新的纤溶酶、其编码序列及用途的制作方法

专利名称：新的纤溶酶、其编码序列及用途的制作方法
技术领域：
本发明属于生物技术和医学领域，具体地说，本发明涉及新的编码纤溶酶-蚯蚓纤溶酶Z的多核苷酸，以及此多核苷酸编码的蛋白质。本发明还涉及此多核苷酸和蛋白质的制法和用途，以及含该纤溶酶的药物组合物。
蚯蚓纤溶酶是从蚯蚓中提取到的一类能水解血纤维蛋白(原)的酶类。它存在于蚯蚓的消化道内，分子量从15,000到60,000道尔顿。蚯蚓纤溶酶不是单一的一种酶，而是具有相同功能的多种蛋白水解酶的总称。
研究结果表明蚯蚓纤溶酶具有双重功能，除了能直接水解纤维蛋白外，还能激活血纤维蛋白溶酶原成血纤维蛋白溶酶，从而具有间接水解纤维蛋白的作用。体外药理实验的结果指出，蚯蚓纤溶酶除了能直接溶解血块外，还能刺激血管内皮细胞释放tPA，从而增强体内的纤溶作用。体内及体外血栓形成模型实验及人工血栓溶解实验结果均指出，蚯蚓纤溶酶具有明显的抗栓和溶栓作用。
基于蚯蚓纤溶酶这样一种特性，国内外已将它制成口服胶囊用于临床上治疗血栓栓塞性疾病。例如，商品名为龙心、蚓激酶、博洛克、普恩复及溶栓胶囊等药物都是以蚯蚓纤溶酶作为原料制成的。但至今蚯蚓纤溶酶的结构还鲜为人知，而且没有报道过任何一种具体蚯蚓纤溶酶的氨基酸序列或核苷酸序列。
鉴于纤溶酶的在治疗血栓栓塞性疾病等方面具有巨大的应用前景，因此本领域迫切需要开发新的纤溶酶。
本发明的目的是提供一种新的纤溶酶蚯蚓纤溶酶以及其片段、类似物和衍生物。
本发明的另一目的是提供编码这些蛋白质的多核苷酸。
本发明的另一目的是提供生产这些蛋白质的方法以及该蛋白质和编码序列的用途。
在本发明的第一方面，提供新颖的分离出的蚯蚓纤溶酶Z蛋白质，该蛋白质来自蚯蚓，它包含具有SEQ ID NO2氨基酸序列的蛋白质、或其保守性变异蛋白质、或其活性片段、或其活性衍生物。较佳地，该蛋白质是具有SEQ ID NO2氨基酸序列的蛋白质。
在本发明的第二方面，提供编码分离的这些蛋白质的多核苷酸，该多核苷酸包含一核苷酸序列，该核苷酸序列与选自下组的一种核苷酸序列有至少70％同源性(a)编码上述蚯蚓纤溶酶Z蛋白质的多核苷酸；和(b)与多核苷酸(a)互补的多核苷酸。较佳地，该多核苷酸编码具有SEQ ID NO2所示氨基酸序列的蛋白质。更佳地，该多核苷酸的序列是选自下组的一种(a)具有SEQ ID NO1中1-723位的序列；(b)具有SEQ ID NO1中1-979位的序列。
在本发明的第三方面，提供了含有上述多核苷酸的载体，以及被该载体转化或转导的宿主细胞或者被上述多核苷酸直接转化或转导的宿主细胞。
在本发明的第四方面，提供了制备具有蚯蚓纤溶酶Z蛋白质活性的蛋白质的方法，该方法包含(a)在适合表达蚯蚓纤溶酶Z的条件下，培养上述被转化或转导的宿主细胞；(b)从培养物中分离出具有蚯蚓纤溶酶Z蛋白质活性的蛋白质。
在本发明的第五方面，提供了与上述的蚯蚓纤溶酶Z蛋白质特异性结合的抗体。
在本发明的第六方面，提供了一种药物组合物，它含有安全有效量的本发明的蚯蚓纤溶酶Z以及药学上可接受的载体。这些药物组合物可治疗血栓栓塞性疾病等病症。
本发明的其它方面由于本文的技术的公开，对本领域的技术人员而言是显而易见的。
下列附图用于说明本发明的具体实施方案，而不用于限定由权利要求书所界定的本发明范围。


图1显示了蚯蚓纤溶酶Z的PCR扩增条带，泳道1为DNA标准；泳道2为PCR扩增产物。
图2显示了蚯蚓纤溶酶Z的基因序列及其编码的蛋白质序列。
图3显示了表达蚯蚓纤溶酶Z的原核表达载体pET-28a(+)中的构建过程。
图4显示了蚯蚓纤溶酶Z表达产物的SDS-PAGE图谱和western图谱。其中各泳道分别是1.蛋白质标准分子量，2.IPTG诱导前菌体总蛋白质，3.IPTG诱导后菌体总蛋白质，4.Western图谱。
本发明人首先从多种蚯蚓中中分离了一种分子量为25125.0道尔顿的蚯蚓纤溶酶(质谱测定结果)，命名它为蚯蚓纤溶酶Z。并且，以威廉腔环蚓(Metaphireguillelmi)为代表，测定了蚯蚓纤溶酶Z的N端一段氨基酸序列，并以此为根据合成了相应的引物，然后从蚯蚓中分离有关的mRNA为模板，经反转录获得cDNA，用PCR法扩增和克隆了蚯蚓纤溶酶Z的基因，并测定了基因的全序列。然后将蚯蚓纤溶酶Z的编码序列插入合适载体并转入合适的宿主细胞，表达并分离了蚯蚓纤溶酶Z。并通过Western印迹分析加以鉴定。
在本发明中，术语“蚯蚓纤溶酶Z”、“蚯蚓纤溶酶Z蛋白质”或“蚯蚓纤溶酶Z多肽”可互换使用，都指基本上具有蚯蚓纤溶酶Z氨基酸序列(SEQ ID NO2)的多肽或蛋白质。它们包括含有或不含起始甲硫氨酸的纤溶酶蚯蚓纤溶酶Z。这些术语还包括含有或不含有信号肽的蚯蚓纤溶酶Z。
