专利名称：携带于dna分子内的秘密信息的隐藏方法及其解密方法
技术领域：
本发明揭露一种用以隐藏(conceal)一被携带于一DNA分子内的秘密信息(secret information)的方法以及一种用以将一通过该隐藏方法而将被隐藏的秘密信息予以解密(decode)的方法。特别地，该隐藏方法(concealing method)涉及到测序识别序列、正向引物识别序列以及反向引物识别序列的使用，而该解密方法(decoding method)涉及到分别对应于在用以隐藏该秘密信息的方法中所使用到的测序识别序列、正向引物识别序列以及反向引物识别序列的测序引物、正向引物以及反向引物的使用。
背景技术：
为了防止被窃取的目的，值得去传输或是隐藏仅可以通过特殊方法或是密码钥匙来予以译码的信息。关于利用DNA来进行传递秘密信息的技术已有见于现有技术。例如，US6,312,911揭示的藏密方法涉及利用一选定的密码表来将一秘密信息编码成为一推定的DNA序列，继而合成出真正的DNA序列并将该DNA序列藏匿于选定的基因组DNA中。此外，该美国专利案所揭示的译码方法涉及使用与携带有该秘密信息的DNA序列的侧翼序列(flanking sequences)相关的PCR引物，以通过PCR来扩增出携带有该秘密信息的DNA片段，之后将所扩增出的DNA片段测序，以密码表来解读该DNA片段被测序出来的核苷酸序列，如此即可以还原出原始的秘密信息。
但是，上述的藏匿秘密信息与解密的方式是相当简易的，对于那些熟悉分子生物技术的人士而言，一旦得知可以被用来进行PCR的引物时，便能轻易地得到被隐藏的秘密信息。
因此，本技艺仍存在有一需要来发展能有效地藏匿被携带于DNA分子内的秘密信息的方法以及其对应的解密方法，来达到提高传输秘密信息时的安全性以及提高使用在商品防伪上的功能等等的目的。
发明内容
于是，在第一个方面，本发明提供一种用以隐藏一被携带于一DNA分子内的秘密信息的方法，其为先使秘密信息分散成为分开的部分之后再予以隐藏，而使得该秘密信息被破解的机率被充分地降低。
依据本发明，该用以隐藏一带有一秘密信息的DNA分子的方法包含下列步骤(a)提供一携带有一秘密信息的DNA分子，该DNA分子是由数个核苷酸片段所构成，且每一个所述的核苷酸片段各自带有该秘密信息的一个部分；(b)将该带有秘密信息的DNA分子的所述的核苷酸片段予以分开，继而于各个被分开的核苷酸片段的5’端或3’端处分别连接以一个测序识别序列，由此而形成一个个别的第一接合产物(first ligation product)；(c)对于每一个得自于步骤(b)的第一接合产物，在其5’端处连接以一个正向引物识别序列以及在其3’端处连接以一个反向引物识别序列，由此而形成一个个别的第二接合产物(second ligation product)；以及(d)将得自于步骤(c)的个别的第二接合产物置放于一指定的媒介物中，由此，该秘密信息的每一个部分都被隐藏。
在第二个方面，本发明提供一种用以将一被携带于一DNA分子内并通过上述藏密方法而被隐藏的秘密信息予以解密的方法，其包含下列步骤(a)从被怀疑带有被隐藏的秘密信息的媒介物上分离出DNA物质；(b)通过使用数组各由一个正向引物以及一个反向引物所构成的PCR引物对作为第一解密钥匙(decoding key)来扩增得自于步骤(a)的DNA物质，其中各组PCR引物对的正向引物的核苷酸序列是相同于在上述藏密方法的步骤(c)中为一个第一接合产物所用的一个正向引物识别序列的核苷酸序列，而各组PCR引物对的反向引物所具有的核苷酸序列是互补于在上述藏密方法的步骤(c)中为同一个第一接合产物所用的一个反向引物识别序列的核苷酸序列，由此而得到个别的PCR产物，其中各个PCR产物各自包含有从上述藏密方法的步骤(c)所得到的一个第二接合产物的核苷酸序列；(c)通过使用数个测序引物作为第二解密钥匙来进行得自于步骤(b)的个别PCR产物的核苷酸测序，其中各个测序引物所具有的核苷酸序列是各自相同于在上述藏密方法的步骤(b)中为该DNA分子的一个核苷酸片段所用的一个测序识别序列所具者，由此而得到个别的测序产物，其中各个测序产物各自对应于从上述藏密方法的步骤(b)所得到的一个第一接合产物；(d)对于步骤(c)所得到的各个测序产物，将各个测序产物扣除掉所用的对应测序引物的部分以推算出位在该各个测序产物内的对应于在上述藏密方法的步骤(b)所使用的各个核苷酸片段的核苷酸序列；(e)利用一碱基残基顺序解密机制(decoding mechanismfor the base residue order)来排列由步骤(d)所推算出的所述的核苷酸序列的顺序，由此，一带有秘密信息且通过上述藏密方法而被隐藏于一媒介物内的DNA分子的全长核苷酸序列被推算出；以及(f)依据一指定的核苷酸密码编译表来解读从步骤(d)所推算出的DNA分子的全长核苷酸序列，由此，被隐藏于该DNA分子内的秘密信息被解读出。
