专利名称：一种酵母基因工程菌及内切菊粉酶制剂和应用方法
技术领域：
本发明涉及的是基因工程菌，特别是一种高效表达内切菊粉酶的酵母基因工程菌及菊粉酶制剂和内切菊粉酶水解菊粉制备低聚果糖的方法。
背景技术：
低聚糖是指二至十个单糖单位通过糖苷键连接起来形成直链或分支链的一类糖，它具有低热、稳定、安全无毒等良好生理特性，还具有使肠内有益菌增加，有害菌减少的生理功能。在食品生产和药品生产中有着广泛的前景。
目前，工业上生产低聚果糖有两种方法。一种是蔗糖转化，另一种是以菊粉(或称菊糖，一种从菊芋中制取的产品)为原料通过酸解法或酶解法获得的。酶解法有很多优点，无污染、操作简单、经济效益好，是世界各国推崇的方法。酶解法生产中如何获得高活性的菊粉酶是生产中的关键。目前通常从黑曲霉中培养分离纯化提取菊粉酶。(见微生物学通报1998年25(4)期第195页，名称为“黑曲霉菊粉酶的分离纯化及其活性测定”的报导，所用菌种为曲霉P319)。也有从酵母中培养分离纯化提取菊粉酶(见天津微生物杂志94年第13页----26页，天津工业微生物研究所的名为“菊粉分解酶及其应用技术的研究”的报导，所用菌种为脆壁克维酵母菌KF 9031)，上述菌种只是用常规筛选，没有对其进行基因工程改造，所以产生的菊粉酶活性小于100u/ml，一般只有50u/ml左右。效果并不十分理想。
发明内容
本发明的目的是通过基因工程的手段构建能高效表达内切菊粉酶的酵母基因工程菌，并从其中培养分离纯化制取内切菊粉酶，从而能高效、经济地转化制备低聚果糖。
使用的微生物本发明涉及的酵母基因工程菌Pichia pastoris GS115/HY005，它具有高效表达内切菊粉酶的特性，该菌株于2001年8月31日在中国典型培养物保藏中心保藏，保藏号为CCTCC NoM201032(以下简称HY005)。
HY005菌株的菌学特性a、形态特征毕赤酵母的的无性生殖为芽殖，有时有假菌丝。有性生殖产生子囊内含有1----4枚光滑圆形、礼帽形或土星子囊孢子。
b、生理生化特性毕赤酵母能利用特殊的物质为原料生长，如石油、甲醇、氨态氮、有机酸等。HY005菌株具有毕赤酵母的生理生化特性，同时因插入了内切菊粉酶基因，具有高效表达内切菊粉酶基因的特性。
本发明是这样实现的。酵母基因工程菌HY005(Pichia pastoris)是通过PCR方法或者DNA文库杂交方法，从曲霉属菌株筛选获得内切菊粉酶基因，将用上述PCR方法或者DNA文库杂交方法克隆到的内切菊粉酶基因插入到毕赤酵母整合表达载体中，然后将得到的含内切菊粉酶基因表达载体导入到毕赤酵母中，再从中筛选出一种高效表达内切菊粉酶的酵母基因工程菌HY005菌株。
具体做法是，根据黑曲霉内切菊粉酶基因序列，应用PCR方法用曲霉NRRL3135的DNA为模板，扩增出0.5----2Kb的DNA片段，克隆到T----载体pMD18--T上，经测序证实后，将克隆到NRRL3135的内切菊粉酶基因插入到毕赤酵母(Pichia pastoris)表达载体PIC3.5k的表达盒式结构中，再通过电转化导入毕赤酵母宿主GS115中，再从中筛选出高效表达内切菊粉酶的酵母基因工程菌。
将高效表达内切菊粉酶的酵母基因工程菌HY005，在以甲醇为碳源的培养基中，温度28℃----30℃，经24----148小时诱导培养(每隔一定时间测酶活，酶活性达250----450u/ml时停止诱导培养)，将完成诱导培养的酵母基因工程菌经高速离心除去菌体，收集上清液，即粗酶液，经过滤浓缩即得内切菊粉酶产品。