如本文所用，“分离的”是指物质从其原始环境中分离出来(如果是天然的物质，原始环境即是天然环境)。如活体细胞内的天然状态下的多聚核苷酸和蛋白质是没有分离纯化的，但同样的多聚核苷酸或蛋白质如从天然状态中同存在的其他物质中分开，则为分离纯化的。
如本文所用，“分离的蚯蚓纤溶酶Z多肽或蛋白质”是指蚯蚓纤溶酶Z蛋白质基本上不含天然与其相关的其它蛋白、脂类、糖类或其它物质。本领域的技术人员能用标准的蛋白质纯化技术(尤其是FPLC)分离纯化出蚯蚓纤溶酶Z。
本发明的蛋白质可以是重组蛋白质、天然蛋白质、合成蛋白质，优选重组蛋白质。本发明的蛋白质可以是天然纯化的产物，或是化学合成的产物，或使用重组技术从原核或真核宿主(例如，细菌、酵母、高等植物、昆虫和哺乳动物细胞)中产生。根据重组生产方案所用的宿主，本发明的蛋白质可以是糖基化的，或可以是非糖基化的。本发明的蛋白质还可包括或不包括起始的甲硫氨酸残基。
本发明还包括蚯蚓纤溶酶Z的片段、衍生物和类似物。如本文所用，术语“片段”、“衍生物”和“类似物”是指基本上保持本发明的天然蚯蚓纤溶酶Z相同的生物学功能或活性的蛋白质。本发明的蛋白质片段、衍生物或类似物可以是(i)有一个或多个保守或非保守性氨基酸残基(优选保守性氨基酸残基)被取代的蛋白质，而这样的取代的氨基酸残基可以是也可以不是由遗传密码编码的，或(ii)在一个或多个氨基酸残基中具有取代基团的蛋白质，或(iii)成熟蛋白质与另一个化合物(比如延长蛋白质半衰期的化合物，例如聚乙二醇)融合所形成的蛋白质，或(iv)附加的氨基酸序列融合到此蛋白质序列而形成的蛋白质(如前导序列或分泌序列或用来纯化此蛋白质的序列或酶原序列，或与抗原IgG片段的形成的融合蛋白)。根据本文的教导，这些片段、衍生物和类似物属于本领域熟练技术人员公知的范围。
在本发明中，术语“蚯蚓纤溶酶Z蛋白质”指具有蚯蚓纤溶酶Z活性的SEQ IDNO.2序列的蛋白质。该术语还包括具有与蚯蚓纤溶酶Z相同功能的、SEQ ID NO.2序列的变异形式。这些变异形式包括(但并不限于)若干个(通常为1-50个，较佳地1-30个，更佳地1-20个，最佳地1-10个)氨基酸的缺失、插入和/或取代，以及在C末端和/或N末端添加一个或数个(通常为20个以内，较佳地为10个以内，更佳地为5个以内)氨基酸。例如，在本领域中，用性能相近或相似的氨基酸进行取代时，通常不会改变蛋白质的功能。又比如，在C末端和/或N末端添加一个或数个氨基酸通常也不会改变蛋白质的功能。该术语还包括蚯蚓纤溶酶Z的活性片段和活性衍生物。
该蛋白质的变异形式包括同源序列、保守性变异体、等位变异体、天然突变体、诱导突变体、在高或低的严紧度条件下能与蚯蚓纤溶酶Z DNA杂交的DNA所编码的蛋白、以及利用抗蚯蚓纤溶酶Z蛋白质的抗血清获得的多肽或蛋白质。本发明还提供了其他蛋白质，如包含蚯蚓纤溶酶Z蛋白质或其片段的融合蛋白。除了几乎全长的蛋白质外，本发明还包括了蚯蚓纤溶酶Z蛋白质序列的可溶性片段。通常，该片段具有蚯蚓纤溶酶Z蛋白质序列的至少约10个连续氨基酸，通常至少约30个连续氨基酸，较佳地至少约50个连续氨基酸，更佳地至少约80个连续氨基酸，最佳地至少约100个连续氨基酸。
发明还提供蚯蚓纤溶酶Z或的类似物。这些类似物与天然蚯蚓纤溶酶Z蛋白质的差别可以是氨基酸序列上的差异，也可以是不影响序列的修饰形式上的差异，或者兼而有之。这些蛋白质包括天然或诱导的遗传变异体。诱导变异体可以通过各种技术得到，如通过辐射或暴露于诱变剂而产生随机诱变，还可通过定点诱变法或其他已知分子生物学的技术。类似物还包括具有不同于天然L-氨基酸的残基(如D-氨基酸)的类似物，以及具有非天然存在的或合成的氨基酸(如β、γ-氨基酸)的类似物。应理解，本发明的蛋白质并不限于上述例举的代表性的蛋白质。
修饰(通常不改变一级结构)形式包括体内或体外的蛋白质的化学衍生形式如乙酰化或羧基化。修饰还包括糖基化，如那些在蛋白质的合成和加工中或进一步加工步骤中进行糖基化修饰而产生的蛋白质。这种修饰可以通过将蛋白质暴露于进行糖基化的酶(如哺乳动物的糖基化酶或去糖基化酶)而完成。修饰形式还包括具有磷酸化氨基酸残基(如磷酸酪氨酸，磷酸丝氨酸，磷酸苏氨酸)的序列。还包括被修饰从而提高了其抗蛋白水解性能或优化了溶解性能的蛋白质。
在本发明中，“蚯蚓纤溶酶Z保守性变异蛋白质”指与SEQ ID N02的氨基酸序列相比，有至多10个，较佳地至多8个，更佳地至多5个，最佳地至多3个氨基酸被性质相似或相近的氨基酸所替换而形成蛋白质。这些保守性变异蛋白质最好根据表1进行氨基酸替换而产生。
表1
本发明的多核苷酸可以是DNA形式或RNA形式。DNA形式包括cDNA、基因组DNA或人工合成的DNA。DNA可以是单链的或是双链的。DNA可以是编码链或非编码链。编码成熟蛋白质的编码区序列可以与SEQ ID NO1所示的编码区序列相同或者是简并的变异体。如本文所用，“简并的变异体”在本发明中是指编码具有SEQ ID NO2的蛋白质，但与SEQ ID NO1所示的编码区序列有差别的核酸序列。
