提高栽培烟与花烟草杂交亲和性和结籽率的方法
【技术领域】：
[0001] 本发明涉及一种提高栽培烟与花烟草杂交亲和性和结籽率的方法，属农业生物技 术领域。
【背景技术】：
[0002] 植物种间远缘杂交可以在一定程度上打破物种间的界限，把两个物种经过长期进 化积累起来的有益性状重新组合，以形成新的产量、品质性状和对病、虫、寒、旱、涝等胁迫 的抗（耐）性等。远缘杂交在小麦、棉花、水稻和番茄等植物生产育种中已经发挥了重要作 用。但在许多作物的杂交育种组合中，种间遗传背景差异和生殖隔离常导致杂交不亲和。这 种现象也普遍存在于烟草属植物中，包括受精前杂交不亲和与受精后杂种不育、杂种不能 存活和杂种衰退，其中杂交不亲和包括柱头不亲和、花柱不亲和与胚囊不亲和。因此研究种 间杂交不协调的分子机制对提高杂交亲和性和推动烟草育种工作向前发展具有重要意义。 重复授粉、延迟授粉等授粉方法曾被运用于小麦、百合和番茄等植物的制种过程中，增加了 结实率。近年来，以灭活花粉囊、柱头、花柱研磨物为介质花粉的授粉技术也被大面积运用 于大批量烟草种子生产过程，大大节约了生产成本，提高了生产效率。
[0003] 碧冬烟亚属的花烟草（N. alata，η = 9)抗病性强，对野火病、白粉病和番茄斑痿 病等都有很好的抗性。前人曾用常规授粉方法试图将Ν. alata的优良性状引入栽培烟草 种，没有获得良好结果，并且对杂交不亲和发生的时间、部位和突破杂交不亲和的方法没有 系统研究。我们研究表明：早附〇〇七丨&仙七&匕&〇_(81&.)5寬3.2私(5侧_&加3]^&杂交 过程中，在母本花朵处于始开期授粉，N. alata花粉管生长受阻而停留在母本花柱基部距子 房0. 81 ±0.1 Ocm处，无法进入子房，更无法获得种子。研究一种可以促使野生烟N. alata 花粉管突破这一障碍的方法，对于充分利用携带重要抗性遗传资源的N. alata具有重要意 义，也可以进一步指导突破具有类似杂交不亲和障碍机制的研究。
【发明内容】
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[0004] 本发明的目的在于克服现有技术之不足，而提供一种提高栽培烟与花烟草杂交亲 和性和结籽率的方法。
[0005] 本发明通过调整授粉时间和添加柱头研磨物相结合，突破N. alata花粉管在母本 Nicotiana tabacum(gla.) S K326(简写为Nta (gla.)SK326)花柱基部阻碍，获得杂交种子 并提高杂种结籽率的方法。
[0006] 本发明的具体步骤如下：
[0007] 1、栽培烟即母本Nta(gla. )SK326花朵刚开放挂牌，挂牌时间定义为始开期，挂牌 后72h、96h和120h定义为始开期后的衰老阶段，在72h、96h和120h的3个时间段，用花烟 草即父本N. alata成熟花粉对母本柱头授粉；
[0008] 2、选栽培烟即母本Nta(gla.)SK326)始开期花朵，剥取雌蕊并剪取柱头，柱头在 室内自然晾干2天，将柱头粉碎为粉末，将花烟草即父本N. alata成熟花粉与柱头粉末按 1:5-1:50的重量比混合；
[0009] 3、用按1:5-1:50的重量比混合的花粉对栽培烟即母本Nta(gla. )SK326)始开期 72-120h后的花朵授粉，授粉后48h采样，通过胼胝质荧光统计生长进入子房的花粉管数目 和结籽率数据，比较花粉对各时间段杂交结籽率的影响。
[0010] 本发明的有益效果在于：操作简单，成本低，易于推广，为植物种间杂交种的获得 提供了参考的方法。
【具体实施方式】：
[0011] 实施例一：
[0012] 本方法的具体步骤如下：
[0013] 1、延迟授粉克服杂交不亲和
[0014] a.选栽培烟即母本Nta (gla. ) SK326)始开期花150朵并挂牌，从挂牌时开始计时 为始开期后〇h，在挂牌后72h、96h和120h分别对其中的50朵用花烟草即父本N. alata成 熟花粉对母本柱头授粉，授粉后用尼龙网袋套袋隔离；
[0015] b.授粉48h后取下尼龙网袋，剥取雌蕊，将其保存于FAA固定液中，4°C放置2h以 上；用NaoH软化120min，0. 1 %水溶性苯胺蓝染色2h以上，压片后在荧光显微镜观察花粉 管生长状况，统计25个雌蕊中花粉管生长阻碍部位。结果表明：120h后授粉有花粉管生长 进入子房的雌蕊数较72h和96h多，其中72h为6个，72h为11个，120h为20个；
