在酵母系统高密度发酵生产重组蚯蚓纤溶酶pi239的方法以及工程菌的制作方法

专利名称：在酵母系统高密度发酵生产重组蚯蚓纤溶酶pi239的方法以及工程菌的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种在酵母系统高密度发酵生产重组蚯蚓纤溶酶的方法，特别是一种在酵母系统高密度发酵生产重组蚯蚓纤溶酶PI239的方法以及工程菌背景技术血栓栓塞性疾病包括心肌梗塞、中风、肺栓塞等现已成为世界十大致死性疾病之首，我国近十年来此类疾病的发病率逐年上升，因此适用于治疗此类疾病的溶血栓药物的研制已越来越受到医药界的重视。蚯蚓纤溶酶是从蚯蚓中提取的具有纤溶活性的一类蛋白水解酶，目前国内已有蚯蚓粗提物口服制剂的商品上市，临床证实其对于治疗血栓性病症具有明显的疗效。但目前此类的生产受到蚯蚓繁殖周期的限制，并且生产工艺较复杂。
2001年Sugimoto首次在P.pastoris中成功表达了蚓激酶F-III-2[2]，此后有研究表明多种蚓激酶在酵母与大肠杆菌中进行了重组表达[1，3，4]，近来还有人利用生物反应器在羊奶中表达了蚓激酶[5]。尽管这些报道都表明其得到了有活性的重组蛋白，但对于表达的条件及高密度发酵生产重组蛋白的方法却鲜有提及。
本申请人利用生物信息学的方法设计引物，从我国特有的双胸属蚯蚓(Lunbricus bimanstus)体内获得一种蚯蚓纤溶酶的基因(命名为PI239GenBank AF433650)，该基因编码283个氨基酸，成熟肽由239个氨基酸组成，得到的是包括蛋白信号肽在内的以ATG起始的完整基因。
本发明的目的是提供在酵母系统高密度发酵生产重组蚯蚓纤溶酶的方法PI239及工程菌，通过对酵母系统筛选以及表达，发酵，纯化工序的选择，生产了重组蚯蚓纤溶酶PI239。
为达到上述目的，本发明采用以下技术方案一种在酵母系统高密度发酵生产重组蚯蚓纤溶酶PI239的方法包括以下步骤(1)、通过化学合成方法或应用PCR技术扩增DNA/RDA方法获得蚯蚓纤溶酶PI239的DNA序列；(2)、含有目的基因的分泌性酵母表达重组质粒的构建表达载体为T7；(3)将重组质粒大量提取和纯化；
(4)、酵母感受态细胞的制备；(5)、线性化重组质粒电穿孔转化感受态酵母细胞；(6)、双层滤膜法筛选高表达株，并放大培养；(7)、阳性克隆的诱导表达及筛选PI239蛋白在酵母中以α-factor信号肽蛋白引导的分泌表达；(8)、以高活性克隆株为种子菌进行高密度发酵生产重组蚯蚓纤溶酶PI239；(9)、重组蚯蚓纤溶酶PI239纯化。
所述的蚯蚓纤溶酶PI239的DNA序列采用PCR扩增方法，扩增用上游引物P1序列为5’-gaattcattgtcggaggaattgaagc-3’下游引物P2为5’-gctctagagcattagttgttggtgatgatgtctg-3’，PCR扩增时以pPT-239为模板，该模板系克隆载体pGEM-T上连接蚯蚓纤溶酶PI239的DNA；所述的含有目的基因的分泌性酵母表达重组质粒的构建表达载体采用pPICZα(A)载体，构建的方式是将纯化后得到的PCR产物分别用EcoR I和XbaI双酶切，且同位于载体上第941-1207bp间的来自酿酒酵母的α-factor信号肽同框，切下目的基因片断经玻璃奶纯化后，和同样处理的分泌型酵母表达载体pPICZα(A)载体进行连接，获得pPICPI239重组质粒；所用的酵母菌为KM71；所述的以高活性克隆株为种子菌进行高密度发酵生产重组蛋白，其中，有一高表达株，其分类命名为巴氏毕赤酵母(Pichia pastoris)，微生物株pPICPI239/KM71-48，保藏号为CGMCC No1515，保藏单位为中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心。
方法中采用双层滤膜法筛选高表达工程株，利用摇瓶发酵法分析克隆株表达的重组蛋白的纤溶活性，目的是筛选到表达水平高并且所表达重组蛋白纤溶活性高的表达株，在获得高表达株后在摇瓶水平对其表达条件进行了优化。我们对所筛选得到的高表达株进行了高密度发酵表达，结果表明高密度发酵时重组蚓激酶蛋白的产量是摇瓶发酵时的4倍以上，粗蛋白量可以达到174mg/L，基本达到高密度发酵所应达到的表达水平。随后我们对rPI239进行了纯化，建立了有效的纯化路线。
在细菌中表达的载体基于T7的表达载体(Rosenberg，et al.Gene，1987，56125)。
本发明的优点本发明克隆到蚯蚓纤溶酶PI239基因，分析测定了基因序列，并成功地进行了表达，本发明还提供了工程菌pPICPI239/KM71-48。这些研究成果，不仅为今后开发研究基因工程产品创造了良好的条件，也为今后开发蚯蚓纤溶酶针剂提供了必要的化学结构资料。此外，本发明的蚯蚓纤浴酶PI239为治疗血栓栓塞性疾病药物提供新的蛋白，因而蚯蚓纤溶酶PI239具有巨大的应用前景。
表1蚯蚓纤溶酶PI239基因序列表(见后)表248号克隆发酵罐与摇瓶表达上清液中总蛋白量的比较表


图1含有目的基因的分泌性酵母表达重组质粒的构建2重组酵母表达质粒的酶切鉴定结果图3重组表达酵母菌株的PCR鉴定图4双层滤膜筛选高表达工程菌结果图5诱导后高密度发酵上清液的第1-6天样品SDS-PAGE分析图6诱导后第6天高密度发酵上清的Western blot分析图748号克隆高密度发酵的产物超滤浓缩50倍后纤溶活性(作用16h检测)图1中，1质粒pPICPI239，2pPICPI239(EcoRI/XbaI)，3pPICPI239(EcoRI)，4DNA分子量标准DL2,000.