编码SEQ ID NO2的成熟蛋白质的多核苷酸包括只编码成熟蛋白质的编码序列；成熟蛋白质的编码序列和各种附加编码序列；成熟蛋白质的编码序列(和任选的附加编码序列)以及非编码序列。
术语“编码蛋白质的多核苷酸”可以是包括编码此蛋白质的多核苷酸，也可以是还包括附加编码和/或非编码序列的多核苷酸。
本发明还涉及上述多核苷酸的变异体，其编码与本发明有相同的氨基酸序列的多肽或蛋白质的片段、类似物和衍生物。此多核苷酸的变异体可以是天然发生的等位变异体或非天然发生的变异体。这些核苷酸变异体包括取代变异体、缺失变异体和插入变异体。如本领域所知的，等位变异体是一个多核苷酸的替换形式，它可能是一个或多个核苷酸的取代、缺失或插入，但不会从实质上改变其编码的蛋白质的功能。
本发明还涉及与上述的序列杂交且两个序列之间具有至少50％，较佳地至少70％，更佳地至少80％同源性的多核苷酸。本发明特别涉及在严格条件下与本发明所述多核苷酸可杂交的多核苷酸。在本发明中，“严格条件”是指(1)在较低离子强度和较高温度下的杂交和洗脱，如0.2×SSC，0.1％SDS，60℃；或(2)杂交时加有变性剂，如50％(v/v)甲酰胺，0.1％小牛血清/0.1％ Ficoll，42℃等；或(3)仅在两条序列之间的同源性至少在90％以上，更好是95％以上时才发生杂交。并且，可杂交的多核苷酸编码的蛋白质与SEQ ID NO2所示的成熟蛋白质有相同的生物学功能和活性。
本发明还涉及与上述的序列杂交的核酸片段。如本文所用，“核酸片段”的长度至少含15个核苷酸，较好是至少30个核苷酸，更好是至少50个核苷酸，最好是至少100个核苷酸以上。核酸片段可用于核酸的扩增技术(如PCR)以确定和/或分离编码蚯蚓纤溶酶Z的多聚核苷酸。
本发明中的蛋白质和多核苷酸优选以分离的形式提供，更佳地被纯化至均质。
本发明的蚯蚓纤溶酶Z核苷酸全长序列或其片段通常可以用PCR扩增法、重组法或人工合成的方法获得。对于PCR扩增法，可根据本发明所公开的有关核苷酸序列，尤其是开放阅读框序列来设计引物，并用市售的cDNA库或按本领域技术人员已知的常规方法所制备的cDNA库作为模板，扩增而得到有关序列。也可直接通过RT-PCR的方法扩增得到有关序列。当序列较长时，常常需要进行两次或多次PCR扩增，然后再将各次扩增出的片段按正确次序拼接在一起。
一旦获得了有关的序列，就可以用重组法来大批量地获得有关序列。这通常是将其克隆入载体，再转入细胞，然后通过常规方法从增殖后的宿主细胞中分离得到有关序列。
此外，还可用人工合成的方法来合成有关序列，尤其是片段长度较短时。通常，通过先合成多个小片段，然后再进行连接可获得序列很长的片段。
目前，已经可以完全通过化学合成来得到编码本发明蛋白质(或其片段，或其衍生物)的DNA序列。然后可将该DNA序列引入本领域中已知的各种现有的DNA分子(或如载体)和细胞中。此外，还可通过化学合成将突变引入本发明蛋白质序列中。
应用PCR技术扩增DNA/RNA的方法(Saiki，et al.Science 1985；2301350-1354)被优选用于获得本发明的基因。特别是很难从文库中得到全长的cDNA时，可优选使用RACE法(RACE-cDNA末端快速扩增法)，用于PCR的引物可根据本文所公开的本发明的序列信息适当地选择，并可用常规方法合成。可用常规方法如通过凝胶电泳分离和纯化扩增的DNA/RNA片段。
本发明也涉及包含本发明的多核苷酸的载体，以及用本发明的载体或蚯蚓纤溶酶Z编码序列经基因工程产生的宿主细胞，以及经重组技术产生本发明所述蛋白质的方法。
通过常规的重组DNA技术(Science，1984；2241431)，可利用本发明的多聚核苷酸序列可用来表达或生产重组的蚯蚓纤溶酶Z蛋白质。一般来说有以下步骤(1).用本发明的编码蚯蚓纤溶酶Z蛋白质的多核苷酸(或变异体)，或用含有该多核苷酸的重组表达载体转化或转导合适的宿主细胞；(2).在合适的培养基中培养的宿主细胞；(3).从培养基或细胞中分离、纯化蛋白质。
本发明中，蚯蚓纤溶酶Z多核苷酸序列可插入到重组表达载体中。术语“重组表达载体”指本领域熟知的细菌质粒、噬菌体、酵母质粒、植物细胞病毒、哺乳动物细胞病毒如腺病毒、逆转录病毒或其他载体。在本发明中适用的载体包括但不限于在细菌中表达的基于T7的表达载体(Rosenberg，et al.Gene，1987，56125)；在哺乳动物细胞中表达的pMSXND表达载体(Lee and Nathans，J Bio Chem.2633521，1988)和在昆虫细胞中表达的来源于杆状病毒的载体。总之，只要能在宿主体内复制和稳定，任何质粒和载体都可以用。表达载体的一个重要特征是通常含有复制起点、启动子、标记基因和翻译控制元件。
