育苗池和入 水槽处的苗绳取回，重新放回光照培养箱中，用煮沸灭菌的消毒海水充入空气培养，培养条 件为溫度12°C，光强10-20ymolphotonsm-2s-l，光周期为12:12(L:D)。当抱子体培养至 3-5cm大小时，观察比较不同处理组苗绳上抱子体的形态特征。
[0024] 将育苗系统育苗池和入水槽处放置的苗绳W及烧杯中培养的苗绳上收集的海带 抱子体，每组30颗，采用CTAB的方法进行基因组的提取（提取方法参考Wang化Wang XL,LiDP,etal.Thegeneticanalysisandgermplasmidentificationofthe gametophytesofUndariapinnatifida(Phaeophyceae)withRAPDmethod[J].J.Appl. 化ycol.，2006, 18:801-9.文献记载）。参考报道的海带SSR引物并依据引物扩增情况选择 多态性高，扩增条带清晰的4对引物进行扩增。引物的具体信息见表1。20iiLPCR反应体 系，包含1化的DNA模板，8化d地20, 10化2Xmix缓冲液，0. 5化普通引物（lOyM)W 及0. 5iiL巧光引物（lOyM)。PCR扩增程序为，94°C预处理4分钟，94°C变性1分钟，，化 退火1分钟（表1)，72°C延伸1分钟，经历30个循环，72°C延伸10分钟，最终4°C保存。将 PCR扩增产物先用1%的琼脂糖进行检测，确定扩增成功后，采用ABI3730XL自动测序仪进 行毛细管电泳，利用软件GenemarkerV2. 2. 0读取等位基因进行分析，内标参照LIZ-500。 阳0巧]表1 :4对海带属SSR引物信息
[0026]
[0027] 实施例2
[0028] 2014年8月在我国山东省荣成市海带育苗企业开展了制冷水循环系统中品种混 杂的检测，将接种雌配子体克隆的苗绳放置在低溫循环水系统的育苗池和入水槽处，后期 收集苗绳上的后代抱子体，W孤雌生殖抱子体作为对照，进行了形态特征的比较。同时，采 用微卫星分析方法，采用4对SSR引物扩增，W亲本雌配子体作为参照，进行了后代抱子体 的基因型分析。表明，育苗池和入水槽处收集到的后代抱子体形态正常，运一抱子体群体中 除了具有亲本雌配子体的基因片段外，还检测到了外源基因片段，证实为外源的受精抱子 体。此项研究证实了在海带夏苗生产工艺中，共用的低溫循环水使用的确会造成品种混杂。 为防止品种混杂、退化现象的加剧，建议育苗企业建立独立的亲本维护系统，W维持品种的 优良性状。
【主权项】
1. 一种检测海带育苗中品种混杂的方法，其特征在于：将接种雌配子体克隆的苗绳分 别置于培养基或海带育苗制冷水循环系统内培养，置于培养基内获得孤雌生殖孢子体，海 带育苗制冷水循环系统内培养获得后代孢子体，检测制冷水循环系统内苗绳上的后代孢子 体形态特征以及基因型，与孤雌生殖孢子体进行比较，确定育苗过程中品种是否混杂。2. 按权利要求1所述检测海带育苗系统中品种混杂的方法，其特征在于：所述后代孢 子体是将接种雌配子体克隆的苗绳置于海带育苗制冷水循环系统内培养，使单克隆雌配子 体苗绳经历育苗系统内海带夏苗培育过程中的配子体发育阶段（卵子和精子排放以及后 续的受精过程），形成后代孢子体。3. 按权利要求1所述检测海带育苗系统中品种混杂的方法，其特征在于：将单克隆雌 配子体和育苗绳在低光条件下共同充气培养，直到雌配子体牢固附着于苗绳上，完成单克 隆雌配子体苗绳的接种；将接种有雌配子的苗绳培养直到配子体形成卵囊，完成单克隆雌 配子体苗绳的发育培养；而后将一部分苗绳置于育苗系统制冷水循环系统内，使单克隆雌 配子体苗绳经过海带夏苗培育过程中的配子体发育阶段（卵子和精子排放以及后续的受 精过程），形成后代孢子体，另一部分苗绳置于烧杯中培养，使单克隆雌配子体苗绳完成孤 雌生殖生活史，形成孤雌生殖孢子体；待两种苗绳上的孢子体长至3-5cm，检测制冷水系统 内苗绳上的后代孢子体的形态特征与基因型，与孤雌生殖孢子体的形态特征与基因型进行 比较，确定海带育苗制冷水系统内培育的海带品种是否混杂。4. 按权利要求3所述检测海带育苗中品种混杂的方法，其特征在于：营养生长的海 带单克隆雌配子体，采用高速打碎机破碎至3-10个细胞，将打碎的雌配子与育苗绳共同 充气培养，置于PES培养基中，于10-12°C，光强10-20ymolphotonsm-2s-1，光周期为 12:12(L:D)的条件下，直到雌配子体牢固附着于苗绳上，完成单克隆雌配子体苗绳的接种； 将上述接种有雌配子的苗绳置于PES培养基中，于10-12°C，光强50-60ymolphotonsm-2 s-1，光周期为12:12(L:D)的条件下，直到配子体形成卵囊，完成单克隆雌配子体苗绳的发 育培养。5. 按权利要求3所述检测海带育苗中品种混杂的方法，其特征在于：将一部分形成卵 囊的单克隆雌配子苗绳，在海带夏苗培育过程中配子体发育阶段，转移到生产育苗的制冷 水循环系统的入水槽和育苗池内，使单克隆雌配子体苗绳度过海带苗帘由配子体向孢子体 大规模转化阶段，形成后代孢子体，直至孢子体长度为3-5cm。6. 按权利要求3所述检测海带育苗中品种混杂的方法，其特征在于：将另一部分形 成卵囊的单克隆雌配子体苗绳，继续培养在烧杯中，置于PES培养基中，于10-12°C，光强 50_60iimolphotonsm-2s-1，光周期为12:12(L:D)的条件下，直到卵囊排卵，完成单克隆 雌配子体的孤雌生殖生活史，形成孤雌生殖孢子体，直至孢子体长度为3-5cm。7. 按权利要求5所述检测海带育苗中品种混杂的方法，其特征在于：所述入水槽地势 高于育苗池，使制冷水依据地势特点，从高处流向低处。8. 按权利要求3所述检测海带育苗中品种混杂的方法，其特征在于：所述育苗系统内 自然海水经过沙滤后，输入到降温池，降温后输入到冷水储存池，之后栗入到入水槽，顺势 流进育苗池，海水流经育苗池中的海带苗帘，汇集后经第二套过滤池再次输入到降温池降 温，之后进入育苗循环水系统中，再次使用。
【专利摘要】本发明涉及经济褐藻海带品种混杂领域，具体的说是一种检测海带夏苗制冷水工艺中品种混杂的方法。将接种雌配子体克隆的苗绳分别置于培养基或海带育苗制冷水循环系统内培养，置于培养基内获得孤雌生殖孢子体，海带育苗制冷水循环系统内培养获得后代孢子体，检测制冷水循环系统内苗绳上的后代孢子体形态特征以及基因型，与孤雌生殖孢子体进行比较，确定育苗过程中品种是否混杂。本检测方法的建立首次证实了在海带夏苗生产工艺中，共用的低温循环水使用的确会造成品种混杂。
【IPC分类】A01G33/00
【公开号】CN105210845
【申请号】CN201510726403
【发明人】李静, 逄少军, 单体锋
【申请人】中国科学院海洋研究所
【公开日】2016年1月6日
【申请日】2015年10月30日