专利名称：需氧发酵方法
技术领域：
本发明涉及在发酵罐中需氧条件下培养微生物的方法。
为了生产多种产品如生物质(例如发面酵母)、酶、氨基酸和次生代谢物(如抗生素)，实行工业规模的发酵过程。这些发酵过程大多数涉及微生物包括细菌、酵母和真菌的培养，并且需要给这些微生物的有氧代谢提供氧气。通常，通过使含氧气体如空气穿过发酵罐中的液体来提供氧气。氧气从气泡转移到液相，如此可以被微生物吸收。在涉及大容器体积和高生物质密度的发酵过程中，氧气从气体到液相的转移可能成为生长限制因素。因此，获得氧气转移的增加是获得增产的目标之一，这使得这些过程在经济上更加吸引人。可选择的，在需要以如碳-或氮源作为限制因素来增产某种产品的发酵过程中，要求非生长限制氧气转移速度。至此，开发了提高氧气转移速度的方法。现有技术中已知的提高氧气转移速度的方法包括增加液体的混合(如搅拌)，增加含氧气体的流动和/或增加含氧气体(如富含氧的空气)的氧气浓度。描述的其它方法集中于提供两股分离的含氧气体流。
欧洲专利申请EP-A-0,222,529公开了通过使用第二含氧气流来提高发酵培养基氧气含量的原则。发酵系统由装有升液管和下导管(downcomer)的罐组成，空气通过升液管提供给培养基，而第二含氧气体通过下导管提供给培养基。日本专利申请JP-63-283570中，公开了这个和其它发酵系统，其装配有循环流动的方式，如吸入管或(一套)叶轮、以循环和分离CO2为目的的空气流和在与循环流体流相对方向提供氧气的供氧装置。该体系的缺点在于罐中的液体流速必须是已知的、足够稳定的和能够精确控制的，以便于将供氧装置以能够得到预期氧气转移的方式进行安装。欧洲专利申请公开了第二含氧气体可以通过发酵罐外的循环环供给培养基。
欧洲专利申请EP-A-0477818公开了一种类似的方式，包括将流加空气流注入装备有垂直轴线叶轮方式的混合罐和单独地从附加氧气注入点注入附加氧气。然而，这种方法被以下事实限制后者的注入点必须远离空气注入点附近以便使附加氧气和空气泡的混合减至最小。
欧洲专利申请EP-A-0829534中，气体驱动发酵体系即没有机械混合装置的体系应用了同样的原理。体系将第一含氧气体如空气以一系列气泡形式注入向上穿过罐，其流速是不均一的，从而导致培养基在罐中向上流动。在罐较低部位注入的第二含氧气体是一系列向上均匀流动穿过罐的气泡。发明人定义的均匀流动是指流动中有均一的气泡分布和较窄的气泡尺寸分布，其中观察不到气体/液体向下流动。第二气体的均一性被规定为基本性质。与JP-62-119690公开的内容形成对照，在发酵罐中培养基向下流动的区域没有提供第二含氧气体给培养基，而是，必须在培养基上升的区域提供。
欧洲专利申请EP-A-0,901,812中，通过将氧气直接注入“稳态涡流”进一步改进了该方法，所谓“稳态涡流”是指几乎没有或完全没有假定由机械搅拌体系产生的轴向或横向移动的液体旋转体。据说优点是保持氧气泡在涡旋中直到氧气泡溶解在反应混合物中。然而，在工业罐中很难找出这些稳态区域的准确位置。而且，在工业中常用的高度湍流气-液混合物中，很可能涡流根本不是稳态的。
图1.离喷射器不同距离的小气泡尺寸分布图2.离喷射器不同距离的大气泡尺寸分布这里所说的均匀流动是指其中所有的气泡以同样的速度上升，并且混合物沿直流线型流动而没有再循环液体流动。均匀流动只有当喷射器口均匀分布在罐底部时和表面气体速度大约小于0.04m/s时发生。
这里所说的不均一流动是指出现液体速度的局部差异而且存在再循环液体流动。不均一流动在罐底部喷射器口分布不均匀时或当喷射器口均匀分布但表面气体速度大约大于0.04m/s时发生。
这里定义的培养基的紊乱运动是以方向和速率为特征的运动，其依赖于它在罐中的历史和条件，受特定限制因素的约束(如速率永远不能超过某个最大值)。这与随机运动有区别，其是不依赖于历史的统计量，并且不受限制因素的约束(如能出现极高的速率，虽然只是极小的几率)。
这里所说的湍流是指其单独液体元素的动量差别不能用液体粘度减小的液体运动。结果，将会形成循环漩涡，其中液体速度的差异将由于液体强烈运动而变大。
这里所说的气泡尺寸的均匀分布是指有一个最大值的对称分布。
这里所说的气泡尺寸的不均匀分布是指不对称分布(如在一边有拖尾)或有多于一个最大值的分布。