本领域的技术人员熟知的方法能用于构建含蚯蚓纤溶酶Z编码DNA序列和合适的转录/翻译控制信号的表达载体。这些方法包括体外重组DNA技术、DNA合成技术、体内重组技术等(Sambroook，et al.Molecular Cloning，a Laboratory Manual，cold Spring Harbor Laboratory.New York，1989)。所述的DNA序列可有效连接到表达载体中的适当启动子上，以指导mRNA合成。这些启动子的代表性例子有大肠杆菌的lac或trp启动子；λ噬菌体PL启动子；真核启动子包括CMV立即早期启动子、HSV胸苷激酶启动子、早期和晚期SV40启动子、反转录病毒的LTRs和其他一些已知的可控制基因在原核或真核细胞或其病毒中表达的启动子。表达载体还包括翻译起始用的核糖体结合位点和转录终止子。
此外，表达载体优选地包含一个或多个选择性标记基因，以提供用于选择转化的宿主细胞的表型性状，如真核细胞培养用的二氢叶酸还原酶、新霉素抗性以及绿色荧光蛋白(GFP)，或用于大肠杆菌的四环素或氨苄青霉素抗性。
包含上述的适当DNA序列以及适当启动子或者控制序列的载体，可以用于转化适当的宿主细胞，以使其能够表达蛋白质。
宿主细胞可以是原核细胞，如细菌细胞；或是低等真核细胞，如酵母细胞；或是高等真核细胞，如哺乳动物细胞。代表性例子有大肠杆菌，链霉菌属；鼠伤寒沙门氏菌的细菌细胞；真菌细胞如酵母；植物细胞；果蝇S2或Sf9的昆虫细胞；CHO、COS、293细胞、或Bowes黑素瘤细胞的动物细胞等。
本发明的多核苷酸在高等真核细胞中表达时，如果在载体中插入增强子序列时将会使转录得到增强。增强子是DNA的顺式作用因子，通常大约有10到300个碱基对，作用于启动子以增强基因的转录。可举的例子包括在复制起始点晚期一侧的100到270个碱基对的SV40增强子、在复制起始点晚期一侧的多瘤增强子以及腺病毒增强子等。
本领域一般技术人员都清楚如何选择适当的载体、启动子、增强子和宿主细胞。
用重组DNA转化宿主细胞可用本领域技术人员熟知的常规技术进行。当宿主为原核生物如大肠杆菌时，能吸收DNA的感受态细胞可在指数生长期后收获，用CaCl2法处理，所用的步骤在本领域众所周知。另一种方法是使用MgCl2。如果需要，转化也可用电穿孔的方法进行。当宿主是真核生物，可选用如下的DNA转染方法磷酸钙共沉淀法，常规机械方法如显微注射、电穿孔、脂质体包装等。
获得的转化子可以用常规方法培养，表达本发明的基因所编码的蛋白质。根据所用的宿主细胞，培养中所用的培养基可选自各种常规培养基。在适于宿主细胞生长的条件下进行培养。当宿主细胞生长到适当的细胞密度后，用合适的方法(如温度转换或化学诱导)诱导选择的启动子，将细胞再培养一段时间。
在上面的方法中的重组蛋白质可在细胞内、或在细胞膜上表达、或分泌到细胞外。如果需要，可利用其物理的、化学的和其它特性通过各种分离方法分离和纯化重组的蛋白。这些方法是本领域技术人员所熟知的。这些方法的例子包括但并不限于常规的复性处理、用蛋白沉淀剂处理(盐析方法)、离心、渗透破菌、超处理、超离心、分子筛层析(凝胶过滤)、吸附层析、离子交换层析、高效液相层析(HPLC)和其它各种液相层析技术及这些方法的结合。
重组的蚯蚓纤溶酶Z或蛋白质有多方面的用途。这些用途包括(但不限于)直接做为药物治疗血栓栓塞性疾病的疾病，和用于筛选促进或对抗蚯蚓纤溶酶Z功能的抗体、蛋白质或其它配体。用表达的重组蚯蚓纤溶酶Z筛选蛋白质库可用于寻找有治疗价值的能抑制或刺激蚯蚓纤溶酶Z功能的蛋白质分子。
另一方面，本发明还包括对蚯蚓纤溶酶Z DNA或是其片段编码的蛋白质具有特异性的多克隆抗体和单克隆抗体，尤其是单克隆抗体。这里，“特异性”是指抗体能结合于蚯蚓纤溶酶Z基因产物或片段。较佳地，指那些能与蚯蚓纤溶酶Z基因产物或片段结合但不识别和结合于其它非相关抗原分子的抗体。本发明中抗体包括那些能够结合并抑制蚯蚓纤溶酶Z的分子，也包括那些并不影响蚯蚓纤溶酶Z功能的抗体。本发明还包括那些能与修饰或未经修饰形式的蚯蚓纤溶酶Z基因产物结合的抗体。
本发明不仅包括完整的单克隆或多克隆抗体，而且还包括具有免疫活性的抗体片段，如Fab′或(Fab)2片段；抗体重链；抗体轻链；遗传工程改造的单链Fv分子；或嵌合抗体，如具有鼠抗体结合特异性但仍保留来自人的抗体部分的抗体。