图2中，1pPICZα(A)/KM71的PCR产物(A)(590bp)；2DNA分子量标准DL2,000；3pPICPI239/KM71的PCR产物(1.3Kb)图3中，1pPICZα(A)/KM71的PCR产物(A)(590bp)；2NA分子量标准DL2,000；3pPICPI239/KM71的PCR产物(1.3Kb)图4中，箭头所指为高表达株的阳性杂交信号(着色较深)图5中，1低分子量蛋白标准(108，85，45，36，26，20KDa)；2诱导前(培养48小时)；3-8Kppe48号诱导后第1，2，3，4，5，6天上清浓缩样品；3KM71/pPICZαA转化株诱导后第5天样品上清。
图6中1预染蛋白分子量标准；2Kppe48号上清浓缩样品(超滤浓缩至原始体积的1/50)；3KM71/pPICZαA转化株诱导后第5天样品上清图7中，1-6号分别为48号克隆发酵上清的第1-6天样品；N分别为KM71/pPICZα(A)转化株第5天样品上清，阳性对照为5，6，7，8，10IU/ml的尿激酶阳性对照(加样10μl)具体实施方式
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。这些实施例仅用于说明本发明，而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如sambrook等人.分子克降实验室手册(NewYorkcold spring Harbor Laboratory)，Press，1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。
1.从蚯蚓中分离纯化天然的蚯蚓纤溶酶PI239在本实施例中，采用了蚯蚓Lumbricus bimastus。
取鲜活蚯蚓若干，经机械粉碎，迅速冷却至4-10摄氏度·加入一倍体积的有机溶剂(丙酮)，低温萃取出脂质、水分、可溶性蛋白质、盐等杂质，10000rpm冷冻离心，并收集沉淀。沉淀中加入等体积的水，搅拌10分钟，10000rpm冷冻离心，收集上清液。上清液经过滤，采用冷冻干燥法将其冻干。取少量冻干固体进行分析，用蒸馏水溶解，经离子交换柱。亲和层析柱，分子筛柱等多步分离纯化得到蚯蚓纤溶酶精制样品，其在SDS-PAGE电泳显示三条带，其中一条的纤溶活性最强，命名为PI239，理论分子量为25.481KDa。
2.小鼠抗蚯蚓纤溶酶PI239抗体的制备取体重为180g左右的雄性Balb/C一只.以0.1mg蚯蚓纤溶酶PI239精制样品加弗氏完全佐剂研磨成乳胶状，在鼠颈部多点注射。饲养半个月后，以0.11mg蚯蚓纤溶酶PI239精制样品加弗氏不完全佐剂研磨成乳胶状，再在鼠颈部多点注射。一个月后，用0.15mg蚯蚓纤溶酶PI239精制样品加弗氏不完全佐剂以同样的方法加强免疫。半个月后，再用0.1mg蚯蚓纤溶酶PI239精制样品加弗氏不完全佐剂再次加强免疫。饲养半个月后，颈动脉取血，4℃静置过夜，2,000转离心3分钟。上层血清即为鼠抗蚯蚓纤溶酶PI239抗体。
3.目的基因片断的PCR扩增利用酵母分泌表达载体pPICZα(A)表达PI239。pPICZα(A)为美国Invitrogrn公司产品。
根据PI239(GenBank AF433650)的cDNA序列合成两条引物。上游引物P1为5’-gaattcattgtcggaggaattgaagc-3’(下划线处为引入的EcoRI酶切位点)，引物对应PI239蛋白全基因的133-152位碱基，共29nt，GC含量48％，Tm58℃，共29nt；下游引物P2为5’-gctctagagcattagttgttggtgatgatgtctg-3’(下划线″-″处为XbaI位点，gc为保护碱基)，对应PI239蛋白全基因的830-852位，GC含量42％，Tm59℃共34nt。
Pfu PCR MasterMix为DNA聚合酶，PCR反应体系如下在0.2mlEppendorf管中，依次加入下列各试剂10×PCR缓冲液5ul，dNTPMix(2.5mM/each)4ul，引物P1(0.1μmol/ul)1ul，引物P2(0.1μmol/ul)1ul，PT-239模板质粒1ul，Pfu Taq酶(5u/μl)0.5ul，加无菌去离子水至50ul，充分混匀。
PCR扩增条件为94℃预变性1分钟后，进行PCR循环，94℃变性40秒，55℃退火40秒，72℃延伸90秒，30个循环后，72℃延伸7分钟，取5ul样品进行琼脂糖凝胶电泳，紫外灯下检查到739bp的PCR产物。4目的基因片段的回收使用Pharmacia公司SephaglasTMBandPrep Kit进行。将50ulPCR产物全部琼脂糖凝胶电泳，切下含目的片断的胶条，加250ul溶胶液65℃温育10min，其间不断摇动，至凝胶全部融化，加5ul玻璃奶(＜5μg DNA)充分混匀，室温放置5分钟，并不断混匀，10000rpm离心1分钟，弃上清，玻璃奶沉淀用洗涤液(或80％乙醇)洗涤2次，弃上清，沉淀在室温干燥至无水滴，加10ul洗脱液重悬沉淀，室温放置5分钟以充分溶解DNA，12000rpm离心1分钟。吸出上清，取1ul进行琼脂糖凝胶电泳定量。
5.含有目的基因的分泌性酵母表达重组质粒的构建将纯化后得到的PCR产物分别用EcoRI(载体上第1209bp)和XbaI(载体上第1271bp)双酶切(构建分泌表达载体)，且同位于载体上第941-1207bp间的来自酿酒酵母的α-factor信号肽同框，切下目的基因片断经玻璃奶纯化后，和同样处理的分泌型酵母表达载体pPICZα(A)载体进行连接，连接体系为pPICZα(EcoRI/XbaI) 1ulT4DNA连接酶缓冲液 1ul目的基因片段3ulT4DNA连接酶 1ul加去离子水至总体积l0ul。