本发明的上述以及其它目的、特征与优点在参照以下的详细说明与优选实施例和随文检附的附图后会变为明显可知。
下面结合附图及实施例对本发明进行详细说明，附图中图1示意说明如何利用本发明的藏密方法而将一带有秘密信息的DNA分子隐藏于数个DNA载体内；图2示意说明，如何利用本发明的藏密方法而将图1中所示的该带有秘密信息的DNA分子的一个核苷酸片段(agct)从其5’端至3端依序地连接以一正向引物识别序列1、一插入序列(…)、一测序识别序列1以及一反向引物识别序列1，继而再被插入至一个可携带DNA片段的载体(以～～～来表示)内；图3示意说明，如何利用本发明的藏密方法而将图1中所示的该带有秘密信息的DNA分子的一个核苷酸片段(agct)从其5’端至3端依序地连接以一正向引物识别序列1、一测序识别序列1、一插入序列(…)以及一反向引物识别序列1，继而再被插入至一个可携带DNA片段的载体(以～～～来表示)内；图4示意说明如何利用本发明的解密方法，使用3组PCR引物对作为第一解密钥匙来对3个被怀疑带有要被解密的核苷酸片段的载体进行扩增反应，而得到3个PCR产物；图5示意说明如何利用本发明的解密方法，使用3个测序引物作为第二解密钥匙来测序图3中所得到的3个PCR产物，而得到3个测序产物；图6示意说明如何利用本发明的解密方法，使用数个碱基残基顺序码作为第三解密钥匙来与图4中所得到的3个测序产物进行核苷酸序列的碱基残基顺序比对，而推算出一具有对应于图1中所示的该带有秘密信息的DNA分子的全长核苷酸序列；以及图7示意说明如何利用本发明的解密方法，使用一个碱基残基顺序码作为第三解密钥匙以及一个碱基残基出现频度码作为第四解密钥匙来与图4中所得到的3个测序产物进行核苷酸序列的碱基残基顺序比对，而推算出一具有对应于图1中所示的该带有秘密信息的DNA分子的全长核苷酸序列。
具体实施例方式
现有技术已有揭示，将被使用于PCR过程当中以便扩增出一所需的PCR产物的引物当作用以将一以DNA形式被隐藏的秘密信息予以解密的解密钥匙，例如US6,312,911即是。但是，若以间接或直接方式而猜测出要被使用于DNA扩增过程当中的PCR引物时，有心的商品仿冒者或是意图窃取防伪机密的人士便能容易地以现今已技术发展成熟的PCR技术去进行密码破解，从所扩增出的DNA去解读出被隐藏于内的秘密信息。针对此一问题，为了使经加密处理的秘密信息在传递或解密的期间当中能受到更安全的保障，申请人于本发明中发展出使用多重加密的技术来使要携带有要被隐藏的秘密信息的核苷酸序列能受到不同层面技术的多重保障，进而难以被商业间谍或是仿冒者所破解。
于是，申请人在本发明中提供一种用以隐藏一被携带于一DNA分子内的秘密信息的方法，其包含下列步骤(a)提供一携带有一秘密信息的DNA分子，该DNA分子是由数个核苷酸片段所构成，且每一个所述的核苷酸片段各自带有该秘密信息的一个部分；(b)将该带有秘密信息的DNA分子的所述的核苷酸片段予以分开，继而于各个被分开的核苷酸片段的5’端或3’端处分别连接以一个测序识别序列，由此而形成一个个别的第一接合产物；(c)对于每一个得自于步骤(b)的第一接合产物，在其5’端处连接以一个正向引物识别序列以及在其3’端处连接以一个反向引物识别序列，由此而形成一个个别的第二接合产物；以及(d)将得自于步骤(c)的个别的第二接合产物置放于一指定的媒介物中，由此，该秘密信息的每一个部分都被隐藏。
在本发明的一个优选实施方案中，该携带有秘密信息的DNA分子可通过一包含下列步骤的方法而被获得(i)依据一指定的核苷酸密码编译表将该秘密信息编码成一核苷酸序列码条；(ii)将得自于步骤(i)的核苷酸序列码条分成数个部分，继而通过人工合成方式来合成出各自对应于该核苷酸序列码条的其中一个部分的核苷酸片段，由此一由数个核苷酸片段所构成的DNA分子被获得。
用于合成DNA分子的核苷酸序列的技术是熟习此项技术人士所详知的。因此，当所欲隐藏的秘密信息被编码成一核苷酸序列码条以后，熟习此项技术人士就可依据所要的需求，将该核苷酸序列码条区分为数个部分，然后通过人工合成方式来合成出各自对应于各个部分的核苷酸片段。
在本发明的另一个优选实施方案中，该携带有秘密信息的DNA分子是通过一包含下列步骤的方法而被获得(i’)依据一指定的核苷酸密码编译表将该秘密信息编码成一核苷酸序列码条；(ii’)通过人工合成方式来合成出一所具核苷酸序列是对应于步骤(i’)所编码出的该核苷酸序列码条的核苷酸序列的DNA分子。
当全长的DNA分子被合成出，熟习此项技术人士可以通过本技艺所详知且惯用的限制酶处理技术将该全长的DNA分子区分成数个核苷酸片段，来供本发明的藏密方法的后续步骤使用。