本发明的抗体可以通过本领域内技术人员已知的各种技术进行制备。例如，纯化的蚯蚓纤溶酶Z基因产物或者其具有抗原性的片段，可被施用于动物以诱导多克隆抗体的产生。与之相似的，表达蚯蚓纤溶酶Z或其具有抗原性的片段的细胞可用来免疫动物来生产抗体。本发明的抗体也可以是单克隆抗体。此类单克隆抗体可以利用杂交瘤技术来制备(见Kohler等人，Nature 256；495，1975；Kohler等人，Eur.J.Immunol.6511，1976；Kohler等人，Eur.J.Immunol.6292，1976；Hammerling等人，In Monoclonal Antibodies and T Cell Hybridomas，Elsevier，N.Y.，1981)。本发明的各类抗体可以利用蚯蚓纤溶酶Z基因产物的片段或功能区，通过常规免疫技术获得。这些片段或功能区可以利用重组方法制备或利用蛋白质合成仪合成。与蚯蚓纤溶酶Z基因产物的未修饰形式结合的抗体可以用原核细胞(例如E.Coli)中生产的基因产物来免疫动物而产生；与翻译后修饰形式结合的抗体(如糖基化或磷酸化的蛋白或多肽)，可以用真核细胞(例如酵母或昆虫细胞)中产生的基因产物来免疫动物而获得。
利用本发明蚯蚓纤溶酶Z，通过各种常规筛选方法，可筛选出与蚯蚓纤溶酶Z发生相互作用的物质，如受体、抑制剂、激动剂或拮抗剂等。
本发明蚯蚓纤溶酶Z及其抗体、抑制剂、激动剂、或拮抗剂等，当在治疗上进行施用(给药)时，可提供不同的效果。通常，可将这些物质配制于无毒的、惰性的和药学上可接受的水性载体介质中，其中pH通常约为5-8，较佳地pH约为6-8，尽管pH值可随被配制物质的性质以及待治疗的病症而有所变化。配制好的药物组合物可以通过常规途径进行给药，其中包括(但并不限于)肌内、腹膜内、静脉内、皮下、皮内、或局部给药。
本发明的蛋白质可直接用于疾病治疗，例如，用于血栓方面的治疗。在使用本发明蚯蚓纤溶酶Z时，还可同时使用其他治疗剂，如抗肿瘤药物等。
本发明还提供了一种药物组合物，它含有安全有效量的本发明蚯蚓纤溶酶Z蛋白质以及药学上可接受的载体或赋形剂。这类载体包括(但并不限于)盐水、缓冲液、葡萄糖、水、甘油、乙醇、及其组合。药物制剂应与给药方式相匹配。本发明的药物组合物可以被制成针剂形式，例如用生理盐水或含有葡萄糖和其他辅剂的水溶液通过常规方法进行制备。诸如片剂和胶囊之类的药物组合物，可通过常规方法进行制备。药物组合物如针剂、溶液、片剂和胶囊宜在无菌条件下制造。活性成分的给药量是治疗有效量，例如每天约0.1微克/千克体重-约5毫克/千克体重。此外，本发明的蛋白质还可与其他治疗剂一起使用。
使用药物组合物时，是将安全有效量的蚯蚓纤溶酶Z施用于哺乳动物，其中该安全有效量通常至少约10微克/天，而且在大多数情况下不超过约8毫克/千克体重，较佳地该剂量是约10微克/天-约1毫克/千克体重。当然，具体剂量还应考虑给药途径、病人健康状况等因素，这些都是熟练医师技能范围之内的。
一种检测检测样品中是否存在蚯蚓纤溶酶Z的方法是利用蚯蚓纤溶酶Z的特异性抗体进行检测，它包括将样品与蚯蚓纤溶酶Z特异性抗体接触；观察是否形成抗体复合物，形成了抗体复合物就表示样品中存在蚯蚓纤溶酶Z。
本发明的优点在于蚯蚓中含有10多种的纤溶酶。从蚯蚓中分离纯化其中的一种成分至单一的纯度，在工艺上有一定的难度。本发明克隆到蚯蚓纤溶酶Z基因，分析测定了其基因序列，并成功地进行了表达。这些研究成果，不仅为今后开发研究基因工程产品创造了良好的条件，也为今后开发蚯蚓纤溶酶针剂提供了必要的化学结构资料。此外，本发明的蚯蚓纤溶酶Z为治疗血栓栓塞性疾病等疾病提供新的治疗途径，因而具有巨大的应用前景。
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如Sambrook等人，分子克隆实验室手册(New YorkCold SpringHarbor Laboratory Press，1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。
实施例1从蚯蚓中分离纯化天然的蚯蚓纤溶酶Z在本实施例中，采用了以下4种蚯蚓种类钜齿远蚓(Amynthasdancatala)、赤子爱胜蚓(Eisenia faetide)、壮伟远环蚓(Amynthas robustus)、威廉腔环蚓(Metaphire guillelmi)。在本实施例及以下实施例中，除非特别注明，否则指以上四种蚯蚓。
取鲜活蚯蚓若干，经机械粉碎，迅速冷却至4-10摄氏度。加入一倍体积的有机溶剂(丙酮)，低温萃取出脂质、水分、可溶性蛋白质、盐等杂质。10000rpm冷冻离心，并收集沉淀。沉淀中加入等体积的水，搅拌10分钟，10000rpm冷冻离心，收集上清液。上清液经过滤，采用冷冻干燥法将其冻干。取少量冻干固体进行分析，在FPLC图谱上出现9-12个蛋白峰，按照出峰时间的不同，相互有所区别，这些峰为蚯蚓纤溶酶的同工酶，其中第三个峰具有最显著的纤溶酶活性。用蒸馏水溶解，经离子交换柱，亲和层析柱，分子筛柱等多步分离纯化，得到蚯蚓纤溶酶精制样品。样品经HPLC法，或SDS电泳分析，呈现单一条带。然后，对该蚯蚓纤溶酶用质谱测定测定分子量，结果为25125.0道尔顿。该酶被命名为蚯蚓纤溶酶Z。在测试的4种蚯蚓中都含有这种蚯蚓纤溶酶Z，这表明蚯蚓纤溶酶Z是一种普遍存在的纤溶酶。
