专利名称：真核细胞的增强内转译因子及其用途的制作方法
技术领域：
本发明涉及为真核细胞的多顺反子基因表达而构建的增强内转译因子及其应用，具体涉及脑心肌炎病毒的增强内转译因子及其应用。
内转译因子，也称内核蛋白体的进入位点(IRES)。用IRES来驱使多种基因的转译和表达是近十年来发展的一种表达技术，尤其在近五年内这种技术被研究得较多而且被广泛地应用于基因治疗和重组蛋白表达的载体组建。其特点是两个基因编码顺序利用IRES的连接存在于同一个信使RNA(mRNA)，使得两个基因的表达相关相连。这在某些应用上是有意义的，例如，当要表达一个蛋白复合体的两个亚基时，或者通过一个指示蛋白(如荧光蛋白)来监测另一个药用蛋白的表达工艺过程。最常用的IRES来自于脑心肌炎病毒(EMCV)。它已经被美国专利局注册(US Patent#4,937,190)。该专利中描述的是原始的较弱的IRES，没有被突变修改过。
EMCV是最大动物病毒族(小RNA病毒)之一，象小RNA病毒家族的其它成员一样，EMCV具有一个单链RNA基因组。与大多数真核生物的mRNA不同，它的RNA基因在5′末端上缺乏一个常规帽型结构。该结构为核糖体扫描模型所提出的。它的5′非转译区，其长度为834核苷酸(nt)，并由多个AUG三联体组成，据信可引起内核糖体的结合并指导帽型独立转译。在nt403和nt811间的一段较小EMCV区域，其内核糖体进入位点已被测定足以引导充分的转译(Jang，S.K and Wimmer，E.(1990)Genes & Development 4，1560-1572)。后来的研究已经启示EMCV-IRES属于一组称为类型IIIRES因子。上述类型IIIRES因子被认为是在AUG密码的起始位点上直接连接核糖体的。EMCV-IRES在细胞体(in vitro)外，以及在各类不同的细胞类型中，当在没有任何病毒编码蛋白情况下，能充分起作用。因为这种重要特点，它在生物技术工业中已被广泛利用来制造基因治疗和异源基因表达的载体。这些载体能够从一简单的mRNA(Kleiman，S.E.，Pastan，I.，Puck，J.M and gottesman，M.M.(1998)Gene Therapy 5，671-676)中共译二个或多个编码序列。通常情况下在这些双顺反子和三顺反子的连接中，第二或第三基因的表达比第一基因表达的效率较低(低2到15倍)，然而，由EMCV-IRES片段所驱使的第二和第三基因的表达都是相近的(Zhu，J.，Musco，M.and Grace，M.(1999)Cytometry 37，51-59)。由于第一基因的转译被设计成是由帽型扫描机制驱使，这些结果表明了EMCV-IRES导致了一个比常规帽形扫描模型效率较低的转译。这种较低的转译效率在某些等量的二种或多种蛋白须要同时表达的应用中可能很不理想。例如，表达一个受体的二个当量亚基或一个抗体的重链和轻链时即如此。
本发明的目的是提供一组经突变修饰的EMCV的IRES(EMCV-mIRES)，使用mIRES连接的串联基因可以等量相关的表达，也即可以使第二或第三基因的表达增强。
本发明的目的是提供一种包含上述EMCV-IRES突变子的表达载体。
本发明的目的是提供一种用包含EMCV-IRES突变子的表达载体转染的宿主细胞。
本发明目的是提供上述的任一种EMCV-IRES突变子在引导多个编码基因在真核细胞中相关表达的应用；在制备基因治疗相关试剂中的应用；蛋白表达在线监测中的应用。
本发明中的“相关表达”指二个或多个基因在真核细胞内通过双顺反子或多顺反子转录物的共表达，下游基因的表达与上游有相互关系。
