一种大丽花脱毒苗的获取方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及一种大丽花脱毒苗的获取方法，具体涉及一种通过两次脱分化产生愈伤组织并将愈伤组织热处理后再分化、最终高效获得大丽花脱毒幼苗的方法。
【背景技术】
[0002]大_花(^3力^7<3 pinnata Cav)为菊科大_花属多年生球根花奔，全属约27种，又名大理菊、天竺牡丹、西番莲、洋芍药、大丽菊、地瓜花、红苕花等，原产墨西哥、哥伦比亚及危地马拉等国，后传到欧洲、日本和我国。大丽花茎杆粗壮，叶片肥大，花形与牡丹相似，花大而色彩艳丽，具有花姿优美、花型多样、花期长、品种繁多等特点，被誉为花卉中的宠儿。大丽花系天然种间杂交，人工选育的历史不长，世界各国普遍栽培，目前在东北、西北、华北等地栽培较广泛，其中在广东秋、冬两季栽培比较多。经过人工杂交选择，成为异源八倍体，新品种层出不穷，花色娇艳，花期长，适应性强，易于栽培，故一跃成为世界名花。目前大丽花是墨西哥的国花，西雅图的市花，我国吉林省的省花，张家口、赤峰、包头(小丽花)等城市的市花，大丽花象征大方、富丽，大吉大利，是世界著名的观赏花卉。
[0003]大丽花通常采用分根和扦插繁殖，但分根和扦插繁殖繁殖系数低，但每株每年仅可分出5-6个新株，无法满足产业化生产的要求，并且一直用分株繁殖，容易使病毒逐代积累，从而造成大丽花品种退化严重。
[0004]利用组织培养、离体快繁等技术进行茎尖脱毒培养，可以解决大丽花病毒病的问题。国内一些研究者采用大丽花外植体，进行了组织培养和脱毒技术的研究，获得了一些研究进展，但是大丽花的组织培养和脱毒技术国内研究起步较晚，研究积累少，目前大丽花的脱毒技术还有待进步，脱毒效率低、操作繁琐已经严重阻碍了大丽花品质的提高和生产的需求，因此对大丽花进行组织培养、离体快繁技术研究，建立并优化一种高效的脱毒苗培育技术，有重大的产业价值和广阔的市场开发前景。
【发明内容】
[0005]本发明的目的是针对现有大丽花脱毒技术存在的不足，提供一种可持续化、易操作且能够规模化生产的高效获得大丽花脱毒苗的方法，该方法解决了现有脱毒技术的脱毒不彻底、操作繁琐的难题，能够满足工厂化脱毒生产的需要。
[0006]本发明的目的是通过以下技术方案解决的:
一种大丽花脱毒苗的获取方法，其特征在于:该方法步骤如下:
1)采集大丽花嫩叶，脱分化产生愈伤组织；
2)将愈伤组织进行热处理，然后将愈伤组织继续诱导出不定芽、不定芽生根培养成健壮的组培苗；
3)进一步剥离组培苗茎尖，脱分化产生愈伤组织；
4)再次将愈伤组织进行热处理后诱导成苗；
5)随机抽取步骤4)中的组培苗，进行病毒检测，若检测合格即大丽花脱毒种苗，若不合格需重复I)到4)步，直到获得合格的大丽花脱毒种苗。
[0007]该方法的详细步骤如下:
1)采集大丽花嫩叶，脱分化产生愈伤组织:
采集生长至现蕾期的健康无病的大丽花的嫩叶，自来水洗净，流水冲洗30min，用70%酒精浸泡15s，0.1%升汞内加数滴吐温-20溶液浸泡15min，并用玻璃棒搅动，用无菌水冲洗4-5次，滤纸吸干，用孔直径5_的打孔器打孔，将打下的叶片接种到愈伤诱导培养基上25-27°C条件下暗培养，10-15天后产生淡黄绿色疏松的愈伤组织；
2)将愈伤组织进行热处理，然后将愈伤组织继续诱导出不定芽、不定芽生根培养成健壮的组培苗:
将生长至大米粒大小、带有少量外植体的愈伤组织转移到培养箱中热处理，切除褐化块段后将愈伤组织转接到不定芽诱导培养基上25-27°C条件下光培养，20-30天后愈伤组织分化出不定芽，将再生出来的高度Icm以上的芽转接至生根培养基培养成健壮的组培苗；
3)进一步剥离组培苗茎尖，脱分化产生愈伤组织:
待组培苗生长至5cm-8cm，剥取0.4-0.6cm大小的茎尖生长点接种到茎尖诱导愈伤培养基上，在25-27°C条件下暗培养30-45天，诱导出愈伤组织；
4)再次将愈伤组织进行热处理后诱导成苗:
再次将茎尖愈伤组织进行热处理，切除褐化块段后将愈伤组织转接到不定芽诱导培养基上，25-27°C条件下光培养20-25天后诱导出不定芽，然后转接入生根培养基，40-50天后可得到大丽花幼苗；
5)随机抽取步骤4)中的组培苗，进行病毒检测，若检测合格即大丽花脱毒种苗，若不合格需重复I)到4)步，直到获得合格的大丽花脱毒种苗:
随机抽取8-10只完成了步骤4)的的大丽花叶片，进行RT-PCR反转录病毒检测，若检测合格即大丽花脱毒种苗，若不合格需重复I)到4)步，直到获得合格的大丽花脱毒种苗。
[0008]步骤I)中用于诱导大丽花叶片产生愈伤组织的愈伤诱导培养基配方为:MS+1.5mg/L6-BA+0.3mg/LNAA +3% 蔗糖 +6.5g/L 琼脂，pH 为 5.8。
[0009]步骤2)中将将愈伤组织继续诱导出不定芽的不定芽诱导培养基配方为:MS+2.5mg/L6-BA+0.08NAA+3%蔗糖+6.5g/L植物凝胶，pH为5.8 ;所述的将愈伤组织继续诱导出不定芽、不定芽生根培养的光照条件均为:光照强度为1500-2000LUX，光周期为14h光/1h 暗。
[0010]步骤2)和步骤4)中热处理方法为:在38°C _42°C高温处理6h-8h、然后26°C -28°C低温处理10h-12h交替进行2-3循环。
[0011]步骤3)中用于诱导茎尖产生愈伤组织的培养基配方为:MS+4.5mg/L6-BA+0.5mg/L NAA+0.5mg/L KT+3% 蔗糖 +6.5g/L 琼脂，pH 为 5.8。
[0012]步骤4)中将愈伤组织诱导出不定芽的不定芽诱导培养基配方为:MS+1.5mg/L6-BA+0.3mg/L NAA +3% 蔗糖 +6.5g/L 琼脂，pH 为 5.8 ;生根培养基配方为:l/2MS+0.15mg/L NAA+1.5% 蔗糖 +6.5g/L 琼脂，pH 为 5.8。
[0013]步骤4)中将茎尖愈伤组织继续诱导出不定芽、不定芽生根培养的光照条件均为:光照强度为1500-2000LUX，光周期为12h光/12h暗。
[0014]步骤5)病毒检测的病毒种类为大丽花叶病毒、烟草花叶病毒和黄瓜花叶病毒。
[0015]本发明所述的一种大丽花脱毒苗的获取方法，是发明人经过仔细研究、大量实验验证后获得的优选结果，相比现有技术，本发明的创新点为:
本发明通过采用综合脱毒技术，即两次愈伤组织诱导、愈伤组织热处理脱毒、茎尖脱毒相结合的方法，有效的克服了脱毒材料较多、脱毒操作流程繁琐、脱毒效率低下等难题，能够高效获得大丽花脱毒幼苗。
[0016]本发明创造性的采用了愈伤组织热处理的脱毒方法，采用本发明的愈伤组织热处理后，切割掉褐化部分，培养热处理后褐化程度不明显的愈伤部分，可有效去除掉愈伤组织携带的病毒，大大提高了脱毒效率，而且避免了无菌操作，操作简单。
[0017]本发明的大丽花脱毒苗的获取方法采用茎尖诱导成愈伤，提高了大丽花的种性，又进一步脱除了大丽花病毒，该方法流程简单、容易操作，故易于形成规模化生产的脱毒种苗，适宜推广使用。
【附图说明】
[0018]图1是大丽花脱分化产生愈伤组织的结果图；
图2是大丽花愈伤组织分化出不定芽的结果图；
图3是茎尖脱毒后生根培养后的大丽花幼苗结果图；
图4是大丽花脱毒前后幼苗性状的对比结果图。
【具体实施方式】
[0019]下面结合具体实施例和附图对本发明作进一步的说明。
[0020]一种大丽花脱毒苗的获取方法，该方法的详细步骤如下:
1)采集大丽花的嫩叶，脱分化产生愈伤组织:采集生长至现蕾期的健康无病的大丽花的嫩叶，自来水洗净，流水冲洗30min，用70%酒精浸泡15s，0.1%升汞内加数滴吐温_20溶液浸泡15min，并用玻璃棒搅动，用无菌水冲洗5次，滤纸吸干，用孔直径4_的打孔器打孔，将打下的叶片接种到愈伤诱导培养基(培养基配方为:MS+1.5mg/L6-BA+0.3mg/LNAA +3%蔗糖+6.5g/L琼脂，pH为5.8)上25-27°C条件下暗