由于构成DNA分子的核苷酸残基主要包含腺嘌呤(a)、胸腺嘧啶(t)、胞嘧啶(c)、鸟嘌伶(g)这四种碱基，熟习此项技术人士可以就这四种碱基的不同排列顺序来事先定义各个碱基排列顺序所代表的意义，以便用于将一段有意义的文字或信息编码成为一核苷酸序列码条。在本发明中，被一制造者所预先设计或是预先定义的一个秘密信息可以根据一选定的核苷酸密码编译表来编码出一核苷酸序列码条。核苷酸密码编译表可以由熟习此项技术人士自行设计，或是采用以往的摩斯密码表或是US6,312,911中所提到的密码表等等。
以下将参照图1至图3来说明如何进行本发明的藏密方法，并对当中所提到一些术语作一定义。
在本发明所称的“测序识别序列”是指一个DNA片段，其所具核苷酸序列相同于一个将被使用于DNA的测序反应中的测序引物所具的序列。
在本发明所称的“第一接合产物”，是指一个通过将一测序识别序列连接至一带有秘密信息的一个部分的核苷酸片段的5’端或是3’而形成的产物。
在本发明所称的“第二接合产物”，是指一个通过将一个正向引物识别序列以及一个反向引物识别序列分别连接至已建构出的第一接合产物的5’端处以及3’端处而形成的产物。
在本发明所称的“正向引物识别序列”，是指一个DNA片段，其所具核苷酸序列是相同于要通过PCR技术来扩增一目的DNA分子时所用的一个正向引物的核苷酸序列。
在本发明所称的“反向引物识别序列”，是指一个DNA片段，其所具核苷酸序列是互补于要通过PCR技术来扩增一目的DNA分子时所用的一个反向引物的核苷酸序列。
在本发明所称的“插入序列(…)”，是指一个不带有任何意义的核苷酸序列，其是用以混淆带有秘密信息的核苷酸片段、正向引物识别序列、测序识别序列、反向引物识别序列等的所在位置来增加序列解密的复杂度。
现在参见图1所示，其示意说明如何利用本发明的藏密方法而将一带有秘密信息的DNA分子隐藏于数个载体内。现在假设有一制造者想要将“MADE IN BWL”这个秘密信息隐藏于自己所生产的某项产品来防止该产品被仿冒。于是，该制造者可利用一选定的核苷酸密码编译表来将“MADE IN BWL”这个秘密信息编码出一核苷酸序列码条。为方便说明，现在假设“MADE IN BWL”经选定的核苷酸密码编译表所编码出的核苷酸序列码条即是“agcttgcgctccgatgca”(SEQ ID No.1)。
于是，熟习此项技术人士即可根据上述核苷酸序列码条所示来合成出一个真正的全长DNA序列，继而将该全长DNA序列切成数个核苷酸片段；或者，熟习此项技术人士可将该核苷酸序列码条区分成为数个部分，然后各别地合成出对应于各个部分的核苷酸片段。
为方便说明，上面所列举的核苷酸序列码条含有18个核苷酸残基，但熟习此项技术人士可以理解到的是，本发明在实际使用上并不受此所限制。事实上，携带有该秘密信息的DNA分子可以包含有多个各自带有4～10000个核苷酸残基(优选为10～5000个核苷酸残基，更优选为20～500个核苷酸残基，又更优选为50～150个核苷酸残基)的核苷酸片段。
有关DNA序列或核苷酸片段的人工合成方式包括使用DNA合成仪以及重组DNA技术。
就上述所例示的核苷酸序列码条“agcttgcgctccgatgca”(SEQID No.1)，现在将其区分为三个部分，亦即核苷酸片段1“agct”(SEQ ID No.2)、核苷酸片段2“tgcgct”(SEQ ID No.3)以及核苷酸片段3“ccgatgca”(SEQ ID No.4)，并以DNA合成仪合成出这三个核苷酸片段。这些核苷酸片段接着可参照图2或图3所示来继续进行本发明的藏密方法。
以第2图为例，首先于核苷酸片段1“agct”(SEQ ID No.2)的5’端处连接上一个测序识别序列，由此而形成一个第一接合产物。或者，也可如第3图所示，在核苷酸片段1“agct”(SEQ ID No.2)的3’端处连接上一个测序识别序列，由此而形成一个第一接合产物。
依据本发明，可被用于连接至各个核苷酸片段的5’端或3端处的测序识别序列可以是彼此相同或不同的，而且该测序识别序列含有4～100个核苷酸残基，优选为10～50个核苷酸残基，更优选为18～30个核苷酸残基。为方便说明的故，于此皆使用一具有SEQ ID No.5所示的核苷酸序列“atcaatactt ataatttggtt”来作为该测序识别序列。
接着，可在每一个第一接合产物的5’端处连接以一个正向引物识别序列以及在其3’端处连接以一个反向引物识别序列，由此而形成一个个别的第二接合产物。
为方便说明，在此皆使用一具有SEQ ID No.6所示的核苷酸序列“gcgcgctaataactacacattta”来作为该正向引物识别序列，以及一具有SEQ ID No.7所示的核苷酸序列“cccgggctcttatatatttcaattt”来作为该反向引物识别序列。