为了增强EMCV-IRES在多顺反子连接中的转译功效，本发明引进了一系列单一的茎-环结构，对原始IRES的3′-末端上进行修改。原始EMCV-IRES的3’-末端结构显示出一个富于-嘧啶的序列和在富于-嘧啶序列与第二基因转译起始之间的空间距离的特征。虽然保守的富嘧啶序列被表明对有效的转译是极重要的，在它和AUG间的序列在不同的心病毒种属及其菌株中而言并不是高度保守的，进一步说，该序列的二级结构(Sachs，A.B.，Sarnow，P andHetze，M.W.(1997)Cell 89，831-838)反而可能对IRES的转译效率较重要。因此，在空间距离中引进一个茎-环结构来突变EMCV-IRES听来很具合理性。对茎-环结构，我们利用在体外选用的RNAaptamer序列，尤其是一个妥布拉霉素aptamer(Patel，d.，Suri，A.K.，Jiang，F.，Jiang，L，Fan，P.，Kumar，R.A.and Nonin，S.(1997)J.Mol.Biol.272，645-664)，这些序列简短适当，而且它已被很好研究。在保留相似茎-环结构的前提下，设计了一系列突变，包括茎长、序列等因素的改变。在EMCV-IRES 3’末端上引进茎-环结构在功能上可分为二类，一类增强了下游eGFP的表达(例如mIRES0，mIRES3，图2)；而另一类则减低了表达(如mIRES4，图2)。比较这些结果是很有趣的，我们注意到单一的茎-环结构，当它代替了处于富嘧啶和转译起始间的原始序列，能够提高下游eGFP的表达(图3B和C)。而且这种能力很少受到小序列变化的影响，这些变化只要不影响茎-环结构(见图2)。但是如果序列过长也会影响到增强子的转移效率(Jang，S.K and Wimmer，E.(1990)Genes & Development 4，1560-1572)。这显然是真的，即使对第二基因的KOZAK序列进行改变(如mIRES3)，这种提高下游表达的能力还是很少受影响。由此表明IRES引导的转译可能独立于KOZAK原理。然而，当这种二级结构受到修改，如删除一个在环上的核苷酸，并略为增加茎的长度(图2，mIRES4)，其效应在GFP表达(图3D)上，呈现相反的激烈减缩。这些结果表明了引进mIRES0，mIRES3茎-环结构在增强转译效应上起着重要作用。
本发明优选了二种典型的有利突变的茎-环结构mIRES0、mIRES3。
EMCV-mIRES突变修饰产生的方法。这些变更是靠PCR亚克隆化完成的。一个PCR正向引物，CCT CTG GAA GCT TCT TGAAGA被合成，它跨越EMCV-IRES的中心区域，并拥有一个原始的HindIII位点(在引物中部以斜体字显示)。一组反向引物被设计在近IRES的3’末端，包括在其中部的茎-环结构和在引物5’末端的一个Ncol位点。然后完成的PCR反应产生HindIII-Ncol IRES，它们带有在3’末端上(
图1，图2)突变结构的片段。这些PCR片段和一个蛋白编码序列eGFP的Ncol-Xhol片段，eGFP是从peGFP-C1(Clontech，Palo Alto，.CA)来的，靠标准重组技术，被插入载体pCep4-eBFP-IRES-eGFP中。构建了含EMCV-mIRES的表达载体，如pCep4-eBFP-mIRES0-eGFP，pCep4-eBFP-mIRES3-eGFP。
上述含EMCV-mIRES的表达载体在转染细胞时，采用本领域的常规技术进行。如可用脂质体方法把DNA转进细胞内(LifeTech.试剂盒)。
EMCV-mIRES筛选的方法等。采用两个不同的绿色荧光蛋白作为第一、第二编码序列，用mIRES连接，在活的哺乳细胞中表达，选择可导致各荧光蛋白等量相关表达的EMCV-mIRES结构，即为所需。绿色荧光蛋白可以是BFP、CFP、GFP、YFP。eBFP和eGFP二者的表达已被先前发表的液相流动细胞计量术(FCM)的检测方法所测定和计量(Zhu，J.，Musco，M.and Grace，M.(1999)Cytometry 37，51-59)。