这里所说的气泡尺寸较窄分布是指其中大于95％的气泡直径在0.2*φb和5*φb之间的分布，其中φb是气泡平均直径。
这里所说的气泡尺寸宽分布是指其中大于95％的气泡直径在0.01*φb和100*φb之间的分布，其中φb是气泡平均直径。
本发明提供了一种在发酵罐中需氧条件下培养微生物的方法，该方法包括以不均一流动将第一含氧气体注入发酵罐较低部位，从而导致培养基的紊乱运动；和第二含氧气体引入罐中，其特征在于，第二含氧气体作为不均一气泡流在罐中所有可能方向和独立于培养基流动的方向引入，从而在注入部位产生湍流条件，同时还作为一系列非均一尺寸和宽尺寸分布的气泡引入。第一含氧气体可以含有15-30％(v/v)氧气，优选20-30％(v/v)氧气，更优选为空气。第一含氧气体注入发酵罐较低部位，优选底部附近。第二含氧气体可含有30-100％氧气，优选含有70-100％氧气，最优选含90-100％氧气。第二含氧气体注入点没有限制在发酵罐的特定部位，可以在第一含氧气体注入点的附近或偏远处，与发酵罐是否装配有机械搅拌装置无关。本发明中方法的优点在于通过这种方法得到的氧气转移比现有技术中已有方法有提高，并且对第二含氧气体流的入口位置没有限制，这使得发酵罐的设计更加灵活。本发明中的方法适合于培养酵母、真菌和细菌。优选的酵菌实施例是糖酵母属或克鲁维氏酵母属的成员如啤酒糖酵母(saccharomyces cerevisiae)和乳克鲁维氏酵母(Kluyveromyces lactis)。优选的真菌实施例是次生代谢物产生的属如青霉属(如用于生产青霉素和其它抗生素的产黄青霉(Penicilliumchrysogenum))和支顶孢属的成员以及酶产生属的成员如曲霉属和木霉属。优选的细菌实施例是链霉菌属、埃希氏菌属、假单胞菌属或芽孢杆菌属的成员。
其它优选实施方案是在发酵罐中需氧条件下培养微生物的方法，其中培养基是机械搅拌混和的。在另一个优选实施方案中，没有使用机械搅拌而是通过第一含氧气体如空气来混合培养基的，即钟柱发酵罐。
第二含氧气体可以通过简单管或气体喷射器、孔、文丘里型喷嘴口、气-液喷嘴口或超声气体注入喷嘴口的方式注入发酵罐。优选的，第二含氧气体通过一个或几个至少含有一个孔的喷嘴口注入发酵罐。更优选的，第二含氧气体可三维地注入发酵罐。这可以通过使用几个至少含有一个孔的喷嘴口安排在发酵罐的合适位置来三维注入。可选择的，一个或多个喷嘴口可以含有至少3个排列成一定形状的孔以便三维注入。
实施例1从安装在充满300升4％Na2SO4水溶液的玻璃罐(直径0.6m)底部附近的喷嘴口喷入空气。Na2SO4溶液用来模拟发酵培养基的凝聚性，并且提供了所用检测方法需要的透明度。喷嘴口含有7个直径为1mm的洞，其中6个平均地分布在直径32mm的圆周上，1个在圆心。喷嘴口的流动是指向上的。在喷射器上各种垂直位置的气体卷流(plume)中测量气体滞留量和气泡尺寸分布。气体滞留量通过使用Cs137 γ辐射源的放射转移技术和Nal检测器来测量。这个技术测量检测区容器内气-液混合物的总密度，因此允许气体部分的计算。以沙得平均d32表达的气泡尺寸分布通过对气泡图形的光学放大录像的图象分析测得(T.Martin-PHD论文Gas dispersion with radial and hydrofoil impellers in fluids withdifferent coalescence characteristics.1996，Herbert Utz Verlag，München(D))。表1和图1和2表示喷嘴口喷出速度为490m/s的结果。观察不均一的气泡尺寸分布，在0.2和0.3mm小范围内(图1)以及在2和4mm大直径范围内(图2)有典型的峰，对小气泡而言滞留量是1.1％，对大气泡而言是1-3％。
表1