依据本发明，该正向引物识别序列与该反向引物识别序列可各自含有4～100个核苷酸残基，优选为10～50个核苷酸残基，更优选为18～30个核苷酸残基。
如想增加该秘密信息被破解的困难度，此时可以在该第一接合产物的5’端处(图2)或者3’端处(图3)连接上一个插入序列(…)，该插入序列的核苷酸序列不同于该带有一部分的秘密信息的核苷酸片段所具者。该插入序列可含有4～1000个核苷酸残基，优选为10～500个核苷酸残基，更优选为50～200个核苷酸残基。
然后，如图2所示，于已接上有该插入序列的该第一接合产物的5’端处连接以一个正向引物识别序列，并于3’端处连接以一个反向引物识别序列。
或者，可如图3所示，在该第一接合产物的3’端处连接上一个插入序列(…)，然后，于已接上有该插入序列的该第一接合产物的5’端处连接以一个正向引物识别序列，并于3’端处连接以一个反向引物识别序列。
当完成该正向引物识别序列与该反向引物识别序列的连接后，所形成的产物可以通过本技艺所惯用的PCR技术来扩增至所需的数量之后再置放至于一指定的媒介物中，于是该秘密信息的每一个部分即被隐藏。
或者，当完成该正向引物识别序列与该反向引物识别序列的连接以后，所形成的个别产物可以通过本技艺所惯用的PCR技术来扩增至所需的数量，继而通过本技艺所惯用的基因工程技术将所得到的扩增产物插入至一可携带DNA片段的载体(参见图2与图3中以～～～表示的部分)内。这些以往的基因工程技术包括限制酶的选用、以限制酶来剪切DNA携带载体、粘合端(cohesiveend)的处理等等，是广为熟习此项技术人士所知晓并被运用于他们的例行操作技术中。
依据本发明，要被用来携带所得到的第二接合产物的DNA携带载体彼此可以是相同的或是不同的。此外，若该携带载体够大，亦可将所得到的所述的第二接合产物置放于同一载体的不同插入位置处。
图1显示要将上述所提到的三个各自带有该秘密信息的一个部分的核苷酸片段分别置放至载体1、载体2与载体3内。
如想增加该秘密信息被破解的困难度，可令所述的个别的第二接合产物或是携带有个别的第二接合产物的载体来与确认不会干扰到秘密信息的日后解密工作的基因组DNA或随机合成的大量DNA相混合，继而将形成的混合物置放于一指定的媒介物中。
相较于US6,312,911(该案为了降低秘密信息被破解的机率而使用含有高达3×109个碱基对的人类基因组DNA来藏匿该秘密信息)，本发明所提供的方法因为可以将秘密信息分散，而能使用碱基对数目较低或是具有不同长度的寡核苷酸的DNA来藏匿带有秘密信息的核苷酸分子，同时又能维持这些带有秘密信息的各个核苷酸分子被隐藏时的高隐密性。
另一方面，因为使用上述“测序识别序列”、“正向引物识别序列”、“反向引物识别序列”以及“插入序列(…)”，本发明更具有以下优点。
要供连接至带有秘密信息的一个部分的每一个核苷酸片段的测序识别序列各自可以是相同的或是不同的，而正向引物识别序列与反向引物识别序列也是一样，如此，在无法了解全部的测序识别序列、正向引物识别序列与反向引物识别序列的情况下，将会使得依据发明的藏密方法而被隐藏的秘密信息更难被破解。
另外，该插入序列与DNA携带载体的使用可进一步提高依据发明的藏密方法而被隐藏的秘密信息的隐密性。特别地，该插入序列可提供混淆作用，而使得与测序识别序列相连接的秘密信息更不易被识破。
依据本发明，要用来藏匿秘密信息的媒介物可选自于由下列所构成的群组纸、玻璃、塑料、硝基纤维素层、聚碳酸酯层、尼龙层以及织物。而且所述的个别的第二接合产物或是携带有个别的第二接合产物的载体可被藏匿于相同或不同的媒介物内。在一优选实施方案中，该秘密信息被藏匿于一塑料薄膜上。
如此所制成的所述的媒介物即可被用来标记一所欲鉴定物品或是任何需要鉴定的物品，以作为防止仿冒或是伪造鉴定的用。或者所述的媒介物即可被用来传输秘密信息。
本发明应用的方向众多，例如可以将携带有秘密信息的DNA分子混合以诸如颜料、胶水、塑脂、油墨等特定材料而做为一种DNA隐性防伪油墨。而因为不同商业化产品的需求，本发明的藏密方法也可因应印钞技术的底纹、萤光印刷、微细字等多元化选择而被应用于要隐藏秘密信息的在卷标印刷上。
另外，依据本发明而被隐藏起来的秘密信息也具有使用时用量节省，成本低廉且可与许多印刷技术做整合的优点。例如，可被大量使用于一般公司企业的重要或是机密文件；金融产业的存折或是诸如股票、支票以及钞票的有价证券；百货公司或俱乐部的会员卡或折价券、绘画或雕塑或其它手制物品的艺术品以及诸如其它彩券、邮票、海关贴条、贵宾券、纺织品、纤维以及染料等应用上。
DNA本身是无毒性的，在经过预先设计之后，本身就是一种独特的DNA标记，所以依据本发明的藏密方法而被隐藏的秘密信息甚至可被放入至可食性材料内或是被应用于医药产业上，例如健康食品、制药产业中所使用的锭剂(例如胶囊、膜衣锭、糖衣锭)、药片表面印制；或是被隐藏在食品包装物上，例如铝箔包的内部包装、包装盒或包装瓶的外部包装上。