实施例2蚯蚓纤溶酶Z的纯化和N端10个氨基酸序列的测定鲜活蚯蚓洗净后，搅碎。利用有机溶剂沉淀法制得蚯蚓纤溶酶粗制剂。接着通过Sephadex G-75，DEAE-Sepharose CL-6B及Mono Q柱分离，纯化到蚯蚓纤溶酶Z样品。纯化的蚯蚓纤溶酶Z样品在PE491蛋白质测序仪上经过10个循环，测得如下N端序列ILGGTHARVG。
实施例3引物的设计和合成据实施例2中测定的蚯蚓纤溶酶Z的N端的序列，设计上游寡核苷酸引物为5′ATGAATCCATGATC C TGGGAG(T) GG(ATC)ACG(ACT)A(GC)A3′(SEQ ID NO6)，并在成熟蛋白的N端加上了起始密码子和BamHI位点，以利于该基因的表达研究和操作。由于迄今为止缺乏蚯蚓纤溶酶C端及其基因下游的任何信息，本发明人用3′RACE方法克隆该基因。下游引物为5′GACCACGCGTATCGATGTCG AC3′(SEQID NO3)。引物的合成委托上海生工生物工程公司完成。
实施例4总RNA的提取取威廉腔环蚓一条，在液氮中研磨成粉末。取200mg粉末，加入4mL溶液D(含4mol/L异硫氰酸胍，25m mol/L柠檬酸钠，pH 7.0；5％十二烷基肌氨酸钠，0.1mol/Lβ-巯基乙醇)，充分匀浆后，将溶液转移至离心管中，4℃，12,000g离心5分钟。上清吸入新的离心管中，加入0.4mL 2mol/L NaAc，Ph 4.0，4mL水饱和酚和2mL氯仿∶异戊醇(49∶1)混合物，充分振荡后，冰浴15min。4℃，10,000g离心20min。取上层水相与等体积异丙醇混匀，-20℃放置1h。4℃，10,000g离心20min收集沉淀.沉淀重溶于2mL溶液D中，65℃温育2-3min，使其充分溶解，加入0.2mL 2mol/L NaAc，pH4.0和2mL异丙醇，混匀后-20℃放置1h。4℃，10,000g离心20min，沉淀用75％乙醇洗涤后，敞口于空气中放置数分钟，使乙醇充分挥发干净。最后溶于DEPC(焦碳酸二乙酯)处理过的灭菌水30μL中。取1μL测RNA的OD260/OD280，1μL走甲醛变性电泳，以确定RNA的纯度和完整性。
实施例5RT-PCR扩增蚯蚓纤溶酶Z基因以实施例4中制得的威廉腔环蚓总RNA为模板，用宝林曼公司3′RACE KIT反转录，操作按说明书进行。
使用实施例3中合成的引物，从上述所得的cDNA为模板，进行PCR扩增。总反应体系为50μL，其中MgCl2的终浓度为1.5m mol/L，dNTP的终浓度为200μmol/L。引物浓度为30n mol/L，Tag酶2单位(购自Gibco BRL公司)。反应条件为先94℃变性3min，。然后进入循环，。94℃，变性1min；50℃退火min；72℃延伸1.5min，进行30个循环，最后在72℃保温10min。PCR产物取5μL进行1％的琼脂糖电泳检查，扩增出一条约1000bp的DNA片段(见
图1)。产物以氯仿抽提，乙醇沉淀回收，溶于10μL的灭菌水中。
实施例6蚯蚓纤溶酶Z基因的克隆由于扩增的是一个未知序列的核酸，为避免基因内部出现巧合的酶切位点导致基因被切割而破坏其完整性，用T-载体进行克隆。
1)T-载体的制备载体pBluescript-SK(购自Stratagene公司)1μg用EcoRI切割，等体积酚氯仿处理，乙醇沉淀，溶于50μL体系中，内含10×PCR缓冲液5μL，100m mol/L dNTP2μL，Taq酶1单位。在70℃保温2h，等体积的酚∶氯仿处理，乙醇沉淀后，溶于10μL灭菌水。
2)取PCR回收产物2μL与自制T-载体1μL连接，转化，经兰白斑筛选，酶切和PCR鉴定，获得阳性克隆。
实施例7兔抗蚯蚓纤溶酶Z抗体的制备取体重为2公斤左右的雄性新西兰大耳兔一只。以1mg蚯蚓纤溶酶Z样品加弗氏完全佐剂研磨成乳胶状，在兔劲部多点注射。饲养半个月后，以1mg蚯蚓纤溶酶Z样品加弗氏不完全佐剂研磨成乳胶状，再在兔劲部多点注射。一个月后，用1.5mg蚯蚓纤溶酶Z样品加弗氏不完全佐剂以同样的方法加强免疫。半个月后，再用1mg蚯蚓纤溶酶Z样品加弗氏不完全佐剂再次加强免疫。饲养半个月后，劲动脉取血，4℃静置过夜，2,000转离心3分钟。上层血清即为兔抗蚯蚓纤溶酶Z抗体。
实施例8纤溶酶Z基因的鉴定实施例6中获得的阳性克隆委托上海基康生物技术公司测定。基因全序列和编码的蛋白质序列见图2。该基因示于SEQ ID NO1，长924个bp，其中读码框长723bp(第1～723位)，编码241个氨基酸(SEQ ID NO2)。723个bp以后为3′-非翻译区，有两个polyA加尾信号AATAAA。