实施例2在底部附近装有空气(如第一含氧气体)喷射器和有外部热交换器冷却的再循环环的气泡柱发酵器中培养啤酒糖酵母。表面空气流的速度大约是0.20m/s，氧气转移是每米未通气培养基高度0.4-0.6％。培养基在热交换器中每小时循环四次。其它发酵条件和Reed，G和Nagodawithana，T.W.在《酵母技术》第6章(1991，Van NostrandReinhold，New York)中描述的一样。第二含氧气体由纯氧气组成，在空气喷射器下使用大约在5帕压力下运转、孔直径大约1mm的喷嘴口注入，以便氧气达到超声波注入速度，导致氧气泡不均一分布。我们选择在氧气喷射器下的注入部位使大氧气泡部分(50-70vol％)向上移动并和空气泡聚合，使小气泡部分进入再循环流中。这样，产生了为获得接近全氧吸收(100％效率)的最佳压力和滞留时间的条件，而大气泡部分显示了空气流的转移效率。两种气流(空气/氧气)的比率为9∶1。酵母产率大约为每kg培养基每小时8-9kg生物质(干重)，其是没有注入第二含氧气体时生产率的两倍。表2描述了下述结果。
表2
实施例3进行了与实施例2中所述的发酵相似的发酵，不同的是两种气流(空气/氧气)的比率为6∶1，酵母生产率大约是每小时每千克培养基16kg生物质(干重)。表3给出了结果。
表3
与实施例2相比，可以看到氧气转移速度进一步增长，这被解释为随着酵母生产率的增长，氧气消耗也增多。
实施例4啤酒糖酵母在搅拌发酵器中生长，该搅拌发酵器在底部叶轮下装有空气喷射器，第二喷射器安装在由底部叶轮产生的放射性液体流中。叶轮是涡轮盘型的。第二喷射器装有实施例2中所描述的喷射口类型，通过该喷射器提供了由纯氧气组成的第二含氧气体。第二喷射器的位置选择设在液体最剧烈搅动的部位，以证明氧气泡产生的正效应并不限制于流动条件相对停滞的位置。
除只用空气的发酵作为对照外，还做了两个使用额外氧气的试验。在一个发酵中，空气流中大约6％空气用纯氧气代替。在第二个发酵中，通过第二喷射器直接注入同样量的氧气，同时第一喷射器中的空气流减至94％。液相中氧气浓度控制在空气饱和的20％。发酵末期氧气转移速度的结果显示在表4。
表4
富含氧空气的氧气转移速率的增加可以归因于从气体到液相的更高的推动力。测得数值与预期一致。
直接注入试验的氧气转移速度的增加可以归因于空气从空气喷射器、部分大氧气泡从第二喷射器以及部分小气泡同样从第二喷射器转移的累积贡献。假定大小氧气泡的比率为5∶1，那么空气、大氧气泡和小氧气泡对总氧气转移速度的贡献分别为34，10和6mmol每千克培养基每小时。
权利要求
1.一种在发酵罐中需氧条件下培养微生物的方法，包括以不均一流动将第一含氧气体注入发酵罐较低部位，从而产生培养基的紊乱运动；和将第二含氧气体引入罐中，其特征在于，第二含氧气体作为·不均一气泡流在罐中所有可能方向并且独立于培养基流动的方向引入，从而在注入位置产生湍流；和作为·一系列非均一尺寸和宽尺寸分布的气泡引入。
2.根据权利要求1所述的方法，其中的微生物是酵母、真菌或细菌。
3.根据权利要求2所述的方法，其中的酵母属于糖酵母属或克鲁维氏酵母属。
4.根据权利要求3所述的方法，其中的酵母是啤酒糖酵母。
5.根据权利要求3所述的方法，其中的酵母是乳克鲁维氏酵母。
6.根据权利要求2所述的方法，其中的真菌是青霉属、支顶孢属、曲霉属或木霉属中的成员。
7.根据权利要求6所述的方法，其中的真菌是产黄青霉。
8.根据权利要求2所述的方法，其中的细菌是链霉菌属、埃希氏菌属、假单胞菌属或芽孢杆菌属中的一员。
9.根据前面所述的权利要求中的任意一项的方法，其中培养基是机械搅拌混和的。
10.根据前面所述的权利要求中的任意一项的方法，其中第二含氧气体通过一个或多个至少含有一个孔的喷嘴口注入发酵罐。
11.根据权利要求10所述的方法，其中喷嘴口位于发酵罐上以便三维注入第二含氧气体。
12.根据权利要求10所述的方法，其中孔位于喷嘴口中以便三维注入第二含氧气体。
全文摘要
本发明描述了一种在发酵罐中需氧条件下培养微生物的方法，该方法包括以不均一流动将第一含氧气体注入发酵罐较低部位，从而产生培养基的紊乱运动；和将第二含氧气体引入罐中，其特征在于，第二含氧气体作为不均一气泡流在罐中所有可能方向并且独立于培养基流动的方向引入，从而在注入位置产生湍流条件，和作为一系列非均一尺寸和宽尺寸分布的气泡引入。
文档编号C12N1/04GK1469922SQ01817637
公开日2004年1月21日 申请日期2001年9月26日 优先权日2000年10月19日
发明者P·M·布勒克范登, D·J·格伦, H·J·诺曼, P M 布勒克范登, 格伦, 诺曼 申请人:Dsm公司