
[0050] 活柞蚕蛹10%、葡萄糖1%、蛋白胨1%、速溶奶粉1%、磷酸二氢钾0. 15%、硫酸镁 0. 075g、每1000 ml水放1只鸡蛋的清。
[0051] 2?培养基制作：
[0052] 取活蚕蛹100g，把每个蚕蛹用手撕开，放入1000 ml冷水中，煮沸后微沸保持 25min，用4层纱布过滤，弃去蛹澄留下滤液，用开水定溶1000ml。依次加入硫酸镁0. 75g， 磷酸二氢钾I. 5g，蛋白胨10g，奶粉10g，充分溶解。然后除沉：作好的液体培养基放在一旁 冷却，打一个鸡蛋清于烧杯中，用筷子搅成泡沫，当培养基冷却到30°C左右时，把鸡蛋清倒 入培养液中，充分搅拌均匀，装入2000ml三角瓶中，塞棉塞，加牛皮纸札紧瓶口，放入高压 灭菌器，用0. 137Mpa125°C保持20min。打开灭菌器用双层纱布将澄清液滤出，放入葡萄糖 IOg搅拌溶解。
[0053] 装瓶