蚯蚓纤溶酶Z cDNA编码的蛋白质序列与另一个被称为Lumbricus bimastus的cDNA编码的蛋白质序列同源性达54％。因此，这是一个新的未见报道的蚯蚓纤溶酶基因。从这个新基因所编码的氨基酸序列，经电脑软件DNASTAR所计算的分子量为25138.10，这与从蚯蚓中所提取的纤溶酶Z的分子量大小是吻合的。
实施例9蚯蚓纤溶酶Z的表达和鉴定在该实施例中，为进一步证实该基因的确编码了蚯蚓纤溶酶Z，将该基因的翻译区在原核表达载体pET-28a(+)(Novagen公司)中表达，用实施例7中制得的兔抗蚯蚓纤溶酶Z抗体与表达产物进行Western杂交鉴定。其中质粒构建图谱见图3，表达的结果见图4。
(1)表达根据全基因序列另合成两条引物，以便于在pET-28a(+)中表达上游引物为5′GCGAATTCATCCTGGGAGGGACGAAA3′(引物3)(SEQ ID NO4)，下游引物为5′CACTCGAGTTAGTGCAGTCGGCTCCA3′(引物4)(SEQ ID NO5)。以全长cDNA为模板，如上所述进行PCR扩增。扩增产物EcoRI/XhoI酶切后克隆于pET-28a(+)的EcoRI/XhoI位点中，酶切的阳性克隆经测序确保无误之后，质粒转化于菌株BL21(DE3)中。待细菌的OD600到0.6后加入IPTG至1m mol/L诱导基因的表达。2.5小时后离心，收集菌体进行SDS-PAGE，考马斯亮蓝R-250染色。
(2)Western印迹SDS-PAGE结束后，取下电泳胶在冰浴的条件下100V电转2h至尼龙膜上。将膜放入杂交袋，加入5mL封闭液(5％脱脂奶粉的磷酸盐缓冲液)，在摆动平台上摇动1h.。用封闭液以1∶1000稀释第一抗体(实施例7中制得的兔抗蚯蚓纤溶酶Z抗体)。打开杂交袋，倒掉封闭液，加入稀释好的第一抗体，摇动1h.。用磷酸盐缓冲液洗涤尼龙膜3次，每次15min。将洗涤好的膜与封闭液稀释好的羊抗兔碱性磷酸酶(1∶3000稀释)杂交1h.。膜用碱性磷酸酶缓冲液(100mmol/LTris-HCl，pH 9.5，5mmol/L MgCl2，100mmol/L NaCl)洗涤后，用BCIP/NBT(5-溴-4-氯-3-一吲哚磷酸/氮蓝四唑)显色。
杂交结果显示，表达的蛋白质与蚯蚓纤溶酶Z抗体专一性地结合(见图4)。
实施例10不同来源蚯蚓纤溶酶的活性测定按Deogny等人所描述的纤维蛋白平板法(Clinica ChimicaActa，1975，60，85)，根据溶圈的面积大小计算蚯蚓纤溶酶的活性。所采用的样品为赤子爱胜蚓纤溶酶及蚯蚓纤溶酶Z，活力测定的结果分别为赤子爱胜蚓纤溶酶为21,000mm2/mg蛋白质，蚯蚓纤溶酶为Z 33,000mm2/mg蛋白质。
在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
序列表(1)一般信息(ii)发明名称新的纤溶酶、其编码序列及用途(iii)序列数目6(2)SEQ ID NO1的信息(i)序列特征(A)长度979bp(B)类型核酸(C)链性双链(D)拓扑结构线性(ii)分子类型cDNA(xi)序列描述SEQ ID NO1ATCCTGGGAG GGACGAAAGC CAGAGTTGGA GAGATCCCAT GGCAGCTGTC GCAGCAGAGA 60GGCGGAAGTC ACAGCTGCGG AGCGTCTCTT CTCAGGCCCG GTTCGGCCCT CAGCGCCGCT 120CACTGCGTTG ACGGAGCACC GCCAGCAGAT GTGCGAATTG TCGCTGGACT TCATTTGCGC 180TCAGATGAAT CCACTGCAGT GGCTTCCCTT GCTGAGAGTT TCCTAATTCA CCCGAGTTAC 240AACGTTGGAG AAGGAACTTT CCCCAACGAC ATCGCCATCA TCTACCTATT AACAAATATC 300AACTCTGCTC CAGTAGAAAA CATCGATTTT GCTCTTCTAC CTCCAGACAA CGTCGAGCAA 360TTCGTCGGAT TTACTTGCGT GCTCAGTGGA TGGGGACGCA CATCGGCCAG CAATGTACTT 420CCCGATGCCC TGCAGAAGGT CAGCATCGAC GTCATCACCA CAGCCGAATG CGACTCACGC 480ATGGCCGCTG TTGCTGGAGC CGACTGCACT GATGCTCACA TCGCCGTCTT CGATCCCGCT 540TTGCAGAAAG GATCGTGCAA CGGTGATAGC GGTGGCCCAA TGAACTGCCC TCTGAGCGGT 