[0016] c.授粉后30天，摘取不同时间段授粉的果实，果实取回后报纸包好，放于25°C 干燥培养箱中烘干待种子散出，称取2g各时间段所获种子播于土壤中，25°C温室萌发10 天，观察萌发的种子率，结果表明：始开期72h、96h和120h后授粉结籽率分别为0. 01%、 0· 03%和 0· 1%。
[0017] 2、杂交结籽率的提高
[0018] a.选栽培烟即母本Nta (gla. )SK326)始开期花50朵并挂牌，从挂牌时开始计时为 始开期后〇h，挂牌后120h记为始开期后120h ;
[0019] b.选栽培烟即母本Nta(gla.)SK326)始开期花朵，剥取雌蕊并剪取柱头，柱头在 室内自然晾干2天，将柱头粉碎为粉末，将花烟草即父本N. alata成熟花粉与柱头粉末按 1:5,1:10的重量比混合；
[0020] b.用按1:5,1:10的重量比混合的花粉对栽培烟即母本Nta (gla. )SK326)始开期 后120h的花朵授粉，后续处理同延迟授粉克服杂交不亲和步骤中的b、c步骤。结果表明： 1:5和1:10混合花粉在始开期120h后授粉，和始开期后120h直接用父本花粉授粉相比，有 花粉管生长进入子房的雌蕊数和生长进入子房的花粉管数目均增多，重量比1:5,1:10混 合花粉结籽率分别为〇. 9 %和1. 65%。
[0021] 实施例二：
[0022] 杂交结籽率的提高，始开期后120h延迟授粉的方法同实施例一，不同之处在于柱 头研磨物和父本的花粉比例。
[0023] a.选栽培烟即母本Nta(gla.)SK326)始开期花朵，剥取雌蕊并剪取柱头，柱头在 室内自然晾干2天，将柱头粉碎为粉末，将花烟草即父本N. alata成熟花粉与柱头粉末按 1:20和1:50的重量比混合；
[0024] b.用按1:20,1:50的重量比混合的花粉对栽培烟即母本Nta(gla. )SK326)始开期 后120h的花朵授粉，后续处理同实施例一中延迟授粉克服杂交不亲和步骤中的b、c步骤。 结果表明：1:5和1:10混合花粉在始开期120h后授粉，和始开期后120h直接用父本花粉 授粉相比，有花粉管生长进入子房的雌蕊数和生长进入子房的花粉管数目均增多，重量比 1:20,1:50混合花粉授粉后结籽率分别为1. 75%和1. 3%。
【主权项】
1. 一种提高栽培烟与花烟草杂交亲和性和结籽率的方法，其特征在于该方法的具体步 骤如下： a. 栽培烟即母本花朵刚开放挂牌，挂牌时间定义为始开期，挂牌后72h、96h和120h定 义为始开期后的衰老阶段，在72h、96h和120h的3个时间段，用花烟草即父本成熟花粉对 母本柱头授粉，通过胼胝质荧光统计生长进入子房的花粉管数目和结籽率数据，比较不同 时间段授粉对杂交亲和性的影响； b. 选栽培烟即母本始开期花朵，剥取雌蕊并剪取柱头，柱头在室内自然晾干2天，将柱 头粉碎为粉末，将花烟草即父本成熟花粉与柱头粉末按1:5-1:50的重量比混合； c. 用按1:5-1:50的重量比混合的花粉对栽培烟即母本始开期后120h的花朵授粉，授 粉后48h采样，通过胼胝质荧光统计生长进入子房的花粉管数目和结籽率数据，比较不同 比例的混合花粉对杂交结籽率的影响。
【专利摘要】提高栽培烟与花烟草杂交亲和性和结籽率的方法，属农业生物技术领域。方法为：母本花朵开放挂牌，挂牌时间为始开期，挂牌后72h、96h和120h为始开期后的衰老阶段，在这3个时间段，用父本成熟花粉对母本柱头授粉，授粉48h后采样，用胼胝质荧光统计花粉管数目和结籽率，比较授粉对杂交亲和性的影响；选母本始开期花朵，剥取雌蕊并剪取柱头，柱头在室内自然晾干2天后碎为粉末，将父本成熟花粉与柱头粉末按1:5-1:50的重量比混合；用混合的花粉对母本始开期后120h的花朵授粉，授粉48h后采样，用胼胝质荧光统计花粉管数目和结籽率，比较混合花粉对杂交结籽率的影响；栽培烟为母本，花烟草为父本。优点：操作简单，成本低，易推广，为植物种间杂交种的获得提供了参考。
【IPC分类】A01H1/02
【公开号】CN104996295
【申请号】CN201510449640
【发明人】陈穗云, 廖菊够, 李永平, 马文广
【申请人】云南大学
【公开日】2015年10月28日
【申请日】2015年7月28日