应用上述的内切菊粉酶粗酶液水解制备低聚果糖的方法，其步骤为；1)、将菊粉用10----50mM、pH5.0----7.0的醋酸纳缓冲液配制成浓度为10----20％的菊粉溶液2)、按每50----100g菊粉对应1ml的粗酶液比例加酶；3)、上述混合液在45℃----60℃、时间4----12小时进行水解反应；4)将水解物进行离心去残渣，取上清液，再经微滤、超滤、真空干燥、即为低聚果糖成品。
用高效表达内切菊粉酶的酵母基因工程菌制备的内切菊粉酶，其酶活性可达300u/ml以上，(一般方法为100u/ml以下)，所以水解反应时间短(一般方法为24----48小时)，转化效率高。将水解物进行离心去残渣，取上清液，再经微滤、超滤、真空干燥后称重，计算收率为65----85％，进行薄层层析或质谱鉴定表明2----10糖的低聚果糖含量占85％----95％。
具体实施例方式
根据已发表的黑曲霉的内切菊粉酶基因序列，应用PCR方法，用无花果曲霉NRRL3135的DNA为模板，增出大约1.5kb的DNA片段，克隆到T--载体pMD18--T上，经DNA序列分析证实克隆的片段包含有NRRL3135的一个内切菊粉酶基因，与已发表的黑曲霉内切菊粉酶基因InB有约98％同源性。
通过亚克隆将克隆到的NRRL3135的内切菊粉酶基因插入到毕赤酵母(Pichia pastoris)表达载体PIC3.5k的表达盒式结构中，再通过电转化导入毕赤酵母宿主GS115中，并对得到的若干转化子进行PCR鉴定。
实施例1鉴定确证导入了内切菊粉酶基因GS115转化子若干(如8----10个)，经摇瓶培养，使细胞密度对应的OD600达到2.0----6.0；转接到以甲醇作为唯一碳源的诱导培养基中于28℃----30℃诱导培养。
诱导培养24小时，每隔10小时取样，对所取样进行SDS--PAGE电泳分析。
选择、诱导、培养高效表达内切菊粉酶效果的菌株HY005(GS115+内切菌粉酶基因)，重复上述过程进行较大规模(100----1000ml的装瓶量)的诱导培养，其间取样进行SDS--PAGE分析，当产酶水平达250u/ml以上时，停止诱导，离心分离菌体，收集含内切菊粉酶的上清液，即为粗酶液，粗酶液进行酶活测定，酶活性为250u/ml。
实施例2鉴定确证导入了内切菊粉酶基因GS115转化子若干(如8----10个)，经摇瓶培养，使细胞密度对应的OD600达到2.0----6.0；转接到以甲醇作为唯一碳源的诱导培养基中于28℃----30℃诱导培养。
诱导培养72小时，其间前48小时，每隔10小时取样，48小时后，每间隔24小时取样，对所取样进行SDS--PAGE电泳分析。
选择、诱导、培养高效表达内切菊粉酶效果的菌株HY005(GS115+内切菌粉酶基因)，重复上述过程进行较大规模(100----1000ml的装瓶量)的诱导培养，其间取样进行SDS--PAGE分析，当产酶水平达350u/ml以上时，停止诱导，离心分离菌体，收集含内切菊粉酶的上清液，即为粗酶液，粗酶液进行酶活测定，酶活性为350u/ml。
实施例3鉴定确证导入了内切菊粉酶基因GS115转化子若干(如8----10个)，经摇瓶培养，使细胞密度对应的OD600达到2.0----6.0；转接到以甲醇作为唯一碳源的诱导培养基中于28℃----30℃诱导培养。
诱导培养168小时，其间前48小时，每隔10小时取样，48小时后，每间隔24小时取样，对所取样进行SDS--PAGE电泳分析。
