一种抑制大豆茎褐腐病菌生长的化合物的制作方法
【技术领域】
[0001] 本发明设及化合物的新用途，阐明药物化学结构与细菌的生物活性之间的关系， 更具体的说，是探索化合物对大豆茎褐腐病菌的抑菌和杀菌活性。
【背景技术】
[0002] 大豆茎褐腐病，是大豆生产上的一种重要病害，病原菌为大豆茎褐腐病菌。目前， 大豆茎褐腐病菌发生分布于美国中西部和东南部各州、加拿大、己西、阿根廷、墨西哥、埃 及、日本和前南斯拉夫等。
[0003] 大豆茎褐腐病菌危害的主要特征是大豆茎部维管束和髓部变红褐色，随后整个茎 部变成褐色，并且在大豆生长后期(通常是8月份）或在干燥条件下能够引起叶片的变色和 叶脉间的坏死、枯斑，造成种子数量减少、种子变小W及植株倒伏难W收获等。造成病害发 生的因素还包括溫度，降雨量，±壤带菌量，菌株致病性，耕作情况W及所种植大豆品种的 抗病性等等。所W大豆茎褐腐病对大豆产量的影响并不十分清楚。有研究者报道，当出现 落叶症状时，产量损失达到34%，而不出现落叶症状时，产量损失只有8%。
[0004] 大豆茎褐腐病，1940年首次在美国的伊利诺斯州报道，1948年，Allington和 化ambedain将病原菌描述为头饱属的1个种。随后，1971年，尽管大豆茎褐腐病真菌的分 生抱子梗一般不产生色素，Gams还是将运个种放到化ialo地ora属中。核糖体DNA测序表 明：大豆茎褐腐病是子囊菌亚口盘菌纲肉座菌目的一种无性型。大豆茎褐腐病菌在PDA培 养基上形成白色至暗褐色的菌丝，菌丝大部分是淡褐色的。菌落表面凸起，粗糖或平滑。 阳0化]虽然根部侵染较早发生，但是茎部变褐的症状通常在R5到R7生长阶段(豆芙成熟 期)才开始显现。大豆茎褐腐病通常在在八月中旬或是九月田间出现死亡植株时被观察到。 未成熟植株的死亡是不能够作为诊断的依据的。最可信的田间诊断症状是劈开受侵染植物 的下部茎杆。健康植株的髓部组织为白色，而受大豆茎褐腐病侵染的植株通常为深褐色或 红褐色。在生长期，髓部变色从茎基部开始一直延伸到顶端。在病程初期，髓部组织通常在 节间有一个浅红褐色的变化区域，而皮层组织直到发病后期才一有症状出现。
[0006] 此时维管束壁和皮层组织会同时变色。叶部症状受菌株，大豆品种或环境因素的 影响，与茎部症状同时发生或不发生。叶部症状表现为叶脉突然交错变黄。病斑迅速扩大， 黄萎组织迅速死亡变褐。靠近叶脉的组织最后死亡。最后所有叶片卷曲死亡。有时，叶片会 在尚未变黄时迅速枯萎。在两种情况下，叶片都会在死亡后不迅速调落。大豆茎褐腐病的 症状与大豆急速死亡症的症状十分相似，大豆在感染大豆急速死亡症后，叶片会迅速调落， 而叶柄会继续留在茎杆上。
[0007] 大豆茎褐腐病菌可存活于大豆残体和±壤中3~5年，感病±壤和病残体可夹杂在 收获的大豆中，随大豆的贸易远距离传播，也有报道病菌还可潜伏在种子内部传播。在病残 体上产生的分生抱子是根部的主要侵染源，也是大豆茎褐腐病的初次侵染源。菌丝在寄主 木质部导管中延伸，造成导管变色和堵塞。受侵染的大豆植株在生长早期不会表现叶片症 状，接着突然出现交错的黄萎和坏死症状，并且随着溫度的升高而加重，随后叶片卷曲和萎 黨。沿大豆茎杆的纵切面剖开，在受侵染的植株上，内部变褐的症状是非常明显的，特别在 靠近±壤表面的大豆茎杆的节上或节之间更明显。在缺水条件下，对导管的堵塞会引起叶 部症状，病原菌不会通过植株进入芙或种子。病原菌适宜的溫度范围为15~27°C，最适生长 溫度为20°C。随着溫度升高，维管束变褐的程度减轻，病害的发病率降低。当空气溫度达到 27°C时，维管束褐变的程度减轻，溫度超过32°C，很少发病或不发病。当±壤湿度接近于田 间持水量(衡量±壤保水性的重要指标，通常视为作物有效水的上限）时，更有利于病害的 发生。在凉爽、低溫的气候条件下，茎部褐变明显，更有利于病害的发生和流行。
【发明内容】
[0008] 本发明采用体外抗菌试验，研究化合物对大豆茎褐腐病菌的生物活性。 阳009] 本发明的具体技术方案如下： 本发明的创新点是发现化合物对大豆茎褐腐病菌有良好的抑菌和杀菌活性，并测量得 到其最小抑菌浓度MIC值和最小杀菌浓度MBC值，属于首次公开。
[0010] 所述化合物结构特征如下式所示：
【具体实施方式】
[0011] 下面结合具体实施实例，进一步详细地说明本发明。应理解下面实施例仅用于说 明本发明而不用于限制本发明范围。 阳〇1引实施实例1 测量最小抑菌浓度MIC值。
[0013] (1)营养肉汤的配制：取营养肉汤30g加1000血蒸馈水即得。使用前12rc高压 蒸汽灭菌20min待用。
[0014] (2)营养琼脂固体培养基的配制：取营养琼脂45g加lOOOmL蒸馈水即得。使用前 12rC高压蒸汽灭菌20min待用。
[0015] (3)菌株的培养：操作于超净工作台上进行。吸取已灭菌的液体培养基lOmU放在 已灭菌的试管中，然后用接菌环挑取一个菌落，加到液体培养基中，放于培养箱内培养，细 菌培养24h，培养溫度为20°C。