4℃连接过夜，取5ul进行转化TOP10F’感受态细胞，感受态细胞制备以及连接产物转化、涂布抗性筛选平皿等操作步骤参见《分子克隆实验指南》第二版。挑选平皿的阳性克隆接种3ml LB(Zeocin25μl/100ml LB)液体培养基中，37℃摇床培养过夜，按常规质粒提取方法小量提取质粒DNA，并将质粒进行酶切鉴定，阳性克隆送出测序。序列测定由上海生工生物工程公司进行。
6.重组质粒大量提取和纯化取培养至对数生长后期的含重组表达质粒的细菌培养液250ml，4℃下5000g离心15分钟，弃上清，将离心管倒置使上清液全部流尽。将细菌沉淀物重新悬浮于5ml溶液I中，充分悬浮菌体细胞。加入12ml新配制的溶液II，盖紧瓶盖，缓缓地颠倒离心管数次，以充分混匀内容物，冰浴10分钟。加9ml用冰预冷的溶液III，摇动离心管数次以混匀内容物，冰上放置15分钟，此时应形成白色絮状沉淀。4℃下5000g离心15分钟。取上清液，加入50ml RNA酶A(10mg/ml)，37℃水浴20分钟。加入等体积的饱和酚/氯仿，振荡混匀，4℃下12000g离心10分钟。取上层水相，加入等体积氯仿，振荡混匀，4℃下12000g离心10分钟。取上层水相，加入1/5体积的4mol/L NaCl和10％PEG(分子量6000)，冰上放置60分钟。4℃下12000g离心15分钟，沉淀用数毫升70％冰冷乙醇洗涤，4℃下12000g离心5分钟。真空抽干沉淀，溶于500μl水中。
7.酵母感受态细胞的制备巴氏毕赤酵母KM71取液氮或-80℃保存的酵母菌株1μl涂布于YPD平皿，30℃培养2-3天，至菌落长至直径为2-3mm，挑取单克隆接种于10mlYPD，30℃，250rpm，过夜培养12-14h(大约OD达到0.7)，将此培养菌液再次接种于70mlYPD(约转化2个质粒)，30℃，250rpm，继续培养5-7h，待其OD600＝1.3-1.5时，4℃5000rpm(1500g)离心5分钟，弃去上清，沉淀分别用70ml和355ml冰冷的去离子水各洗一次后，用25ml冰冷的1M山梨醇重悬，4℃，5500rpm(1600g)离心5分钟，菌体沉淀重悬于160冰冷的1M山梨醇中(见图1)。
8.线性化重组质粒电穿孔转化感受态酵母细胞重组表达质粒及空质粒对照pPICZα(A)/pPICZ(A)各约20μg用限制性内切酶SalI酶切，酶切产物用酚/氯仿、氯仿各抽提1遍，乙醇沉淀干燥后，溶于10μl TE(pH8.0)中，在Eppendorf管中与80ul上述制备的感受态酵母细胞混匀，转至冰冷的0.2cm电转杯中，冰浴5分钟，用Bio-RadGene Pulser电转仪进行电击，条件为电压1500V，电容25μF，电阻200Ω，＞5ms。然后立即往电转杯中加1ml冰冷的1M山梨醇，将内容物转至50ml无菌离心管中，30℃孵育1-2h，不振荡；然后加入1ml YPD，30℃，孵育1-2h，分别取10，25，50，100，200μl于YPDS平皿，30℃培养3-4天直至阳性克隆出现。
9.PCR检测目的基因的整合取适量转化子菌落悬浮于10μl去离子水，加入5U Lyticase(5U/ul，Sigma公司)，置于30℃孵育10分钟，然后置液氮中1分钟或-80℃10分钟，取5ul裂解产物直接做模板。以5’-AOX1primer(5’-GACTGGTTCCAATTGACAAGC-3’)3’-AOX1 primer(5’-GCAAATGGCATTCTGACATCC-3’)为引物，用Taq DNA聚合酶进行PCR检测。PCR反应体系为10×Taq缓冲液 3uldNTP Mix(2.5mmol/each)4ul5′AOX1引物(0.1μmol/ul) 1ul3′AOX1引物(0.1μmol/ul) 1ul裂解产物 5.0ulEx Taq酶(5u/ul) 0.5ul，加无菌去离子水至30ul，充分混匀。
PCR反应条件为95℃预变性5分钟，然后95℃变性1分钟，54℃退火1分钟，72℃延伸3分钟，共30个循环，然后72℃保温7分钟。取5ulPCR产物进行琼脂糖凝胶电泳，根据PCR产物分子量大小鉴定外源基因整合情况。对整合有外源基因的克隆PCR产物纯化后直接用AOX1通用测序引物测序，以确定基因序列的正确性(见图2)。
10.双层滤膜法筛选高表达株待转化及菌落大小约1mm左右时，(约3天左右)，以醋酸纤维素膜(Sartorius 0.45μm)覆盖菌体并以涂布棒轻压膜直至完全湿透且没有气泡；将有菌落两面向上，将醋酸膜覆盖于事先覆盖到BMMY平板(2％琼脂)的硝酸纤维素膜上，并于30℃孵育18h。将醋酸纤维素膜移至YPDS(Zeor)平板，于4℃继续培养。将硝酸纤维素膜以含5％脱脂乳的PBS封闭(室温振荡孵育1h或4℃振荡孵育过夜，以PBS洗3次，接着以鼠抗239一抗(以含3％脱脂乳的PBS稀释)室温振荡孵育1-2h，以PBS洗3次。
最后以AP标记的羊抗鼠IgG二抗室温振荡孵育1-2h，以PBS洗3次，加入碱性磷酸酶底物系统(NBT/BCIP，碱性磷酸酶底物缓冲液)，室温孵育5-10min，以着色深浅判断各克隆株的表达水平高低。自醋酸纤维素膜平板挑取染色最深的克隆共计164株放大培养(见图3)。
11.阳性克隆的诱导表达及筛选从YPDS平板上挑取经PCR鉴定整合有外源基因的单菌落于5ml BMGY中28-30℃ 250-300rpm培养16-18小时，取1ml接种到100ml BMGY培养基中直至OD600＝2-6，5000rpm室温离心5分钟，弃去上清，菌体沉淀用20mlBMMY重悬，每24小时加100％甲醇至终浓度为0.5％，诱导表达8天。每天取样1ml室温5000rpm离心3分钟，将上清和细胞沉淀液氮速冻后，保存于-20℃冰箱以纤维蛋白原平板法测定重组蛋白的纤溶活性。
纤维蛋白原平板法测定重组蛋白的纤溶活性将收集到的发酵上清1ml再次离心，10,000rpm，2min，4℃，取上清，经0.45μm的滤膜过滤后，以1M的HCl调节pH至4.0，10,000rpm，10min，4℃，离心收集沉淀，溶于20μl PBS(pH7.4)中(原始体积的1/50)。加10μl于纤维蛋白平板，37℃反应16小时，检测溶圈面积。