流动细胞计量术(FCM)。简言之，表达载体转染293细胞。在转染48到72小时后，细胞用一种FACS Vantage TM(Becton-Dickinson，San Jose，CA)流动细胞计数器来分析。用二个Innova305(Coherent Laser Group相干激光公司，Santa Clara，CA)多线Ar激光器拨置到360-nm和488-nm上而产生激发波长。过滤探测构型对FLI/FL2光径使用一个525-nm短路二色镜，而对FLI(eGFP荧光)探测器则采用一个510/20的通带滤器。对eBFP的兰色荧光靠用一个在FL4探测器中的405/20通带滤器而测得。过滤器购自Omega Optical光学公司(Brattleboro，VT)。正向和侧散射被用来设置一个收集通道，死亡的细胞及废渣因此可通过此通道而除去。在GFP和BFP荧光间未见光谱重叠，因此在实验中不需补偿。对每个实验使用了一览明细的公式来收集一万到五万次。用CellQuestTM v.3.0在苹果Apple Power MacIntosh G3计算机上获得并分析了数据。
流动细胞计量术可分析多顺反子，多基因构建在真核细胞内的表达，例如，四个双串连eGFP和eBFP的构建，即原始的IRES和IRES的三个修改物，mIRES0，mIRES3和mIRES4的表达分析。图3展示了四个被完成实验之一的代表数据。原始的IRES结构(图3A)展示了相当多的转染细胞种群，在第一和第三对数值间测到胞内荧光，并测到了共表达的eGFP(FL1)和eBFP(FL4)。我们观察到在共表达细胞中，GFP和BFP强度之间有一个直接的相互关系。靠修改IRES，我们观察到了GFP强度的重要的改变。这种改变来自于双串连结构转染的293细胞中。例如，mIRES0的修改导致GFP的强度上移了(图3B)0.5-1.0的对数值。mIRES3的修改相对于原始的IRES而言，也导致相似的增强(图3C)。然后使用mIRES4的修改(图3D)我们也观察到了有害的效果，GFP的强度被严重地减弱了。
四个各别的转染实验是对不同增殖年令数的293细胞进行的。在每个实验中，右上方种群(quadrant population)，亦即GFP和BFP共表达的细胞种群被测定了。表1以MFI’s的平均值总结了从四个各别转染来的结果。作为比较对照，GFP(MF1＝1645)或BFP(MF1＝39)的单一构造结果也被提供了。对一个亲体的双重构造(peBFP-IRES-eGFP)，其GFP的MFI平均值的比单一构造低二、三倍(729比1645)，而其BFP的MFI平均值则不太受影响，它证实了一个较弱IRES-驱使的表达。为了增加表达水平，使用了一个哺乳类附加型的载体(pCep4)，来带有相同亲体的双重连接，即pCep4-eBFP-IRES-eGFP。与peBFP-IRES-eGFP构造比较，GFP和BFP二者的MFI在附加型的载体中都显示了略高的水平。mIRES0和mIRES3的修改显示了GFP胞内的荧光平均值比其亲体IRES来得高(分别为3506和2717)。另一方面，mIRES4与其亲体IRES比较而言，其GFP胞内荧光平均值(157)是极其弱的。在mIRES0和mIRES3中，来自位于IRES 5’的BFP表达所引发的荧光和在原始IRES中的BFP荧光显现相似。它表明了此修改对上游基因表达的影响甚小，而对其下游eGFP表达的增强并非以牺牲上游基因作为代价的。用荧光显微镜观察，这些结果是一贯的。
表1 通过FCM测量帽形-和IRES-驱使的GFP表达GFP Constructs Blue MFI Green MFIpeBFP-N1 39peGFP-N1 1645pIRES-eGFP11 167peBFP-IRES-eGFP 61 729pCep4-eBFP-IRES-eGFP 83 1205pCep4-eBFP-m IRES0-eGFP 94 3506pCep4-eBFP-m IRES3-eGFP 77 2717pCep4-eBFP-m IRES4-eGFP 183 157表中peBFP-N1，peGFP-N1来自Clontech，第3至第5个质粒来源(Zhu，J.，Musco，M.and Grace，M.(1999)Cytometry 37，51-59)。
另外。为证实从修改过的IRES来的mRNAs的完整性，作了Northen印迹法的分析(图4)。正如预期的那样，用不同修改过的IRES构造(9-13电泳泳道)以及原始IRES构造(第6和第8泳道)转染的细胞展示出一个长度类似的mRNA条带，其长度约为2.6千碱基(图4)。这些结果表明IRES 3’末端的修改并未改变转录物的大小，而eBFP和eGFP的表达极可能是来自被各种IRES片段所连接的双顺反子转录物。因此其转译功效有了显著的提高，这已通过检测IRES下游的荧光蛋白的表达水平有所证实。
