专利名称：一种半夏离体块茎的高效诱导方法
技术领域：
本发明涉及通过组织培养技术的植物再生，尤其涉及一种培养半夏离体块茎的方法。
背景技术：
半夏(Pinellia.ternata.(Thumb)Breit)为天南星科多年生宿根草本植物，基部形成块茎，是主要的贮存器官和繁殖器官。含生物碱、半夏蛋白等多种有效成分，入药有燥湿化痰、降逆止咳、抗早孕、抗肿瘤等多种药理作用，是我国特有的一种传统中药材，需求量较大。由于过度采集，半夏的野生资源已近枯竭。半夏有三种繁殖方式通过种子繁殖，小块茎繁殖和珠芽繁殖，在自然进化中已形成了以无性繁殖为主的生殖特点，故人工栽培一般采用小块茎作为繁殖器官。以上方法由于繁殖系数低，限制了半夏的大田生产。同时由于长期的无性繁殖，病毒侵染并不断积累在块茎中，导致其产量和药用成分下降。
块茎(鳞茎、球茎、块根)是植物茎的一种变态，是一种遗传性状，但它的发生和发育在很大程度上受环境、营养条件的影响。植物离体培养中，通过添加外源物质影响植物内部生化反应进而影响植物的形态发生，诱导其形成离体块茎(鳞茎、球茎、球根)等，这已在多种植物上试验成功。组织培养快速繁殖方法能够培养出脱去病毒的种苗(即脱毒种苗)。有关半夏组织培养的研究较多，且已能进行规模化生产。但是以往半夏常规组培快繁是通过半夏组织培养出半夏苗，要经过生根、炼苗、移栽等程序，较繁琐，且受移栽成活率的影响，在移栽于大田一段时间后才能形成块茎。半夏脱毒试管苗应用于大田生产需严格的驯化条件和管理操作。
发明内容
本发明的目的是提供一种高效诱导半夏离体块茎的方法，生产半夏离体块茎，克服半夏试管苗应用上的缺点。
它是将脱病毒半夏2-20mm丛生芽及同龄未脱毒母株三叶半夏组培苗，继代培养于继代培养基上，至长出2-5cm无根芽；取继代培养的脱毒三叶半夏2-5cm的生长试管芽，用于离体块茎诱导，在诱导前先转入MS基本培养基培养7-14天；用继代培养基作转移培养；用生根培养基作生根培养；用离体块茎诱导培养基作离体块茎诱导培养；培养基pH值为5.6-6.0，含琼脂4.5-5.0g/L，常规湿热灭菌20-22min，赤霉素、脱落酸、二氢茉莉酸丙酯过滤灭菌后无菌加入灭菌过的培养基中，光照强度1000-2000lx，光照10-12h/d，温度22-28℃。
继代培养基组成的重量比为MS基本培养基∶细胞分裂素∶萘乙酸∶琼脂粉∶蔗糖＝1000000∶0.5-1.2∶0.001-0.2∶4500-5000∶20000-30000；生根培养基组成的重量比为∶MS基本培养基∶萘乙酸∶活性炭∶琼脂粉∶蔗糖＝500000∶0.1-0.3∶200-600∶4500-5000∶15000-30000；离体块茎诱导培养基组成的重量比为MS基本培养基∶蔗糖∶细胞分裂素∶多效唑∶活性炭∶赤霉素∶二氢茉莉酸丙酯∶脱落酸∶琼脂粉＝1000000∶15000-120000∶0.5-1.5∶0.01-12.8∶500-2500∶0.005-0.5∶0.2-20.0∶0.05-0.5∶4500-5000。