酵母KM71转化株的重组蛋白表达量在第6天达到最高，且多数转化株都表线现出一定的纤溶活性。得到重组蛋白纤溶活性最高的克隆株pPICPI239/KM71-48。对pPICPI239/KM71-48号克隆株进行序列测定，并将其作为种子菌进行高密度发酵生产重组蛋白。
测序方法是取适量YPDS平板上的转化子菌落悬浮于10μl去离子水，加入5U lyticase，置于30℃孵育10分钟，然后置液氮中1分钟，以此处理后的菌落作为模板，以5’-AOX1 primer，3’-AOX1 primer为引物可扩增出特异的1.3Kb的条带，将此PCR产物纯化后进行序列测定，结果表明PI239蛋白的基因已正确插入酵母表达载体PICZα(A)，并且与载体上的α-factor信号肽同框。
12.实验室规模高密度连续培养采用补料分批高密度发酵表达接种甘油保存菌于5ml BMGY培养基中，30℃振摇过夜。将此一级种子以1∶2000接种(v/v)于BMGY培养基中，30℃振摇12-16小时至OD600为6左右。将此二级种子按10％(v/v)的比例接种于已在位灭菌的Basal Salts培养基中，用25％-30％的氨水调pH值为5，加入4.35ml/L的PTM1 Trace Salts培养基，然后将溶解氧控制在60％(以氧气瓶供氧)，pH控制在4.99，30℃，600rpm于发酵罐中进行发酵，溶解氧上升后，开始向罐内流加甘油溶液(Basal Salts培养基，50％[W/V]甘油中添加12ml/L的PTM1 Trace Salts培养基)，18.15ml/L发酵液/h，持续流加24h，然后停止流加3h，在此期间溶解氧始终控制在60％以上，pH值控制在5.0左右，温度维持在30℃，并每24小时添加终浓度为0.4％的组氨酸。然后向罐内流加甲醇溶液(100％甲醇中添加12ml/L的PTMl Trace Salts培养基)，1ml/L/h持续流加3h，之后每30分钟增加10％，直至增加至3ml/L/h并持续流加96h。诱导后每24小时加入酪蛋白水解物(CAA)至终浓度为0.1％，溶解氧控制在60％，pH控制在6.0左右，温度维持在28℃。每12小时取样10ml，离心收集上清，-70℃保存。最后在诱导后大约100小时放罐。
我们对所筛选得到的高表达株进行了高密度发酵表达，结果表明高密度发酵时重组蚓激酶蛋白的产量是摇瓶发酵时的4倍以上，粗蛋白量可以达到174mg/L；13.重组蛋白的纯化条件VIVA FLOW 200膜包超滤浓缩→DEAE离子交换层析→苯甲脒亲和层析/抑肽酶亲和层析/赖氨酸亲和层析。
(1)、以膜包超滤法浓缩蛋白发酵液以10000rpm，20min，二次离心收集上清。以Vivaflow200膜包对离心上清进行超滤浓缩换液，膜包预先用500ml纯水以200ml/ml的流速清洗并排干，除去管道内的保存液。然后将膜包进样管与出样管插入至发酵上清中，废液管导入另一容器，100ml/min流速下开始超滤。待发酵上清浓缩至预定体积后，逐步加入10倍体积的20mM Tris·Cl(pH6.5)置换缓冲体系，在此过程中始终保持预定体积不变。当发酵上清稳定在pH值6.5后，停止超滤，收集处理后的样品准备层析，膜包清洗保存。此超滤液经0.45μm的滤膜除去具中颗粒较大的杂质。之后样品置于冰浴并在4℃冰箱中过夜。
(2)、DEAE-S-FF弱阴离子交换层析层析柱平衡使用DEAE-S-FF1ml预装柱(Pharmacia)。以10倍体积的去离子水清洗，然后以10倍柱体积的上柱缓冲液平衡，直至pH值稳定在6.5(记录仪输出信号为50/500mv，走纸速度为20cm/h，吸光度为0.2A档，平衡时输出信号稳定在5mv)；上样将超滤后的液体直接上样，流速1ml/min，收集穿透峰；(记录仪输出信号为50/500mv，走纸速度为20cm/h，吸光度为0.2A档)；洗涤用至少10倍柱床体积的上样缓冲液洗涤至基线平衡，流速1ml/min；洗脱用5倍柱床体积的洗脱液进行NaCl梯度洗脱，NaCl浓度从0-0.2M(0.02，0.04，0.06，0.08，0.10，0.12，0.14，0.16，0.18，0.20M)，流速1ml/min，收集各个洗脱峰；最后以2M的NaCl洗脱所有的蛋白；再生以10倍柱体积的0.5M的NaOH和0.1M的HCl依次洗柱，以上样缓冲洗涤至基线，最后将柱保存于20％的乙醇中。
(3)、苯甲脒亲和层析凝胶预平衡以10倍体积的去离子水清洗，然后以10倍柱体积的上柱缓冲液平衡，直至pH值稳定在7.4(记录仪输出信号为50/500mv，走纸速度为6cm/h，吸光度为0.2A档，平衡时输出信号稳定在5mv；)；上样将换液后的样品直接上样，流速1ml/min，收集流穿峰；洗涤用至少10倍柱床体积的上样缓冲液洗涤至基线平衡，流速1ml/min；10.4.4洗脱使用0.05M Glycine(pH3.0)进行洗脱，流速1ml/min，其后以0.05M Tris.Cl(含0.5M NaCl，pH7.4)平衡缓冲液洗柱，收集洗脱峰；再生以纯水洗5个柱床体积，然后分别用0.1M Tris-Cl(含1MNaCl，pH8.0)和0.1M醋酸缓冲液(含1M 1M NaCl，pH4.0)交替洗涤3次，再用纯水洗3个柱床体积，然后用20％的乙醇洗3个柱床体积，柱子置于4℃；14.SDS-PAGE电泳及Western blot分析将900ul酵母细胞上清与100ul 100％TCA充分混匀后，冰浴30分钟，12000转/分4℃离心30分钟，用500ul预冷的丙酮洗涤沉淀2次，12000转/分离心5分钟，弃丙酮，沉淀干燥后重溶于适量体积的PBS中。
