专利名称：一种对丙肝、乙肝、爱滋和梅毒病毒进行共检的基因芯片及其检测方法
技术领域：
本发明属免疫学检测领域，具体地是一种应用基因芯片技术对丙肝、乙肝、爱滋和梅毒病毒进行共检的方法。
背景技术：
乙肝、丙肝、爱滋和梅毒(HBV、HCV、HIV和TP)是常见的传染病，这四种传染病的病原体有的是DNA病毒，有的是RNA病毒。
乙肝病毒血清方法证实由四种重要的亚型(adr，adw，ayr，ayw)，决定这四种亚型的病毒基因基础是由于其S基因是乙肝病毒基因中变异率发生最高的基因区，所以亚型又派生出许多亚亚型。丙肝病毒是一种很小的RNA病毒，它包含一个长度为10,000个核苷酸的单向的正向的RNA分子。基因组含有一个据信可被转化成单个的，大聚合蛋白并随后进行处理的单个的长的开放阅读框。这个开放阅读框始于一个非转化区域(UTR)之后的核苷酸343(采用原型病毒编号系统)。5′UTR序列是相对不变的，并且在病毒的复制和调节方面是很重要的。编码区域的5′端也是不变的。人类免疫缺陷病毒(HIV)是获得型人类免疫缺陷综合症(AIDS)和相关失调的致病剂。HIV是逆转录病毒家族的一种RNA病毒，并表现出所有逆转录病毒的5′LTR-gag-pol-env-LTR3′结构。HIV通过复制从细胞中芽生和损坏细胞膜，杀伤它感染的细胞。
目前检测丙肝、乙肝、爱滋和梅毒病毒的方法主要是多聚酶链反应(PCR)技术，将丙肝、乙肝、爱滋和梅毒病毒的核酸扩增后进行核酸碱基的序列分析，检测病毒的碱基序列以获得其变异结果。这种方法虽比较精确，但较繁琐，分析成本高。
发明内容
本发明的目的旨在提供一种简便易行的丙肝、乙肝、爱滋、梅毒共检方法。
本发明的目的是以下述方式实现的在丙肝、乙肝、爱滋和梅毒的每一种病原体中选择其保守区域，并在该区域设计适当的探针和引物；进而采用适当的方法提取样本中的病原体核酸(RNA or DNA)、扩增、杂交、扫描、分析，得出结论。
下列附图用于说明本发明的具体实施方案，而不用于限定由权利要求书所界定的本发明范围。
图1是本发明芯片的具体点样方法。
具体实施例方式
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如Sambrook等人，分子克隆实验室手册(New YorkColdSpring Harbor Laboratory Press，1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。
实施例1样本处理，扩增、标记及杂交样本处理●HBV血清100+300Solution D 冰浴10mins +200苯酚氯仿(碱性)13000rpm，10min 取上清，加2倍体积的无水乙醇、2ul tRNA(5mg/ml)和1/10体积的NaAc -20℃放置30min13000rpm，15min 去上清，沉淀加400ul75％乙醇洗涤2遍，晾干；●HCV方法与HBV相同，只是苯酚氯仿要用酸性的；也可采用煮沸法；●HIV先HCV的抽提方法，其他方法有待进一步查证；●TP先采用煮沸法，再用碱裂解法。扩增、标记①HCV和HIV分别进行RT和NEST-PCR；②HBV一次PCR扩增；③TPNEST-PCR，尝试一次PCR。
杂交取标记产物7.5ul，加入杂交液7.5ul，混匀，94℃变性3min，48℃杂交30min，用2×SSC+0.2％SDS 42℃洗涤15min，用2×SSC洗涤10min；避光晾干。
扫描、结果分析和得出结论
将杂交好的芯片在扫描仪中扫描，根据图象分析，得到结论。
实施例2芯片的制备点样液的制备将合成的带氨基修饰的Oligo干粉用TE溶解成100uM的原液，原液再用TE稀释成20uM，临点样前用spotting solution对半稀释成10uM。
点样将制备的点样液，加入96孔板中，按图1用GMS417点样仪点样点样后处理点样完成后，水合30min，用0.2％SDS洗涤2min，重复一次，再用水洗涤2min，重复一次，晾干，点样区用NaBH4封闭5min，用0.2％SDS洗涤1min，重复两次，用水冲洗干净，晾干，4℃保存。
扫描后结果判断根据各个病原体所对应的特异性探针条带的荧光信号即可得出结论。
权利要求
1.一种乙肝、丙肝、爱滋、梅毒病毒基因共检芯片，其特征在于可在体外同时检测人血清中乙肝、丙肝、爱滋和梅毒四种病毒DNA或RNA，从而可以在诊断乙肝、内肝、爱滋和梅毒中应用。
2.一种权利要求1中提到的共检芯片，其特征在于a) 所述的作为检测芯片载体的是玻片；b) 玻片上点有HBV特征基因片断、HCV特征基因片断、HIV特征基因片断、TP特征基因片断、乙肝阳性植物内参照基因、丙肝阳性植物内参照基因、爱滋阳性植物内参照基因、梅毒阳性植物内参照基因、阴性植物内参照基因、空白参照样品。
3.一种制备权利要求2所述的检测芯片的方法，包括HBV、HCV、HIV、TP特征基因的制备、转化、测序验证，靶基因的制备纯化、步骤，点样，其特征在于a)HBV特征基因、HCV特征基因、HIV特征基因、TP特征基因是直接取自病人的血清抽提物，cDNA是通过RT-PCR和nest-PCR方法获得的；b)含有经过测序验证的HBV特征基因、HCV特征基因、HIV特征基因、TP特征基因和5个植物基因片断的质粒作为PCR扩增的模板，经过两次扩增后，纯化PCR产物，得到样品；c)将样品按照点样矩阵的要求点于玻片上，干燥后，去除背景干扰。
4.一种利用如权力要求1所述的乙肝、丙肝、爱滋、梅毒病毒基因共检芯片检测待检测样本中乙肝、丙肝、爱滋、梅毒病毒的方法，包括从待检测样本中抽提核酸，反转录扩增，标记荧光，杂交，检测，分析，其特征在于(1)利用HBV核酸抽提液、HCV核酸抽提液、HIV核酸抽提液和TP核酸抽提液从待测样本中分别抽提乙肝、丙肝、爱滋和梅毒病毒核酸；(2)利用反转录试剂进行RT-PCR；(3)利用标记试剂和荧光标记混合物对PCR产物进行标记；(4)利用杂交试剂将探针和检测芯片进行杂交；(5)将杂交后的检测芯片进行扫描；(6)利用软件分析杂交结果，得出诊断结果。
全文摘要
本发明公开了一种新的一种乙肝、丙肝、爱滋、梅毒病毒基因检测方法和共检芯片，其检测方法是应用基因芯片技术鉴定乙肝、丙肝、爱滋、梅毒病毒基因。该共检芯片能方便快捷地对四种病毒基因同时进行检测，便于临床诊断和治疗引导。
文档编号C12Q1/68GK1405322SQ0112643
公开日2003年3月26日 申请日期2001年8月9日 优先权日2001年8月9日
发明者吴海, 肖学葵, 孙晓丰, 陈秋雯, 华兵 申请人:上海博华基因芯片技术有限公司