本发明具有较强的抗逆性、贮藏性，不需特殊驯化可直接移栽于大田，不受生产季节的限制，可全年生产。离体块茎的高效诱导是半夏脱毒苗生产与大田生产的对接技术，具有较大的生产应用价值。适宜条件下诱导形成离体块茎外型、大小一致，发生同步性好，且可人为控制其生长发育。另外，离体块茎发生发育利于种质资源保存和国际间交流，可直接作为繁殖材料应用于生产，节约了原种的繁殖空间，还可缩短大田生长周期，避免种苗远程运输和贮存过程中的种种问题，具有较广阔的应用前景。与马铃薯类似，半夏离体块茎形成还可作为研究半夏生理学、细胞学、酶学等的材料，有较大的应用价值。
具体实施例方式MS基本培养基配方为(单位mg/L)贮备液INH4NO3，33000；KNO3，38000；CaCL2.2H2O，8800；MgSO4.7H2O，7400；KH2PO4，3400。
贮备液IIKI，166；H3BO3，1240；MnSO4.4H2O，4460；ZnSO4.7H2O，1720；Na2MoO42H2O，50；CuSO4·5H2O，5；CoCL2·6H2O，5。
贮备液IIIFESO4·7H2O，5560；Na2·EDTA·2H2O，7460；贮备液IV肌醇，20000；烟酸，100；盐酸吡哆醇，100；盐酸硫胺素，100；甘氨酸，400。
制备1升MS培养基，取50ml贮备液I，5ml贮备液II，5ml贮备液III，5ml贮备液IV。
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。
具体实施例
实施例1脱毒半夏2mm丛生芽及同龄未脱毒母株三叶半夏组培苗，继代培养于继代培养基上，至长出2cm无根芽；取2cm的脱毒苗，在诱导前先转MS基本培养基培养8天，用生根培养基培养，生根培养基组成比例为萘乙酸∶活性炭∶琼脂粉∶蔗糖＝500000∶0.1∶200∶4500∶15000，后用离体块茎诱导培养基进行离体块茎诱导培养，离体块茎诱导培养基为MS基本培养基∶蔗糖∶细胞分裂素∶多效唑∶活性炭∶赤霉素∶二氢茉莉酸丙酯∶脱落酸∶琼脂粉＝1000000∶30000∶0.5∶5.0∶500∶0.005∶0.2∶0.05∶4800，40天后测重，单个块茎重为0.653克。培养基pH值为5.6，含琼脂4.5g/L，常规湿热灭菌20min，赤霉素、脱落酸、二氢茉莉酸丙酯过滤灭菌后无菌加入灭菌过的培养基中，光照强度1000lx，光照10h/d，温度22℃。
实施例2脱毒半夏3mm丛生芽及同龄未脱毒母株三叶半夏组培苗，继代培养于继代培养基上，至长出3cm无根芽；取3cm的脱毒苗，在诱导前先转入MS基本培养基培养7天，用生根培养基培养，生根培养基组成比例为萘乙酸∶活性炭∶琼脂粉∶蔗糖＝500000∶0.3∶600∶5000∶30000，后用离体块茎诱导培养基进行离体块茎诱导培养，离体块茎诱导培养基为MS基本培养基∶蔗糖∶细胞分裂素∶多效唑∶活性炭∶赤霉素∶二氢茉莉酸丙酯∶脱落酸∶琼脂粉＝1000000∶15000∶1.0∶0.05∶2500∶0.05∶2.0∶0.5∶5000，40天后测重，单个块茎重为0.776克。培养基pH值为5.8，含琼脂4.7g/L，常规湿热灭菌21min，赤霉素、脱落酸、二氢茉莉酸丙酯过滤灭菌后无菌加入灭菌过的培养基中，光照强度1200lx，光照11h/d，温度23℃。