将上述用100％三氯乙酸10倍浓缩并重溶于PBS中的诱导表达后上清，各取20ul加10μl 3×SDS上样缓冲液(含5％2-ME)，煮沸10分钟后，于12％聚丙烯酰胺凝胶电泳，每孔15ul，同时加预染中分子量蛋白标准(prestained protein molecular weight marker，晶美生物工程公司)，条件为稳压120V电泳110分钟。电泳胶一半用考马斯亮蓝进行染色，另一半转至硝酸纤维素膜上，用于做Western Blot检测，所用一抗为自行制备的PI239蛋白的小鼠多抗血清，1∶100稀释，小鼠抗蚯蚓纤溶酶PI239抗体与表达产物可以进行专一性地结合。
14.超滤法浓缩蛋白检测其纤溶活性纤维蛋白平板的制备称取120mg的琼脂糖，加入12ml PBS(pH7.4)，煮沸溶解，60℃水浴平衡，加凝血酶10μl(100IU/ml)，边加边摇匀，加5ml牛纤维蛋白原(6mg/ml)，不停摇匀，混匀后马上倒平板，水平放置完全凝固后置4℃大于半小时备用。
将收集到的发酵上清1ml再次离心，10,000rpm，2min，4℃，取上清，经0.45μm的滤膜过滤后，以Amicon Ultra 15、CentriconYM-10(Millipore，USA)超滤离心管将发酵上清1ml浓缩至20μl，取10μl进行纤溶活性的检测，根据溶圈的大小计算重组PI239的纤溶活性，活力测定的结果为4,500mm2/mg蛋白。
15.重组蛋白的纯化条件VIVA FLOW 200膜包超滤浓缩→DEAE离子交换层析→苯甲脒亲和层析/抑肽酶亲和层析/赖氨酸亲和层析。
(1)、以膜包超滤法浓缩蛋白发酵液以10000rpm，20min，二次离心收集上清。以Vivaflow200膜包对离心上清进行超滤浓缩换液，膜包预先用500ml纯水以200ml/ml的流速清洗并排干，除去管道内的保存液。然后将膜包进样管与出样管插入至发酵上清中，废液管导入另一容器，100ml/min流速下开始超滤。待发酵上清浓缩至预定体积后，逐步加入10倍体积的20mM Tris·Cl(pH6.5)置换缓冲体系，在此过程中始终保持预定体积不变。当发酵上清稳定在pH值6.5后，停止超滤，收集处理后的样品准备层析，膜包清洗保存。此超滤液经0.45μm的滤膜除去其中颗粒较大的杂质。之后样品置于冰浴并在4℃冰箱中过夜。
(2)、DEAE-S-FF弱阴离子交换层析层析柱平衡使用DEAE-S-FF1ml预装柱(Pharmacia)。以10倍体积的去离子水清洗，然后以10倍柱体积的上柱缓冲液平衡，直至pH值稳定在6.5(记录仪输出信号为50/500mv，走纸速度为20cm/h，吸光度为0.2A档，平衡时输出信号稳定在5mv)；上样将超滤后的液体直接上样，流速1ml/min，收集穿透峰；(记录仪输出信号为50/500mv，走纸速度为20cm/h，吸光度为0.2A档)；洗涤用至少10倍柱床体积的上样缓冲液洗涤至基线平衡，流速1ml/min；洗脱用5倍柱床体积的洗脱液进行NaCl梯度洗脱，NaCl浓度从0-0.2M (0.02，0.04，0.06，0.08，0.10，0.12，0.14，0.16，0.18，0.20M)，流速1ml/min，收集各个洗脱峰；最后以2M的NaCl洗脱所有的蛋白；再生以10倍柱体积的0.5M的NaOH和0.1M的HCl依次洗柱，以上样缓冲洗涤至基线，最后将柱保存于20％的乙醇中。
(3)、苯甲脒亲和层析凝胶预平衡以10倍体积的去离子水清洗，然后以10倍柱体积的上柱缓冲液平衡，直至pH值稳定在7.4(记录仪输出信号为50/500mv，走纸速度为6cm/h，吸光度为0.2A档，平衡时输出信号稳定在5mv；)；上样将换液后的样品直接上样，流速1ml/min，收集流穿峰；洗涤用至少10倍柱床体积的上样缓冲液洗涤至基线平衡，流速1ml/min；洗脱使用0.05M Glycine(pH3.0)进行洗脱，流速1ml/min，其后以0.05M Tris.Cl(含0.5M NaCl，pH7.4)平衡缓冲液洗柱，收集洗脱峰；再生以纯水洗5个柱床体积，然后分别用0.1M Tris-Cl(含1MNaCl，pH8.0)和0.1M醋酸缓冲液(含1M 1M NaCl，pH4.0)交替洗涤3次，再用纯水洗3个柱床体积，然后用20％的乙醇洗3个柱床体积，柱子置于4℃。
实验说明VIVA FLOW 200膜包超滤浓缩(得率17％)→DEAE离子交换层析(得率20％)→苯甲脒亲和层析(得率10％)。
经DEAE柱离子交换层析和苯甲脒亲和层析后，分别以SDS-PAGE和Western blot检测各洗脱峰，结果在SDS-PAGE所有样品在32KDa左右均检测到有目的条带，WB分析显示DEAE-S-FF离子交换层析的0.08M NaCl洗脱峰和亲和洗脱峰检测到阳性杂交信号，其它流穿峰及各洗脱峰均无重组蛋白的阳性杂交信号，杂交的位置在32KDa，符合目的蛋白的理论分子量。
本发明中，所使用的菌株、质粒、工具酶、材料及试剂等来源如下巴氏毕赤酵母表达KM71，市场有售。酵母表达载体pPICZα(A)及原核宿主菌Top10F’为美国Invitrogen公司产品。
Top10F′基因型(F′{lacIq Tn10(TetR)}mcrA(mrr-hsdRMS-mcrBC)φ80lacZ M15 lacX74 recA1 araD139 (ara-leu)7697 galU galK rpsL(StrR)endA1 nupG)；KM71基因型(his4 aox1ARG4 arg4)。
限制性内切酶BamHI、BglII、XbaI、SacI、EcoRI及T4DNA连接酶等均为New England Biolab公司产品。Klenow fragment酶、Taq DNA聚合酶均为Promega公司产品。Pfu PCR MasterMix为天为时代生物工程公司产品。抗生素Zeocin购自Invitrogen。YNB(无氨基酸酵母氮源)为Difco公司产品、Peptone为上海生工生物工程公司产品。Lyticase(酵母细胞壁裂解酶)为Sigma公司产品。牛纤维蛋白原，牛纤维蛋白溶酶原，牛凝血酶，人尿激酶购自中国药品与生物制品检定所。低分子量蛋白标准，羊抗鼠碱性磷酸酶二抗购自华美生物工程公司。预染蛋白分子量标准购自晶美生物工程公司。玻璃奶(Promega，USA)其它试剂如酵母粉，生物素等均为进口产品或国产分析纯。