[0016] (4)菌液配制及计数：将培养后的菌液，采用10倍稀释法用液体培养基稀释，并 用血球计数板在显微镜上初步观察计数，然后将菌液用液体培养基稀释，作为加入供试品 中的菌液。细菌采用平板计数法进行计数，将W上菌液用无菌生理盐水再稀释100倍，取 50y以均匀涂于已铺有固体培养基的平皿中，培养2地，培养溫度为20°C。培养后，单个活 细菌生长形成一个菌落，统计菌落数目，即可计算出样品中的含菌数。
[0017] 计算公式为：菌液浓度=nX20XlOOcfu/mL (5)药品溶液的配制：称取化合物，加入灭菌生理盐水，摇勾，得均匀溶液，备用。存放 于4°C冰箱保存待用。
[0018] (6)最小抑菌浓度（MIC)与最小杀菌浓度（MBC)的测定：采用微量肉汤稀释法测定 最小抑菌浓度MIC(MinimalInhibitoiTConcentration)。MIC为最小抑菌浓度，即药物 与一定浓度的菌液作用后，能够抑制可见菌生长的最低浓度。
[0019] 采用二倍稀释法将药液用无菌生理盐水将药液稀释系列浓度，0.5、1、2、4、8、16、 32、64、128和256 ^邑/111以在96孔板上1~10行，每孔加lOOyL不同浓度的药液和lOOyL 菌液，使最终菌液浓度为1~5X105c化/mU第11行W无菌生理盐水加菌液作为阳性对照，第 12行W不加菌液的无菌生理盐水为阴性对照，混匀后于20°C培养2地，W肉眼观察药物最 低浓度管中无细菌生长者为该试验药物的MIC，每个实验重复=次。
[0020] 测得最小抑菌浓度MIC值为32 yg/血。 阳OW 实施实例2 测量最小杀菌浓度MBC值。
[0022] (1)营养肉汤的配制：取营养肉汤30g加1000血蒸馈水即得。使用前12rc高压 蒸汽灭菌20min待用。
[0023] (2)营养琼脂固体培养基的配制：取营养琼脂45g加lOOOmL蒸馈水即得。使用前 12rC高压蒸汽灭菌20min待用。
[0024] (3)菌株的培养：操作于超净工作台上进行。吸取已灭菌的液体培养基lOmU放在 已灭菌的试管中，然后用接菌环挑取一个菌落，加到液体培养基中，放于培养箱内培养，细 菌培养2地，培养溫度为20°C。
[00巧](4)菌液配制及计数：将培养后的菌液，采用10倍稀释法用液体培养基稀释，并 用血球计数板在显微镜上初步观察计数，然后将菌液用液体培养基稀释，作为加入供试品 中的菌液。细菌采用平板计数法进行计数，将W上菌液用无菌生理盐水再稀释100倍，取 50y以均匀涂于已铺有固体培养基的平皿中，培养2地，培养溫度为2(TC。培养后，单个活 细菌生长形成一个菌落，统计菌落数目，即可计算出样品中的含菌数；计算公式为：菌液浓 度=nX20X100cfu/mL。
[0026] (5)药品溶液的配制：称取化合物，加入灭菌生理盐水，摇勾，得均匀溶液，备用。存 放于4°C冰箱保存待用。
[0027] (6)最小抑菌浓度（MIC)与最小杀菌浓度（MBC)的测定：采用微量肉汤稀释法测定 最小杀菌浓度MBC(MinimalBactericidalConcentration)。在MIC基础上，从每管吸取 10化溶液，点于固体培养基上，继续按MIC培养条件下培养，W完全杀灭细菌的最低浓度 为最小杀菌浓度(菌落数小于等于5)。
[0028] 采用二倍稀释法将药液用无菌生理盐水将药液稀释系列浓度，0.5、1、2、4、8、16、 32、64、128和256 ^邑/111以在96孔板上1~10行，每孔加lOOyL不同浓度的药液和lOOyL 菌液，使最终菌液浓度为1~5X105c化/mL，第11行W无菌生理盐水加菌液作为阳性对照， 第12行W不加菌液的无菌生理盐水为阴性对照，混匀后于20°C培养2地，W肉眼观察药物 最低浓度管中无细菌生长者为该试验药物的MIC。将上述未见生长细菌的各孔中的肉汤取 10化接种于营养琼脂平板上，做好标记，于20°c培养2也w仍无细菌生长的管内药物浓 度记为该药的MBC，每个实验重复S次。
[0029] 测得最小杀菌浓度MBC值为64yg/血。
【主权项】
1. 一种抑制大豆茎褐腐病菌生长的化合物，其特征在于： (1) 结构特征如下式所示：(2) 其可作为大豆茎褐腐病菌的抑制剂和杀菌剂； (3) 其对大豆茎褐腐病菌的最小抑菌浓度MIC值为32yg/mL; (4) 其对大豆茎褐腐病菌的最小杀菌浓度MBC值为64yg/mL。
【专利摘要】本发明发现对大豆茎褐腐病菌具有抑菌和杀菌活性的化合物。其大豆茎褐腐病菌的最小抑菌浓度MIC值为32μg/mL，最小杀菌浓度MBC值为64μg/mL。
【IPC分类】A01P3/00, A01N43/86
【公开号】CN105211079
【申请号】CN201510730192
【发明人】不公告发明人
【申请人】许自协
【公开日】2016年1月6日
【申请日】2015年11月2日