当然，依据本发明的藏密方法而被隐藏的秘密信息也可直接标记于一活体或是有机体，例如重要的植株、疫苗、动物等等具有有高经济价值的相关生技产物。
另外，本发明也预期到对一所欲鉴定的目的物体内去判断是否为一仿冒品的应用而提供一种自一待鉴定的目的物体内检测或是解密一秘密信息的方法，其中该秘密信息是一制造者或是企业者所事先设计，且如本发明的前述说明所示，是以数个核苷酸片段而被预先地隐藏于该目的物之内。于是本发明能通过检测一目的物中是不是有该秘密信息的存在而被应用于判断该目的物是否为特定制造者或使用者所拥有或是为遭受偷取的赃物。
而欲查证一待鉴定的目的物体内是否藏匿有一依据本发明藏密方法而被隐藏的秘密信息，本发明亦提供一种用以将一被携带于一DNA分子内并通过上述藏密法而被隐藏的秘密信息予以解密的方法，其包含下列步骤(a)从被怀疑带有被隐藏的秘密信息的媒介物上分离出DNA物质；(b)通过使用数组各由一个正向引物以及一个反向引物所构成的PCR引物对作为第一解密钥匙来扩增得自于步骤(a)的DNA物质，其中各组PCR引物对的正向引物的核苷酸序列相同于在上述藏密方法的步骤(c)中为一个第一接合产物所用的一个正向引物识别序列的核苷酸序列，而各组PCR引物对的反向引物所具核苷酸序列是互补于在上述藏密方法的步骤(c)中为同一个第一接合产物所用的一个反向引物识别序列的核苷酸序列，由此而得到个别的PCR产物，其中各个PCR产物各自包含有从上述藏密方法的步骤(c)所得到的一个第二接合产物的核苷酸序列；(c)通过使用数个测序引物作为第二解密钥匙来进行得自于步骤(b)的个别PCR产物的核苷酸测序，其中各个测序引物所具有的核苷酸序列是各自相同于在上述藏密方法的步骤(b)中为该DNA分子的一个核苷酸片段所用的一个测序识别序列所具者，由此而得到个别的测序产物，其中各个测序产物各自对应于从上述藏密方法的步骤(b)所得到的一个第一接合产物；(d)对于步骤(c)所得到的各个测序产物，将各个测序产物扣除掉所用的对应测序引物的部分以推算出位在该各个测序产物内的对应于在上述藏密方法的步骤(b)所使用的各个核苷酸片段的核苷酸序列；(e)利用一碱基残基顺序解密机制来排列由步骤(d)所推算出的所述的核苷酸序列的顺序，由此，一带有秘密信息且通过上述藏密方法而被隐藏于一媒介物内的DNA分子的全长核苷酸序列被推算出；以及(f)依据一指定的核苷酸密码编译表来解读从步骤(d)所推算出的DNA分子的全长核苷酸序列，由此，被隐藏于该DNA分子内的秘密信息被解读出。
以下将参照图4至图7来说明如何进行本发明的解密方法。
如图4所示，首先，对怀疑带有依据上述藏密方法(图1至图3)而被隐藏的秘密信息的媒介物进行分离DNA物质的处理，之后再以选定的PCR引物来对所分离出的DNA物质进行PCR反应。
依据本发明，在该PCR反应中所用的PCR引物是经选定来作为第一解密钥匙，因此，各组PCR引物对当中的个别正向引物与反向引物是依据当初藏密方法当中所用的正向引物识别序列以及反向引物识别序列而被提供。于是，依照前面所用到的正向引物识别序列“gcgcgctaataactacacattta”(SEQ ID No.6)以及反向引物识别序列序列“cccgggctcttatatatttcaattt”(SEQ ID No.7)，在此提供具有核苷酸序列相同于该正向引物识别序列的正向引物以及具有核苷酸序列互补于该反向引物识别序列的反向引物。当然地，该正向引物与该反向引物会因应所用的正向引物识别序列与反向引物识别序列而做出变化。
若所检测的DNA物质里面确实带有依据前述藏密方法而被隐藏的秘密信息，即可由所使用的PCR引物来扩增出图4所示的PCR产物，而各个PCR产物各自包含有从前述藏密方法的步骤(c)所得到的一个第二接合产物的核苷酸序列。例如，图4所示，因为前述藏密方法涉及3个核苷酸片段，经过PCR扩增后生成3个PCR产物。
一旦上述的PCR反应有生成PCR产物，即可进行下一步的测序反应，其中使用数个测序引物来作为第二解密钥匙，而且所用的测序引物是根据前述藏密方法的步骤(b)中为该DNA分子的一个核苷酸片段所用的一个测序识别序列来予以选定。有关测序反应的进行，可以使用传统的DNA测序仪或派罗序列分析法(pyrosequence analysis)。
于是，如图5中所示，依照前面所用到的测序识别序列“atcaatacttataatttggtt”(SEQ ID No.5)，在此提供具有核苷酸序列相同于该测序识别序列的测序引物。
可了解到的是，当进行核苷酸测序反应时，所得到的测序产物不仅包括测序识别序列部分与带有秘密信息的一部份的核苷酸片段，还可能会读到属于正向引物识别序列或是反向引物识别序列的部分，而这是可以予以控制的。一来，因为本发明所用的正向引物与反向引物是分别对应于藏密方法中所用的正向引物识别序列或是反向引物识别序列，所以被测序出的序列即可扣除掉属于这两个部分的序列。另外，也可以使核苷酸测序反应被控制在进行至读出“秘密信息”的核苷酸序列后就停止，即不会读出其它不相干的碱基残基。
