藏药马尿泡自主发根体系的建立方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于植物生物技术领域，涉及藏药马尿泡自主发根体系的建立方法。
【背景技术】
[0002] 马尿泡（Przewalskia tangutica Maxim.)又名矮莨菪，唐古特马尿泡，是前科 (Solanaceae)马尿泡属植物，为我国青藏高原特有植物，也是特殊的单种成属的植物；生 长于海拔3200-5000米的高山砾石地及干旱草原。据《晶珠本草》及《藏药志》记载，它是 藏药中的常用药，其根和种子及全草均可做药用，具有镇痛、解痉、杀虫、消炎等药效，用于 胃肠痉挛疼痛、白喉、炭疽；外用疮疡，皮肤瘙痒。研宄发现，其体内高含量的托烷类生物碱 在治疗神经性疾病方面具有显著疗效，而东莨菪碱作为一些药物合成的重要中间原料同时 具有疗效好，副作用小的特点，也使得该化合物在国际市场上的需求增长很快，是莨菪碱的 10倍。因此，如何获得高产量的东莨菪碱一直是国内外研宄的热点。对高产碱植物进行研 宄开发无疑是有效途径之一。1984年，肖培根等，对茄科中的三分三，唐古特山莨菪，马尿泡 等54中植物的托烷类生物碱有效成分进行分析，结果发现藏药马尿泡中托烷类生物碱含 量高，可以直接作为工业生产该类药物的原料。
[0003] 伴随着马尿泡药用价值的发现，大量野生资源被挖掘，一方面造成了马尿泡野生 资源濒危，另一方面也造成高原地区脆弱的生态破坏。因此，了解马尿泡的高产碱的分子机 制，探索一条可持续高效生产托烷类生物碱的途径成为目前亟待解决的问题。
[0004] 目前，大量研宄表明，经发根农杆菌浸染植物外植体可以产生激素自主的毛状根， 毛状根与植物正常根相比具有激素自养、生长条件简单、生长迅速、次生代谢产物含量高且 稳定以及分化程度高、不易变异等优点，能够有效解决人们利用植物生产次生代谢产物的 问题。目前利用发根农杆菌浸染植物获得发状根的植物包含20个科40个属160多种植 物，多为双子叶植物其中转化频率较高的植物主要集中在茄科、菊科、十字花科以及旋花科 等。利用毛状根成功获得的次生代谢产物主要有皂苷、葱醌（Ko et al，1998)、莨菪烷生物 碱（mano et al, 1989)、天花粉蛋白（邱德有等，1996)、紫杉醇（黄遵锡等，1997)、青蒿 素（刘春朝等，1999)、生物碱（Trypsteen et al, 1991)、二猫类（Hu et al，1993)、挥发油 (Kennedy et al)等。也广泛应用于生产托烷类生物碱，如茄科植物中的天仙子、山莨菪、曼 陀罗等植物都建立了发根诱导和培养体系，但由于各种原因目前仍然没有用于工业生产。 利用发根农杆菌浸染马尿泡植物外植体，产生可在无激素培养基上自主生长的发状根，是 可持续利用马尿泡植物生产托烷类生物碱的有效途径，也是研宄马尿泡高产碱分子机制的 基础。
【发明内容】
[0005] 本发明的目的在于提供藏药马尿泡自主发根体系的建立方法，解决了目前马尿泡 植物根系生长慢的问题。
[0006] 本发明所采用的技术方案是按照以下步骤进行：
[0007] 步骤I :发根农杆菌的活化；将低温保存的发根农杆菌取出，在发根农杆菌培养基 平板上划线，然后放置在25°C的恒温培养箱培养48h，待长出菌斑时，挑取单菌落再次在发 根农杆菌培养基平板上划线，放置在25°C的恒温培养箱培养48h，待长出菌斑时，挑取单菌 落接种在含有30mL发根农杆菌液体培养基的三角瓶中，28°C，180rpm震荡培养12-15h，培 养至菌液吸光值浓度为OD6tltl= 0. 6-0. 8,然后将菌液转入50mL离心管中，6000r/min，离心 lOmin，用MS液体培养基重悬至OD = 0. 6,菌悬液备用；
[0008] 步骤2 :外植体的预培养；将生长15-20d左右的马尿泡种子无菌苗取出，切去种子 无菌苗根部和下胚轴以上部分，将切好的下胚轴转接至MS固体培养基中，放置于22°C生化 培养箱中暗培养48h，完成下胚轴的预培养阶段；