实施例3脱毒半夏10mm丛生芽及同龄未脱毒母株三叶半夏组培苗，继代培养于继代培养基上，至长出4cm无根芽；取4cm的脱毒苗，在诱导前先转入MS基本培养基培养10天，用生根培养基培养，生根培养基组成比例为萘乙酸∶活性炭∶琼脂粉∶蔗糖＝500000∶0.2∶300∶4800∶25000，后用离体块茎诱导培养基进行离体块茎诱导培养，离体块茎诱导培养基为MS基本培养基∶蔗糖∶细胞分裂素∶多效唑∶活性炭∶赤霉素∶二氢茉莉酸丙酯∶脱落酸∶琼脂粉＝1000000∶20000∶1.5∶0.5∶2500∶0.5∶20.0∶5∶4500，40天后测重，单个块茎重为0.556克。培养基pH值为6.0，含琼脂5.0g/L，常规湿热灭菌22min，赤霉素、脱落酸、二氢茉莉酸丙酯过滤灭菌后无菌加入灭菌过的培养基中，光照强度2000lx，光照12h/d，温度28℃。
实施例4脱毒半夏20mm丛生芽及同龄未脱毒母株三叶半夏组培苗，继代培养于继代培养基上，至长出4cm无根芽；取4cm的脱毒苗，在诱导前先转入MS基本培养基培养8天，用生根培养基培养，生根培养基组成比例为萘乙酸∶活性炭∶琼脂粉∶蔗糖＝500000∶0.15∶400∶4900∶29000，后用离体块茎诱导培养基进行离体块茎诱导培养，离体块茎诱导培养基为MS基本培养基∶蔗糖∶细胞分裂素∶多效唑∶活性炭∶赤霉素∶二氢茉莉酸丙酯∶脱落酸∶琼脂粉＝1000000∶70000∶1.0∶0.5∶1000∶0.05∶2.0∶0.5∶50000，40天后测重，单个块茎重为0.852克。培养基pH值为5.9，含琼脂4.9g/L，常规湿热灭菌21min，赤霉素、脱落酸、二氢茉莉酸丙酯过滤灭菌后无菌加入灭菌过的培养基中，光照强度1800lx，光照12h/d，温度27℃。
实施例5脱毒半夏19mm丛生芽及同龄未脱毒母株三叶半夏组培苗，继代培养于继代培养基上，至长出4cm无根芽；取4cm的脱毒苗，在诱导前先转入MS基本培养基培养13天，用生根培养基培养，生根培养基组成比例为萘乙酸∶活性炭∶琼脂粉∶蔗糖＝500000∶0.25∶500∶4200∶12000，后用离体块茎诱导培养基进行离体块茎诱导培养，离体块茎诱导培养基为MS基本培养基∶蔗糖∶细胞分裂素∶多效唑∶活性炭∶赤霉素∶二氢茉莉酸丙酯∶脱落酸∶琼脂粉＝1000000∶110000∶1.5∶5.0∶25000∶0.5∶0.2∶5∶4500，40天后测重，单个块茎重为0.539克。培养基pH值为6.0，含琼脂4.9g/L，常规湿热灭菌22min，赤霉素、脱落酸、二氢茉莉酸丙酯过滤灭菌后无菌加入灭菌过的培养基中，光照强度1700lx，光照11.5h/d，温度26.5℃。
实施例6脱毒半夏15mm丛生芽及同龄未脱毒母株三叶半夏组培苗，继代培养于继代培养基上，至长出5cm无根芽；取5cm的脱毒苗，在诱导前先转入MS基本培养基培养12天，用生根培养基培养，生根培养基组成比例为萘乙酸∶活性炭∶琼脂粉∶蔗糖＝500000∶0.27∶240∶4800∶28000，后用离体块茎诱导培养基进行离体块茎诱导培养，离体块茎诱导培养基为MS基本培养基∶蔗糖∶细胞分裂素∶多效唑∶活性炭∶赤霉素∶二氢茉莉酸丙酯∶脱落酸∶琼脂粉＝1000000∶16000∶1.4∶0.05∶1000∶0.005∶20.0∶0.05∶4700，40天后测重，单个块茎重为0.622克。培养基pH值为5.8，含琼脂5.0g/L，常规湿热灭菌20min，赤霉素、脱落酸、二氢茉莉酸丙酯过滤灭菌后无菌加入灭菌过的培养基中，光照强度1900lx，光照12h/d，温度28℃。