于是，对于所得到的各个测序产物，将各个测序产物扣除掉所用的对应测序引物的部分，即可推算出位在该各个测序产物内的对应于在前述藏密方法的步骤(b)所使用的各个核苷酸片段的核苷酸序列。
为确认上述所得到的测序产物内的被推算出是带有秘密信息的核苷酸序列的顺序，以推算出被隐藏于媒介物内的DNA分子的全长核苷酸序列，可利用一碱基残基顺序解密机制来进行序列的排列推算。
在本发明的一优选实施方案中，该碱基残基顺序解密机制可以包括作为第三解密钥匙的数个碱基残基顺序码(base residuesequence order codes)，其中所述的碱基残基顺序码是根据所提供的该DNA分子的数个核苷酸片段的顺序来设计，由此，所述的碱基残基顺序码的数目比该DNA分子的核苷酸片段的数目少一个，而且每个碱基残基顺序码具有一段序列，依照该DNA分子的数个核苷酸片段的顺序，是契合于(match with)该DNA分子的数个核苷酸片段当中前一者的3’端部分的碱基残基序列连接以该DNA分子的数个核苷酸片段当中后一者的5’端部分的碱基残基序列。
图6例示说明使用两个碱基残基顺序码“cctgc”(SEQ ID No.8)与“gctccg”(SEQ ID No.9)来作为第三解密钥匙的核苷酸片段排序方式。
在本发明的另一个优选实施方案中，该碱基残基顺序解密机制可以包括(i)一作为第三解密钥匙的碱基残基顺序码(baseresidue sequence order code)来供给步骤(d)所推算出的所述的核苷酸序列进行比对，其中该碱基残基顺序码是根据上述藏密方法的步骤(a)中所提供的DNA分子的碱基残基顺序来予以设计，但省略掉该DNA分子上被重复的碱基残基，由此，从步骤(d)所推算出的所述的核苷酸序列的顺序可被至少部分地确定；以及(ii)一作为第四解密钥匙的碱基残基出现频度码(base residue occurrence frequency code)来供给步骤(d)所推算出的所述的核苷酸序列进行碱基残基出现频度的比对，其中该碱基残基出现频度码是根据上述藏密方法的步骤(a)中所提供的DNA分子的碱基残基出现频度来予以设计，由此，在与(i)中的碱基残基顺序码合用下，该带有秘密信息且通过上述藏密方法而被隐藏于媒介物内的DNA分子的全长核苷酸序列被推算出。
图7例示说明使用上述一个碱基残基顺序码“agctgcgctcgatgca”(SEQ ID No.10)来作为第三解密钥匙以及一个碱基残基出现频度码“1112111112111111”来作为第四解密钥匙的核苷酸片段排序方式。
于是，当推算出的DNA分子的全长核苷酸序列之后，即可依据一指定的核苷酸密码编译表来解读出被隐藏于该DNA分子内的秘密信息。
对于上述第二种较佳实施例中所使用的第三解密钥匙以及第四解密钥匙，在本发明中可以利用揭示于US6,210,891所示的核苷酸测序技术来得到携带有该秘密信息的数个核苷酸片段。
以现今技术而言，熟习此项技术人士有可能会利用随机引物来去除噪声，之后进一步使用减数聚合酶链反应(subtracting PCR)技术，而由此提高带有秘密信息的核苷酸序列被找出的机率。再者，自2002年后，许多物种的基因序列被一一测序，而现今计算机分析资料的功能强大，一经基因库的核苷酸序列比对后，即可能致使人类基因体DNA序列中带有秘密信息的一特定核苷酸序列的全部序列被破解，而暴露出那些提高带有秘密信息的核苷酸序列。
而如上述，可使人了解的是，为了进一步降低秘密信息被破解的机率，在本发明中的测序识别序列与正向引物识别序列或反向引物识别序列是事先经过设计，因此，在不知它们的序列时，是无法进行聚合酶链反应以及测序反应的。因此，纵使有心人士大费周章地利用随机引物而自基因组DNA与随机合成的DNA中获得许多核苷酸片段，在不知测序引物序列为何的情况下，该有心人士仍然无法了解被藏匿的DNA分子的核苷酸片段才是真正的秘密信息所在。另外，纵使有一个测序引物识别序列所对应的测序引物被找出，因为秘密信息被藏匿于不同的核苷酸片段中，有心解密的人士也仅能解读出该秘密信息的一个部分，而无法窥知完整的秘密信息。
另外，欲说明的是，依据本发明的藏密方法与解密方法可被应应于企业体的供应链管理之中，来对商品的制造、物流与检测做不同程度的管理。例如，可以由总公司制定一段秘密信息而放入商品中一起被制造，当有需要检测有问题的商品时，可以将第一解密钥匙交由一检测单位来执行，以进行初步检验，并通过有无PCR产物的出现，先做初步判断以快速达到时效管制。进一步地，若需要确认秘密信息的核苷酸序列，仅需再提供第二解密钥匙便能得到带有该秘密信息的许多核苷酸片段。接着，可能握有第三解密钥匙(或者还有第四解密钥匙)的通货商，即可比对序列次序有无错误。所以便能建立起商品的多重追踪选择，来进行供应链管理。