主要溶液LB培养基10g/L Tryptone，5g/L Yeast Extract，10g/L NaCl，15-20g/L Agar(for plate)用10N NaOH调节溶液pH值至7.0，高压灭菌；溶菌酶溶液用10mmol/L Tris·Cl(pH8.0)溶液配制成10mg/ml，并分装成小份(如1.5ml)保存于-20℃，每一小份一经使用后便予丢弃。3mol/l NaAc(pH5.2)50ml水中溶解40.81g NaAc·3H2O，用冰醋酸调pH至5.2，加水定容至100ml，高压灭菌后，储存于4℃冰箱。
溶液I50mmol/L葡萄糖，25mmol/L Tris.Cl(pH8.0)，10mmol/L EDTA(pH8.0)。，加水定容至100ml，高压灭菌15分钟，储存于4℃冰箱。
溶液II0.2mol/L NaOH(临用前用10mol/L NaOH母液稀释)，1％SDS。
溶液III5mol/L KAc 60ml，冰醋酸11.5ml，H20 28.5ml，定容至100ml，并高压灭菌。溶液终浓度为K+3mol/L，Ac-5mol/L。
RNA酶A母液将RNA酶A溶于10mmol/L Tris·Cl(pH7.5)，15mmol/L NaCl中，配成10mg/ml的溶液，于100℃加热15分钟，使混有的DNA酶失活。冷却后用1.5ml Eppendorf管分装成小份保存于-20℃。
YPD10g/L Yeast Extract，20g/L Peptone，高压灭菌后加100ml/L 10×D；10×YNB134g/L yeast nitrogen base without amino acid(购自经科宏达生物工程公司)，加热助溶，过滤除菌；500×B20mg生物素溶于100ml去离子水中，加热助溶，过滤除菌；
10×M50ml/L甲醇，过滤除菌；10×GY100mg/L甘油，高压灭菌；1M磷酸钾缓冲液(pH6.0)称取30.1g K2HPO4和118.048g KH2PO4溶于800ml去离子水中，调定pH值后(可用磷酸或KOH微调)，定容至1000ml，高压灭菌；10×D200g/L D-葡萄糖，高压灭菌；BMGY10g/L Yeast Extract，20g/L Peptone，100ml/L 1M磷酸钾缓冲液pH6.0，100ml/L 10×YNB，2ml/L 500×B，100ml/L 10×GYBMMY10g/L Yeast Extract，20g/L Peptone，100ml/L 1M磷酸钾缓冲液(pH6.0)，100ml/L 10×YNB，2ml/L 500×B，100ml/L 10×M酵母细胞裂解液(Breaking Buffer)50mM磷酸钠，pH7.4，1mM EDTA，5％甘油。即在900ml去离子水中加入6g NaH2PO4，372mg EDTA和50ml甘油，用NaOH调pH至7.4后定容至1升，4℃保存备用。临用前加入蛋白酶抑制剂。1M Sorbitol溶液在100ml去离子水中溶解18.217g山梨醇，高压灭菌。
2×SDS上样缓冲液100mmol/L Tris·Cl(pH6.8)，甘油20ml，SDS 4g，β-巯基乙醇5ml，0.2％溴酚蓝，加水至100ml并混匀，临用前，另加0.5％的β-巯基乙醇。
洗涤缓冲液10mmol/L Tris·Cl(pH7.5)，0.15mol/L NaCl，0.05％Tween20，补水至500ml。
考马斯亮蓝染色液45ml甲醇，45ml水，10ml冰乙酸，加入0.25g考马斯亮R-250，溶解后以滤纸过滤使用。
Basal Salts mediumH3PO4(85％)26.7ml；CaSO40.93g；K2SO418.2g；MgSO4.7H2O 14.9g；NaOH 4.13g；Glycerol 40.0g，溶于1L双蒸水中。
PTMl Trace SaltsCuSO4.5H2O 6.0g；NaI 0.08g；MnSO43.0g；NaMoO20.2g；HBO40.02g；CoCl20.5g；ZnCl220.0g；FeSO4.7H2O 65.0g；Biotin0.2g；H2SO45ml溶于1L双蒸水中。
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(i)序列特征(A)长度852bp(B)类型核酸(C)链性双链(D)拓朴结构线性(ii)分子类型cDNA蚯蚓纤溶酶PI239基因序列表1 atgttacttc tcgctcttgc atcgttggta gcggtgggct ttgcgcaacc accagtctgg61 taccccggtg gtcaatgcgg tgtcagccag tactcagatg ctggtgacat ggaacttcct121 cccggaacaa aaattgtcgg aggaattgaa gccagaccat acgagttccc atggcaggtg181 tccgtccgaa ggaagtcttc cgattcccat ttctgcggag gtagcatcat caacgatcgt241 tgggttgtct gcgctgctca ctgcatgcag ggagagagcc ctgccctggt ttcattggtc301 gtcggtgagc acgatagcag cgctgcgagt acagtacgtc agactcatga cgttgacagc361 atcttcgtcc acgaggacta caacggaaat acctttgaga acgacgtttc tgtcatcaag421 acagttaacg ccatcgccat cgacatcaac gttgggccaa tctgcgctcc agatccagcc481 aacgattacg tctaccgtaa gagccagtgc tccggatggg