综上所述，本发明的EMCV-mIRES可以使多个编码基因在1比1当量水平表达。如果将需要表达的蛋白基因代替荧光蛋白基因，则可广泛应用于遗传工程领域。
EMCV-IRES突变子可用于引导多个编码基因在真核细胞中相关表达的应用。本发明所述的EMCV增强IRES能使其连接的上游和下游基因表达水平相当接近，而非象原始的IRES其下游的基因表达比上游基因表达要低十多倍。这一特点能使一个复合蛋白的两个亚基的表达相当，减少由于两个亚基表达的水平不一样而可能导致的有害作用。例如有文献报道当抗体的重链和轻链表达不平衡时，重链多而轻链少，累积的重链就会对细胞造成毒性。另一个优点是两个亚基的相当表达可以减少浪费，不会使任一亚基累积无用。具体方法是参照上述EMCV-mIRES引入的方法，将eBFB和eGFP编码序列用目的蛋白的编码序列替代，按标准重组技术装入载体，转染相应细胞，在表达目的蛋白的条件下培养细胞，获得产物。
EMCV-IRES突变子在制备基因治疗相关试剂中的应用。例如将EMCV-mIRES及其连接的基因引入用于基因治疗的载体中，再采用本领域常规的基因治疗技术进行。Kleiman，S.E.，Pastan，I.，Puck，J.M.and Gottesman，M.M.(1998)Gene Therapy 5，671-676.；Zhou，Y.，Aran，J.，Gottesman，M.M.and Pastan，I.(1998)Human Gene Therapy 9，287-293.。
EMCV-IRES突变子在蛋白表达在线监测中的应用。尤其在药用蛋白和工业用蛋白生产中。当用它把药用蛋白和荧光蛋白(GFP)联起来(通过重组技术)即能以1比1的比例把两种蛋白的关系如实的相关起来。测定GFP是极其简便，快速而且不会影响到动物细胞的正常生理状态(Gilbert，P.A.，Garnier，A.，Jacob，D.AndKamen，A.(2000))。因此药用蛋白的生产工艺流程也可得到在线监测，及时报告生产状况。也可以使目前的工艺筛选跟踪缩短十倍的时间，成本降低十到一千倍。这种方法本身已经用于数种药用蛋白的生产而得到证实。
本发明优点在于EMCV-IRES突变子的转译效率能够增加到象帽形转译水平那样的相同水平，而其第一和第二顺反子的表达以线形形式而相互关联。
下面结合附图和具体实施例来进一步阐述。
图1.用茎-环结构引起EMCV-IRES 3’-末端修改的策略。
图2.在mIRES 3’-末端上的具有代表性的茎-环序列。在下游eGFP的AUG上的Ncol点下面已被划线。
图3.增强的IRES元素的FACS分析。
图4.各种单顺反子和双顺反子GFP转录物的Northen印迹法分析。
泳道1，无DNA；2，peBFP-N1；3，peGFP-N1 4，peYFP-N1；5，pIRES-eGFP；6，peBFP-IRES-eGFP；7，pCep4-eGFP；8，pCep4-eBFP-IRES-eGFP；9，pCep4-eBFP-mIRES0-eGFP；10，pCep4-eBFP-mIRES 1-eGFP；11，pCep4-eBFP-mIRES2-eGFP；12，pCep4-eBFP-mIRES3-eGFP；13，pCep4-eBFP-mIRES4-eGFP；14，pCep4-eBFP-IRES-eGFP-IRES-eYFP。
实施例1 EMCV-IRES 3′末端上的突变方法这些变更是靠PCR亚克隆化完成的。引物合成一个PCR正向引物，CCT CTG GAA GCT TCT TGA AGA被合成，它跨越EMCV-IRES的中心区域，并拥有一个原始的HindIII位点(在引物中部以斜体字显示)。
一组反向引物被设计在近IRES的3’末端，包括在其中部的发夹结构和在引物5’末端的一个Ncol位点以及在3’末端的富嘧啶序列。PCR反应靠标准技术(Perkin-Elmer Corp，Foster City，CA)。