于本说明书中被引述的所有专利与文献以其整体被并入本发明以作为参考资料。若有所冲突时，本发明的说明(包含界定在内)将占上风。
虽然本发明已参照上述特定具体例来作描述，明显地在不背离本发明的范围和精神的下，可作出很多的修改和变化。因此意欲的是，本发明只受如随文检附的申请专利范围所示者的限制。
序列表<110>博微生物科技公司<120>携带于DNA分子内的秘密信息的隐藏方法及其解密方法<130>NP-17231-TWN<160>7<170>WinWord2000<210>1<211>18<212>DNA<213>人工序列<400>1agcttgcgct ccgatgca18<210>2<211>4<212>DNA<213>人工序列<400>2agct 4<210>3
<211>6<212>DNA<213>人工序列<400>3tgcgct 6<210>4<211>8<212>DNA<213>人工序列<400>1ccgatgca 8<210>5<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>测序引物<223>用于秘密信息的测序<400>5atcaatactt ataatttggtt 20
<210>6<211>23<212>DNA<213>人工序列<220>正向引物<223>用于秘密信息的扩增<400>6gcgcgctaat aactacacat tta23<210>7<211>25<212>DNA<213>人工序列<220>反向引物<223>用于秘密信息的扩增<400>7cccgggctct tatatatttc aattt 25<210>8<211>5<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>用于秘密信息的排序<400>8cctgc5
<210>9<211>6<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>用于秘密信息的排序<400>9gctccg 6<210>10<211>16<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>用于秘密信息的排序<400>10agctgcgctc gatgca 1权利要求
1.一种用以隐藏一被携带于一DNA分子内的秘密信息的方法，其特征在于该方法包含下列步骤(a)提供一携带有一秘密信息的DNA分子，该DNA分子是由数个核苷酸片段所构成，且每一个所述的核苷酸片段各自带有该秘密信息的一个部分；(b)将该带有秘密信息的DNA分子的所述的核苷酸片段予以分开，继而于各个被分开的核苷酸片段的5’端或3’端处分别连接以一个测序识别序列，由此而形成一个个别的第一接合产物；(c)对于每一个得自于步骤(b)的第一接合产物，在其5’端处连接以一个正向引物识别序列以及在其3’端处连接以一个反向引物识别序列，由此而形成一个个别的第二接合产物；以及(d)将得自于步骤(c)的个别的第二接合产物置放于一指定的媒介物中，由此，该秘密信息的每一个部分都被隐藏。
2.如权利要求1的方法，其特征在于其中于步骤(a)中所提供的该携带有秘密信息的DNA分子是通过一包含下列步骤的方法而被获得(i)依据一指定的核苷酸密码编译表将该秘密信息编码成一核苷酸序列码条；(iii)将得自于步骤(i)的核苷酸序列码条分成数个部分，继而通过人工合成方式来合成出各自对应于该核苷酸序列码条的其中一个部分的核苷酸片段，由此，一由数个核苷酸片段所构成的DNA分子被获得。
3.如权利要求1的方法，其特征在于其中于步骤(a)中所提供的该携带有秘密信息的DNA分子是通过一包含下列步骤的方法而被获得(i’)依据一指定的核苷酸密码编译表将该秘密信息编码成一核苷酸序列码条；(ii’)通过人工合成方式来合成出一所具核苷酸序列是对应于步骤(i’)所编码出的该核苷酸序列码条的核苷酸序列之DNA分子。
4.如权利要求3的方法，其特征在于其中于步骤(b)中，该DNA分子通过限制酶处理而被区分成数个核苷酸片段。
5.如权利要求1的方法，其特征在于其中于步骤(b)中，各个核苷酸片段的5’端处被连接以一个测序识别序列。
6.如权利要求5的方法，其特征在于其中被连接于各个核苷酸片段的5’端处的测序识别序列是彼此相同或不同的。
7.如权利要求5的方法，其特征在于其中于步骤(c)中，得自于步骤(b)的第一接合产物于其5’端处先被连接以一个插入序列，继而被连接以一个正向引物识别序列，该插入序列的核苷酸序列不同于该带有一部分的秘密信息的核苷酸片段所具者。