实施例7脱毒半夏17mm丛生芽及同龄未脱毒母株三叶半夏组培苗，继代培养于继代培养基上，至长出4.5cm无根芽；取4.5cm的脱毒苗，在诱导前先转入MS基本培养基培养7天，用生根培养基培养，生根培养基组成比例为萘乙酸∶活性炭∶琼脂粉∶蔗糖＝500000∶0.22∶350∶4480∶17000，后用离体块茎诱导培养基进行离体块茎诱导培养，离体块茎诱导培养基为MS基本培养基∶蔗糖∶细胞分裂素∶多效唑∶活性炭∶赤霉素∶二氢茉莉酸丙酯∶脱落酸∶琼脂粉＝1000000∶90000∶1.0∶0.05∶2500∶0.5∶0.2∶5∶4900，40天后测重，单个块茎重为0.563克。培养基pH值为5.6，含琼脂4.6g/L，常规湿热灭菌20min，赤霉素、脱落酸、二氢茉莉酸丙酯过滤灭菌后无菌加入灭菌过的培养基中，光照强度1500lx，光照12h/d，温度23℃。
实施例8脱毒半夏16mm丛生芽及同龄未脱毒母株三叶半夏组培苗，继代培养于继代培养基上，至长出2.5cm无根芽；取2.5cm的脱毒苗，在诱导前先转入MS基本培养基培养14天，用生根培养基培养，生根培养基组成比例为萘乙酸∶活性炭∶琼脂粉∶蔗糖＝500000∶0.11∶210∶4100∶16000，后用离体块茎诱导培养基进行离体块茎诱导培养，离体块茎诱导培养基为MS基本培养基∶蔗糖∶细胞分裂素∶多效唑∶活性炭∶赤霉素∶二氢茉莉酸丙酯∶脱落酸∶琼脂粉＝1000000∶120000∶1.5∶12.8∶580∶0.05∶20∶0.05∶4800，40天后测重，单个块茎重为0.596克。培养基pH值为6.0，含琼脂4.9g/L，常规湿热灭菌21min，赤霉素、脱落酸、二氢茉莉酸丙酯过滤灭菌后无菌加入灭菌过的培养基中，光照强度1800lx，光照10.5h/d，温度24℃。
实施例9脱毒半夏14mm丛生芽及同龄未脱毒母株三叶半夏组培苗，继代培养于继代培养基上，至长出3.5cm无根芽；取3.5cm的脱毒苗，在诱导前先转入MS基本培养基培养9天，用生根培养基培养，生根培养基组成比例为萘乙酸∶活性炭∶琼脂粉∶蔗糖＝500000∶0.29∶580∶4600∶24000，后用离体块茎诱导培养基进行离体块茎诱导培养，离体块茎诱导培养基为MS基本培养基∶蔗糖∶细胞分裂素∶多效唑∶活性炭∶赤霉素∶二氢茉莉酸丙酯∶脱落酸∶琼脂粉＝1000000∶110000∶0.8∶11.0∶2400∶0.005∶20.0∶0.5∶5.0，40天后测重，单个块茎重为0.560克。培养基pH值为5.7，含琼脂5.0g/L，常规湿热灭菌20min，赤霉素、脱落酸、二氢茉莉酸丙酯过滤灭菌后无菌加入灭菌过的培养基中，光照强度1600lx，光照12h/d，温度28℃。
对照例1与诱导培养离体块茎的同时，用与诱导培养离体块茎的脱毒苗同样大小的高2cm的脱毒苗转入生根培养基至根长1~2cm时开盖炼苗2~3天，移栽于装有经消毒处理的泥炭土+珍珠岩+蛭石(体积比5∶1∶3)的育苗盘中，置驯化室。10天后移栽于经过消毒处理的防虫温室中。脱毒苗移栽60天后挖取块茎称量平均鲜重为0.515g，平均直径为1.224cm，尽管与离体块茎相比生长时间长，但其直径、鲜重比离体块茎仍明显偏小。