产生HindIII-Ncol IRES，它们带有在3’末端上(
图1，图2)突变结构的片段。这些PCR片段和一个编码eGFP的Ncol-Xhol片段，它从peGFP-C1(Clontech，Palo Alto，CA)来的，靠标准重组技术(《分子克隆实验指南》(第二版))，被插入pCep4-eBFP-IRES-eGFP载体中(Zhu，J.，Musco，M.and Grace，M.(1999)Cytometry37，51-59)。
实施例2 增强的IRES元素的细胞转染和FACS分析。
mIRES表达载体转染人的293细胞。转染技术用脂质体方法把DNA转进细胞内(Life Tech.试剂盒)。在转染培养48到72小时后细胞被收获。采用前述所设置的滤器和检测器对同时发生的兰色(FL4，eBFP)和绿色(FL1，eGFP)荧光发射进行分析。双重激发的Ar-激光线(360-nm和488-nm)被使用了(见图3)。
在四个各别实验中按不同的实验日期，用不同增殖年龄数的细胞，人的293细胞被8个不同的单一基因或双重串联基因构造而分别转染。根据模拟转染对照来划分四个散型区域。平均荧光强度[MFls]是从有效区域内的细胞点数来测定。通过n＝4实验，取得MFIs的平均值。所得的平均数据的方差系数少于40％。实验结果见表1。
实施例3 各种单顺反子和双顺反子GFP转录物的Northern印迹法分析293细胞是用下列质粒来转染，2，peBFP-N1；3，peGFP-N1 4，peYFP-N1；5，pIRES-eGFP；6，peBFP-IRES-eGFP；7，pCep4-eGFP；8，pCep4-eBFP-IRES-eGFP；9，pCep4-eBFP-mIRES0-eGFP；10，pCep4-eBFP-mIRES1-eGFP；11，pCep4-eBFP-mIRES2-eGFP；12，pCep4-eBFP-mIRES3-eGFP；13，pCep4-eBFP-mIRES4-eGFP；14，pCep4-eBFP-IRES-eGFP-IRES-eYFP。并使用Northern印迹法进行分析。质粒2-4购自Clontech公司，其余质粒按(Zhu，J.，Musco，M.and Grace，M.(1999)Cytometry 37，51-59)构建或按实施例1构造。在转染培养48到72小时后细胞被收获。总的RNA样品都从293细胞中提取。具体方法按照《分子克隆实验指南》(第二版)。
权利要求
1.一组脑心肌炎病毒的增强转译因子(EMCV-IRES)突变子，其特征在于EMCV-IRES的3′-末端的结构改变。
2.根据权利要求1所述的EMCV-IRES突变子，其特征在于EMCV-IRES的3′-末端引入一个茎-环结构。
3.根据权利要求2所述的EMCV-IRES突变子，茎-环由下述序列之一形成(1)GAG-GUUUAGCUACACUA(2)UAG-GUUUAGCUACGCU
4.包含权利要求1、2或3所述EMCV-IRES突变子的表达载体。
5.一种用包含1、2或3所述的EMCV-IRES突变子的表达载体转染的宿主细胞。
6.权利要求1、2或3的任一种EMCV-IRES突变子用于引导多个编码基因在真核细胞中相关表达的应用。
7.权利要求1、2或3的任一种EMCV-IRES突变子在制备基因治疗相关试剂中的应用。
8.权利要求1、2或3的任一种EMCV-IRES突变子在蛋白表达在线监测中的应用。
全文摘要
一种增强内转译因子及其用途。在脑心肌炎病毒增强转译因子(EMCV－IRES)的3′末端引入茎－环结构的修饰,新的增强转译因子可以使连接的串联基因等量相关表达。本发明同时提供该类EMCV－IRES突变子在引导多个编码基因在真核细胞中相关表达的应用;在制备基因治疗相关试剂中的应用;蛋白表达在线监测中的应用。还提供了含EMCV－IRES突变子的表达载体及宿主细胞。
文档编号C12N15/63GK1361131SQ0013720
公开日2002年7月31日 申请日期2000年12月28日 优先权日2000年12月28日
发明者祝敬东, 祝新华 申请人:上海鸿和工贸发展有限公司, 上海星晔国际贸易有限公司