gaactatcaa ctcaggtgga541 gtctgctgcc ccaacgttct gcgatatgtg acactgaacg tcacaaccaa cgccttctgc601 gatgatatct acagcccatt atatacaatt accagcgaca tgatctgcgc cacggacaac661 accggacaga acgagagaga ctcttgccag ggtgactctg gcggccctct gagcgtcaag721 gatggcagcg gaatcttcag cctcattggt attgtgtctt ggggaatcgg ttgcgcatct781 ggatatccag gagtctacgc ccgcgtcggg tcccaaactg gatggatcac agacatcatc841 accaacaact aa上面是PI239的全序列，酵母表达的是其中的成熟肽部分，序列如下DNA序列atgttacttctcgctcttgcatcgttggtagcggtgggctttgcgcaaccaccagtctggtaccccggtggtcaatgcggtgtcagccagtactcagatgctggtgacatggaacttcctcccggaacaaaaattgtcggaggaattgaagccagaccatacgagttcccatggcaggtgtccgtccgaaggaagtcttccgattcccatttctgcggaggtagcatcatcaacgatcgttgggttgtctgcgctgctcactgcatgcagggagagagccctgccctggtttcattggtcgtcggtgagcacgatagcagcgctgcgagtacagtacgtcagactcatgacgttgacagcatcttcgtccacgaggactacaacggaaatacctttgagaacgacgtttctgtcatcaagacagttaacgccatcgccatcgacatcaacgttgggccaatctgcgctccagatccagccaacgattacgtctaccgtaagagccagtgctccggatggggaactatcaactcaggtggagtctgctgccccaacgttctgcgatatgtgacactgaacgtcacaaccaacgccttctgcgatgatatctacagcccattatatacaattaccagcgacatgatctgcgccacggacaacaccggacagaacgagagagactcttgccagggtgactctggcggccctctgagcgtcaaggatggcagcggaatcttcagcctcattggtattgtgtcttggggaatcggttgcgcatctggatatccaggagtctacgcccgcgtcgggtcccaaactggatggatcacagacatcatcaccaacaactaa蛋白序列IVGGIEARPYEFPWQVSVRRKSSDSHFCGGSIINDRWVVCAAHCMQGESPALVSLVVGEHDSSAASTVRQTHDVDSIFVHEDYNGNTFENDVSVIKTVNAIAIDINVGPICAPDPANDYVYRKSQCSGWGTINSGGVCCPNVLRYVTLNVTTNAFCDDIYSPLYTITSDMICATDNTGQNERDSCQGDSGGPLSVKDGSGIFSLIGIVSWGIGCASGYPGVYARVGSQTGWITDIITNN″
序列表<110> 中国疾病预防控制中心病毒病预防控制所<120>在酵母系统高密度发酵生产重组蚯蚓纤溶酶PI239的方法以及工程菌<130>
<160>3<170>PatentIn version3.1<210>1<211>26<212>DNA<213>DNA1<400>1gaattcattg tcggaggaat tgaagc 26<210>2<211>34<212>DNA<213>DNA2<400>2gctctagagc attagttgtt ggtgatgatg tctg34<210>3<211>852<212>DNA<213>DNA3<400>3atgttacttc tcgctcttgc atcgttggta gcggtgggct ttgcgcaacc accagtctgg60taccccggtg gtcaatgcgg tgtcagccag tactcagatg ctggtgacat ggaacttcct120cccggaacaa aaattgtcgg aggaattgaa gccagaccat acgagttccc atggcaggtg180tccgtccgaa ggaagtcttc cgattcccat ttctgcggag gtagcatcat caacgatcgt240
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1.一种在酵母系统高密度发酵生产重组蚯蚓纤溶酶PI239的方法，其特征在于它包括以下步骤(1)、通过化学合成方法或应用PCR技术扩增DNA/RDA方法获得蚯蚓纤溶酶PI239的DNA序列；(2)、含有目的基因的分泌性酵母表达重组质粒的构建表达载体为T7；(3)将重组质粒大量提取和纯化；(4)、酵母感受态细胞的制备；(5)、线性化重组质粒电穿孔转化感受态酵母细胞；(6)、双层滤膜法筛选高表达株，并放大培养；(7)、阳性克隆的诱导表达及筛选PI239蛋白在酵母中以α-factor信号肽蛋白引导的分泌表达；(8)、以高活性克隆株为种子菌进行高密度发酵生产重组蚯蚓纤溶酶PI239；(9)、重组蚯蚓纤溶酶PI239纯化。