对照例2与诱导培养离体块茎的同时，用与诱导培养离体块茎的脱毒苗同样大小的高5cm的脱毒苗转入生根培养基至根长1~2cm时开盖炼苗2~3天，移栽于装有经消毒处理的泥炭土+珍珠岩+蛭石(体积比5∶1∶3)的育苗盘中，置驯化室。10天后移栽于经过消毒处理的防虫温室中。脱毒苗移栽60天后挖取块茎称量平均鲜重为0.520g，平均直径为1.230cm，尽管与离体块茎相比生长时间长，但其直径、鲜重比离体块茎仍明显偏小。
权利要求
1.一种半夏离体块茎的高效诱导方法，其特征在于脱毒半夏2-20mm丛生芽及同龄未脱毒母株三叶半夏组培苗，继代培养于继代培养基上，至长出2-5cm无根芽；取继代培养的脱毒三叶半夏2-5cm的生长试管芽，用于离体块茎诱导，在诱导前先转入MS基本培养基培养7-14天；用继代培养基作转移培养；用生根培养基作生根培养；用离体块茎诱导培养基作离体块茎诱导培养；培养基pH值为5.6-6.0，含琼脂4.5-5.0g/L，常规湿热灭菌20-22min，赤霉素、脱落酸、二氢茉莉酸丙酯过滤灭菌后无菌加入灭菌过的培养基中，光照强度1000-2000lx，光照10-12h/d，温度22-28℃。
2.根据权利要求1所述的一种半夏离体块茎的高效诱导方法，其特征在于，所述的继代培养基组成的重量比为MS基本培养基∶细胞分裂素∶萘乙酸∶琼脂粉∶蔗糖＝1000000∶0.5-1.2∶0.001-0.2∶4500-5000∶20000-30000。
3.根据权利要求1所述的一种半夏离体块茎的高效诱导方法，其特征在于，所述的生根培养基组成的重量比为MS基本培养基∶萘乙酸∶活性炭∶琼脂粉∶蔗糖＝500000∶0.1-0.3∶200-600∶4500-5000∶15000-30000。
4.根据权利要求1所述的一种半夏离体块茎的高效诱导方法，其特征在于，所述的离体块茎诱导培养基组成的重量比为MS基本培养基∶蔗糖∶细胞分裂素∶多效唑∶活性炭∶赤霉素∶二氢茉莉酸丙酯∶脱落酸∶琼脂粉＝1000000∶15000-120000∶0.5-1.5∶0.01-12.8∶500-2500∶0.005-0.5∶0.2-20.0∶0.05-0.5∶4500-5000。
全文摘要
本发明公开了一种半夏离体块茎的高效诱导方法。它是用继代培养基作转移培养；用生根培养基作生根培养；用离体块茎诱导培养基作离体块茎诱导培养。继代培养基组成为MS基本培养基、细胞分裂素、萘乙酸、琼脂粉、蔗糖；生根培养基组成为MS基本培养基、萘乙酸、活性炭、琼脂粉、蔗糖；离体块茎诱导培养基组成为MS基本培养基、赤霉素、脱落酸、二氢茉莉酸丙酯、蔗糖、多效唑、细胞分裂素、活性炭、琼脂粉。半夏离体块茎具有较强的抗逆性，不需特殊驯化可直接移栽于大田，不受生产季节的限制，可全年生产。离体块茎的高效诱导是半夏脱毒苗生产与大田生产的对接技术，具有较大的生产应用价值。
文档编号A01H4/00GK1701660SQ20051004974
公开日2005年11月30日 申请日期2005年4月30日 优先权日2005年4月30日
发明者陈集双, 王海丽, 竺锡武, 何煜波, 张凯, 陈新爱, 黄幸雷 申请人:浙江理工大学