选择、诱导、培养高效表达内切菊粉酶效果的菌株HY005(GS115+内切菌粉酶基因)，重复上述过程进行较大规模(100----1000ml的装瓶量)的诱导培养，其间取样进行SDS-PAGE分析，当产酶水平达450u/ml以上时，停止诱导，离心分离菌体，收集含内切菊粉酶的上清液，即为粗酶液，粗酶液进行酶活测定，酶活性为450u/ml。
粗酶液水解时间将100----1000g抽提于菊芋的菊粉用10---50mM的pH5.0----7.0的醋酸纳缓冲液配制成10----20％的菊粉溶液，再按50----100g菊粉对应1ml粗液的比例加酶，于45℃----60℃进行4----12小时的水解反应。
将上述水解物进行离心去残渣，将上清液依次微滤、超滤、真空干燥后称重，计算收率为65----85％，取部分干燥物重新按一定比例溶于蒸馏水中，进行薄层层析或质谱鉴定表明2----10糖的低聚果糖含量占85％----95％。
权利要求
1.一种酵母基因工程菌(Pichia pastoris GS115/HY005)是通过PCR方法或者DNA文库杂交方法，从曲霉属菌株筛选获得内切菊粉酶基因，将用上述PCR方法或者DNA文库杂交方法克隆到的内切菊粉酶基因插入到毕赤酵母整合表达载体中，然后将得到的含内切菊粉酶基因表达载体导入到毕赤酵母中，再从中筛选出一种高效表达内切菊粉酶的酵母基因工程菌。
2.根据权利要求1所述的内切菊粉酶的酵母基因工程菌，其特征在于根据黑曲霉内切菊粉酶基因序列，应用PCR方法用曲霉NRRL3135的DNA为模板，扩增出0.5----2Kb的DNA片段，克隆到下一载体pMD18-T上，测序证实后，再将克隆到NRRL3135的内切菊粉酶基因插入到毕赤酵母(Pichia pastoris)表达载体PIC3.5k的表达盒式结构中，再通过电转化导入毕赤酵母宿主GS115中，再从中筛选出高效表达内切菊粉酶的酵母基因工程菌。
3.按权利要求1的酵母基因工程菌制备的内切菊粉酶，其特征在于将高效表达内切菊粉酶的酵母基因工程菌，在以甲醇为碳源的培养基中，温度28℃-30℃，经24----148小时诱导培养(每隔一定时间测酶活，酶活性达250----450u/ml时停止诱导培养)，将完成诱导培养的酵母基因工程菌经高速离心出除菌体，收集上清液，即粗酶液，经过滤浓缩即得内切菊粉酶产品。
4.按权利要求3所述的内切菊粉酶水解制备低聚果糖的方法，其特征在于；1)、将菊粉用10----50mM、pH5.0----7.0的醋酸纳缓冲液配制成浓度为10----20％的菊粉溶液；2)、按每50----100g菊粉对应1ml的粗酶液比例加酶；3)、上述混合液在45℃----60℃、时间4----12小时进行水解反应；4)将水解物进行离心去残渣，取上清液，再经微滤、超滤、真空干燥、即为低聚果糖成品。
全文摘要
本发明提出一种酵母基因工程菌Pichia pastorisGS115/HY005是通过PCR方法或者DNA文库杂交方法,从曲霉属菌株筛选获得内切菊粉酶基因,将其克隆并插入到毕赤酵母整合表达载体中,然后将得到的含内切菊粉酶基因表达载体导入到毕赤酵母中,再从中筛选出一种高效表达内切菊粉酶的酵母基因工程菌。用该酵母基因工程菌制备的内切菊粉酶,其酶活性可达300u/ml以上,用其水解菊粉反应时间短,转化效率高,从而能高效、经济地转化制备低聚果糖。
文档编号C12N9/24GK1341709SQ01128440
公开日2002年3月27日 申请日期2001年9月11日 优先权日2001年9月11日
发明者马立新, 蒋思婧 申请人:湖北大学