[0009] 步骤3 :发根农杆菌浸染及共培养；取出与预培养后的下胚轴，放置于灭菌的干净 的培养皿中，将菌悬液倒入培养皿中，期间不停震荡培养皿，浸染9-10min，然后将浸染后的 下胚轴取出，除去表面多余菌液，然后接种在MS固体培养基中，放置于28°C生化培养箱培 养 48h ;
[0010] 步骤4 :除菌培养；在无菌条件下，将完成共培养的下胚轴转接至含有500mg/L羧 苄青霉素的MS培养基中于22°C条件下进行暗培养，下胚轴伤口愈伤组织处产生白色不定 根。
[0011] 进一步，所述MS液体培养基配方为：
[0012] NH4NO3 41. 25g，KNO3 47. 50g，KH2PO4 4. 25g，溶于 300mL 蒸馏水中，定容至 500mL 吸取 20mL/L ;
[0013] CaCl2 · 2H20 22g，定容至 500mL，吸取 10mL/L ;
[0014] MgSO4 · 7H20 18. 50g，定容至 500mL，吸取 10mL/L ;
[0015] MnSO4 · 4H20 2230mg 或 MnSO4 · H2O 1690mg，ZnSO4 · 7H20 860mg，H3BO3 620mg，KI 83mg，NaMoO4 · 2H20 25mg，CuSO4 · 5H20 2. 5mg，CoCl2 · 6H20 2. 5mg，定容至 500ml，吸取 5mL/ L ；
[0016] 甘氨酸0· lg，烟酸硫胺素0· 005g，烟酸吡哆素0· 025g，烟酸0· 025g，定容至500mL， 吸取 lOmL/L ;
[0017] 肌醇 5g，定容至 500mL，吸取 lOmL/L ;
[0018] Na2-EDTA I. 865g，FeSO4 · 7H20 I. 390g，定容至 500mL，吸取 10mL/L。
[0019] 进一步，所述 MS 固体培养基配方为：NH4N0341. 25g，KN0347. 50g，KH2PO4 4. 25g，溶 于300mL蒸馏水中，定容至500mL吸取20mL/L ;
[0020] CaCl2 · 2H20 22g，定容至 500mL，吸取 10mL/L ;
[0021] MgSO4 · 7H20 18. 50g，定容至 500mL，吸取 lOmL/L ;
[0022] MnSO4 · 4H20 2230mg 或 MnSO4 · H2O 1690mg，ZnSO4 · 7H20 860mg，H3BO3 620mg，KI 83mg，NaMoO4 · 2H20 25mg，CuSO4 · 5H20 2. 5mg，CoCl2 · 6H20 2. 5mg，定容至 500ml，吸取 5mL/ L ；
[0023] 甘氨酸0· lg，烟酸硫胺素0· 005g，烟酸吡哆素0· 025g，烟酸0· 025g，定容至500mL， 吸取 lOmL/L ;
[0024] 肌醇 5g，定容至 500mL，吸取 lOmL/L ;
[0025] Na2-EDTA I. 865g，FeSO4 · 7H20 I. 390g，定容至 500mL，吸取 lOmL/L ;蔗糖 30g/L ; 琼脂7g/L。
[0026] 本发明的有益效果是研发了高产东莨菪碱的马尿泡转基因发根生物反应器。
【附图说明】
[0027] 图1是不同单克隆发根系在无激素 MS培养基上的筛选示意图；
[0028] 图2是马尿泡转基因毛状根RPtOl生长曲线示意图。
【具体实施方式】
[0029] 下面结合【具体实施方式】对本发明进行详细说明。
[0030] 本发明藏药马尿泡自主发根体系的建立方法步骤如下：
[0031] 第1步发根农杆菌的活化；在无菌条件下，将低温（_80°C )保存的发根农杆菌取 出，在YEB培养基平板上划线，然后放置在25