2.根据权利要求1所述的一种在酵母系统高密度发酵生产重组蚯蚓纤溶酶的方法，其特征在于所述的蚯蚓纤溶酶PI239的DNA序列采用PCR扩增方法，扩增用上游引物P1序列为5’-gaattcattgtcggaggaattgaagc-3’下游引物P2为5’-gctctagagcattagttgttggtgatgatgtctg-3’，PCR扩增时以pPT-239为模板，该模板系克隆载体pGEM-T上连接蚯蚓纤溶酶PI239的DNA；所述的含有目的基因的分泌性酵母表达重组质粒的构建表达载体采用pPICZα(A)载体，构建的方式是将纯化后得到的PCR产物分别用EcoRI和XbaI双酶切，且同位于载体上第941-1207bp间的来自酿酒酵母的α-factor信号肽同框，切下目的基因片断经玻璃奶纯化后，和同样处理的分泌型酵母表达载体pPICZα(A)载体进行连接，获得pPICPI239重组质粒；所用的酵母菌为KM71；
3.根据权利要求2所述的一种在酵母系统高密度发酵生产重组蚯蚓纤溶酶的方法，其特征在于所述的以高活性克隆株为种子菌进行高密度发酵生产重组蛋白，该高表达株分类命名为巴氏毕赤酵母(Pichia pastoris)，微生物株pPICPI239/KM71-48，保藏号为CGMCC No1515，保藏单位为中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心。
4.根据权利要求1或2或3所述的一种在酵母系统高密度发酵生产重组蚯蚓纤溶酶的方法，其特征在于所述的双层滤膜法筛选高表达株的条件是以醋酸纤维素膜覆盖菌体并以涂布棒轻压膜直至完全湿透且没有气泡；将有菌落两面向上，将醋酸膜覆盖于事先覆盖到BMMY平板(2％琼脂)的硝酸纤维素膜上，并于30℃孵育18h，将此硝酸纤维素膜抽出进行免疫印迹杂交，染色强度高的点对应的菌株即高表达酵母工程菌。
5.根据权利要求1或2或3所述的一种在酵母系统高密度发酵生产重组蚯蚓纤溶酶的方法，其特征在于以高活性克隆株为种子菌进行高密度发酵生产重组蚯蚓纤溶酶PI239方法接种甘油保存菌于5ml BMGY培养基中，30℃振摇过夜；将此一级种子以1∶2000接种(V/V)于BMGY培养基中，30℃振摇12-16小时至OD600为6左右；将此二级种子按10％的比例接种于已在位灭菌的1.6L Basal Salts培养基中，用25％-30％的氨水调pH值为5，加入4.35ml/L的PTM1 Trace Salts培养基，然后将溶解氧控制在60％，pH控制在4.99，30℃，600rpm于发酵罐中进行发酵，溶解氧上升后，开始向罐内流加甘油溶液，18.15ml/L发酵液/h，持续流加24h，然后停止流加3h，在此期间溶解氧始终控制在60％以上，pH值控制在5.0左右，温度维持在30℃，并每24小时添加终浓度为0.4％的组氨酸；然后向罐内流加甲醇溶液(100％甲醇中添加12ml/L的PTM1 Trace Salts培养基)，1ml/L/h持续流加3h，之后每30分钟增加10％，直至增加至3ml/L/h并持续流加96h；诱导后每24小时加入酪蛋白水解物(CAA)至终浓度为0.1％，溶解氧控制在60％，pH控制在6.0左右，温度维持在28℃；每12小时取样10ml，离心收集上清，-70℃保存。最后在诱导后大约100小时放罐。
6.根据权利要求4所述的一种在酵母系统高密度发酵生产重组蚯蚓纤溶酶的方法，其特征在于以高活性克隆株为种子菌进行高密度发酵生产重组蚯蚓纤溶酶PI239方法接种甘油保存菌于5ml BMGY培养基中，30℃振摇过夜；将此一级种子以1∶2000接种(V/V)于BMGY培养基中，30℃振摇12-16小时至OD600为6左右；将此二级种子按10％的比例接种于已在位灭菌的1.6L BasalSalts培养基中，用25％-30％的氨水调pH值为5，加入4.35ml/L的PTM1 TraceSalts培养基，然后将溶解氧控制在60％，pH控制在4.99，30℃，600rpm于发酵罐中进行发酵，溶解氧上升后，开始向罐内流加甘油溶液，18.15ml/L发酵液/h，持续流加24h，然后停止流加3h，在此期间溶解氧始终控制在60％以上，pH值控制在5.0左右，温度持在30℃，并每24小时添加终浓度为0.4％的组氨酸；然后向罐内流加甲醇溶液(100％甲醇中添加12ml/L的PTM1 TraceSalts培养基)，1ml/L/h持续流加3h，之后每30分钟增加10％，直至增加至3ml/L/h并持续流加96h；诱导后每24小时加入酪蛋白水解物(CAA)至终浓度为0.1％，溶解氧控制在60％，pH控制在6.0左右，温度维持在28℃；每12小时取样10ml，离心收集上清，-70℃保存。最后在诱导后大约100小时放罐。
7.根据权利要求5或6所述的一种在酵母系统高密度发酵生产重组蚯蚓纤溶酶的方法，其特征在于所述的重组蚯蚓纤溶酶PI239纯化采用以下步骤VIVA FLOW 200膜包超滤浓缩→DEAE离子交换层析→苯甲脒亲和层析/抑肽酶亲和层析/赖氨酸亲和层析。
8.一种含有纯化的重组蚯蚓纤溶酶PI239的治疗血栓性病症的药物。
全文摘要
一种在酵母系统高密度发酵生产重组蚯蚓纤溶酶PI239的方法以及工程菌，方法包括通过化学合成方法或应用PCR技术扩增DNA/RDA方法获得蚯蚓纤溶酶PI239的DNA序列；含有目的基因的分泌性酵母表达重组质粒的构建；线性化重组质粒电穿孔转化感受态酵母细胞；双层滤膜法筛选高表达株，并放大培养；PI239蛋白在酵母中以α－factor信号肽蛋白引导的分泌表达；以高活性克隆株为种子菌进行高密度发酵生产重组蚯蚓纤溶酶PI239及纯化。工程菌为pPICPI239/KM71－48，保藏号为CGMCCNo1515。优点本发明克隆到蚯蚓纤溶酶PI239基因，并成功地进行了表达，为今后开发研究基因工程产品创造了良好的条件，且本发明的蚯蚓纤浴酶PI239为治疗血栓栓塞性疾病等药物提供新的蛋白。
文档编号A61P7/00GK1962862SQ20051011566
公开日2007年5月16日 申请日期2005年11月9日 优先权日2005年11月9日
发明者梁国栋, 付士红, 葛涛 申请人:中国疾病预防控制中心病毒病预防控制所