600GAATTTGTGG TTGCTGGTGT GACGTCATGG GGAATTTCGG GAGGCGGTGC CTGTCTGCCA 660GAATACCCAT CAGTCTACAC CAGAACAGGA TTCTACCGTC AATGGATCCT TGACAACATT 720CGCTAGACTG ACTCAGTCGT CCATTCGTCT ATGCCGGAAC CATGTTCTAC AGCGGACGGA 780TCACGGACAC CGTCCTTCAA ATTATAAAGA AATTACTGAA GAGCTTTGAA TAATAATGCA 840GACTTTAACT TCAAGTGCCC CCAACTTAGC AAGCTCCCTG TTTATCCATT GTGAATAAAT 900CAGAATAAAG ACGGCAAAAA AAAAAAAAAA GTCGACATCG ATACGCGTGG TCAATCAAGC 960TTATCGATAC CGGCGACCT 979(2)SEQ ID NO2的信息(i)序列特征(A)长度241个氨基酸(B)类型氨基酸(D)拓扑结构线性(ii)分子类型蛋白质(xi)序列描述SEQ ID NO2ILGGTKARVG EIPWQLSQQR GGSHSCGASL LRPGSALSAA HCVDGAPPAD 50VRIVAGLHLR SDESTAVASL AESFLIHPSY NVGEGTFPND IAIIYLLTNI 100NSAPVENIDF ALLPPDNVEQ FVGFTCVLSG WGRTSASNVL PDALQKVSID 150VITTAECDSR MAAVAGADCT DAHIAVFDPA LQKGSCNGDS GGPMNCPLSG 200EFVVAGVTSW GISGGGACLP EYPSVYTRTG FYRQWILDNI R 241(2)SEQ ID NO3的信息(i)序列特征(A)长度22碱基(B)类型核酸(C)链性单链(D)拓扑结构线性(ii)分子类型寡核苷酸(xi)序列描述SEQ ID NO 3GACCACGCGT ATCGATGTCG AC 22(2)SEQ ID NO4的信息(i)序列特征(A)长度26碱基(B)类型核酸(C)链性单链(D)拓扑结构线性(ii)分子类型寡核苷酸(xi)序列描述SEQ ID NO4GCGAATTCAT CCTGGGAGGG ACGAAA 26(2)SEQ ID NO5的信息(i)序列特征(A)长度26碱基(B)类型核酸(C)链性单链(D)拓扑结构线性(ii)分子类型寡核苷酸(xi)序列描述SEQ ID NO5CACTCGAGTT AGTGCAGTCG GCTCCA26(2)SEQ ID NO6的信息(i)序列特征(A)长度28碱基(B)类型核酸(C)链性单链(D)拓扑结构线性(ii)分子类型寡核苷酸(xi)序列描述SEQ ID NO6ATGAATCCAT GATCCTGGGA G(T) GG (ATC) ACG (ACT) A (GC) A 28
权利要求
1.一种分离的蚯蚓纤溶酶Z蛋白质，其特征在于，它包含具有SEQ ID NO2氨基酸序列的蛋白质、或其保守性变异蛋白质、或其活性片段、或其活性衍生物。
2.如权利要求1所述的蛋白质，其特征在于，该蛋白质是具有SEQ ID NO2氨基酸序列的蛋白质。
3.一种分离的多核苷酸，其特征在于，它编码权利要求1所述的蚯蚓纤溶酶Z。
4.如权利要求3所述的多核苷酸，其特征在于，该多核苷酸编码具有SEQ ID NO2所示氨基酸序列的蛋白质。
5.如权利要求3所述的多核苷酸，其特征在于，该多核苷酸含有SEQ ID NO1中1-723位的序列。
6.一种载体，其特征在于，它含有权利要求3所述的多核苷酸。
7.一种遗传工程化的宿主细胞，其特征在于，它含有权利要求6所述的载体。
8.一种具有蚯蚓纤溶酶Z蛋白质活性的蛋白质的制备方法，其特征在于，该方法包含(a)在适合表达蚯蚓纤溶酶Z的条件下，培养权利要求7所述的宿主细胞；(b)从培养物中分离出具有蚯蚓纤溶酶Z蛋白质活性的蛋白质。
9.一种能与权利要求1所述的蚯蚓纤溶酶Z特异性结合的抗体。
10.一种药物组合物，其特征在于，它含有安全有效量的权利要求1所述的蛋白质以及药学上可接受的载体。
全文摘要
本发明提供了一种新的纤溶酶－蚯蚓纤溶酶Z,编码蚯蚓纤溶酶Z的多核苷酸和经重组技术产生这种蚯蚓纤溶酶Z的方法。本发明还公开了此蚯蚓纤溶酶Z用于治疗多种疾病的方法,如用于血栓栓塞性疾病等疾病。本发明还提供了含蚯蚓纤溶酶Z的药物组合物。
文档编号C12N9/64GK1361280SQ0013778
公开日2002年7月31日 申请日期2000年12月29日 优先权日2000年12月29日
发明者周元聪, 钟晓燕, 朱洪 申请人:中国科学院上海生物化学研究所