8.如权利要求1的方法，其特征在于其中于步骤(b)中，各个核苷酸片段的3’端处被连接以一个测序识别序列。
9.如权利要求8的方法，其特征在于其中被连接于各个核苷酸片段的3’处的测序识别序列是彼此相同或不同的。
10.如权利要求9的方法，其特征在于其中于步骤(c)中，得自于步骤(b)的第一接合产物于其3’端处先被连接以一个插入序列，继而被连接以一个反向引物识别序列，该插入序列的核苷酸序列不同于该带有一部分的秘密信息的核苷酸片段所具者。
11.如权利要求1的方法，其特征在于其中于步骤(d)中，被用来置放个别的第二接合产物的媒介物是选自于由下列所构成的群组纸、玻璃、塑料、硝基纤维素层、聚碳酸酯层、尼龙层以及织物。
12.如权利要求1的方法，其特征在于其中于步骤(d)中，所述的个别的第二接合产物被置放在相同的媒介物内。
13.如权利要求1的方法，其特征在于其中于步骤(d)中，得自于步骤(c)的个别的第二接合产物先被插入至一可携带DNA片段的载体内，而后被置放于一指定的媒介物中。
14.如权利要求13的方法，其特征在于其中被用来供个别的第二接合产物插入用的载体是为彼此相同或不同的。
15.如权利要求13的方法，其特征在于其中于步骤(d)中，被用来置放个别的第二接合产物的媒介物是选自于由下列所构成的群组纸、玻璃、塑料、硝基纤维素层、聚碳酸酯层、尼龙层以及织物。
16.一种用以将一被携带于一DNA分子内并通过权利要求1的方法而将被隐藏的秘密信息予以解密的方法，其特征在于该解密方法包含下列步骤(a)从被怀疑带有被隐藏的秘密信息的媒介物上分离出DNA物质；(b)通过使用数组各由一个正向引物以及一个反向引物所构成的PCR引物对作为第一解密钥匙来扩增得自于步骤(a)的DNA物质，其中各组PCR引物对的正向引物的核苷酸序列是相同于在权利要求1的方法的步骤(c)中为一个第一接合产物所用的一个正向引物识别序列的核苷酸序列，而各组PCR引物对的反向引物所具有的核苷酸序列是互补于在权利要求1的方法的步骤(c)中的同一个第一接合产物所用的一个反向引物识别序列的核苷酸序列，由此而得到个别的PCR产物，其中各个PCR产物各自包含有从权利要求1的方法的步骤(c)所得到的一个第二接合产物的核苷酸序列；(c)通过使用数个测序引物作为第二解密钥匙来进行得自于步骤(b)的个别PCR产物的核苷酸测序，其中各个测序引物所具有的核苷酸序列是各自相同于在申请专利范围第1项的方法的步骤(b)中为该DNA分子的一个核苷酸片段所用的一个测序识别序列所具者，由此而得到个别的测序产物，其中各个测序产物各自对应于从权利要求1的方法的步骤(b)所得到的一个第一接合产物；(d)对于步骤(c)所得到的各个测序产物，将各个测序产物扣除掉所用的对应测序引物的部分以推算出位在该各个测序产物内的对应在权利要求1的方法的步骤(b)所使用的各个核苷酸片段的核苷酸序列；(e)利用一碱基残基顺序解密机制来排列由步骤(d)所推算出的所述的核苷酸序列的顺序，由此，一带有秘密信息且通过权利要求1的方法而被隐藏于一媒介物内的DNA分子的全长核苷酸序列被推算出；以及(f)依据一指定的核苷酸密码编译表来解读从步骤(d)所推算出的DNA分子的全长核苷酸序列，由此，被隐藏于该DNA分子内的秘密信息被解读出。
17.如权利要求16的方法，其特征在于其中被使用于步骤(e)中的碱基残基顺序解密机制包括作为第三解密钥匙的数个碱基残基顺序码来供与步骤(d)所推算出的所述的核苷酸序列进行排序比对，其中所述的碱基残基顺序码是根据权利要求1的方法的步骤(a)中所提供的该DNA分子的数个核苷酸片段的顺序来设计，由此，所述的碱基残基顺序码的数目比该DNA分子的核苷酸片段的数目少一个，而且每个碱基残基顺序码具有一段序列，是依照该DNA分子的数个核苷酸片段的顺序而且契合于该DNA分子的数个核苷酸片段当中前一者的3’端部分的碱基残基序列连接以该DNA分子的数个核苷酸片段当中后一者的5’端部分的碱基残基序列。
18.如权利要求16的方法，其特征在于其中被使用于步骤(e)中的碱基残基顺序解密机制包括(i)一作为第三解密钥匙之碱基残基顺序码来供给步骤(d)所推算出的所述的核苷酸序列进行比对，其中该碱基残基顺序码是根据权利要求1的方法的步骤(a)中所提供的DNA分子的碱基残基顺序被设计，但省略掉该DNA分子上被重复的碱基残基，由此，从步骤(d)所推算出的所述的核苷酸序列的顺序可被至少部分地确定；以及(ii)一作为第四解密钥匙的碱基残基出现频度码来供给步骤(d)所推算出的所述的核苷酸序列进行碱基残基出现频度的比对，其中该碱基残基出现频度码是根据权利要求1的方法的步骤(a)中所提供的DNA分子的碱基残基出现频度被设计，由此，在与(i)中的碱基残基顺序码合用下，该带有秘密信息且权利要求1的方法而将被隐藏于一媒介物内的DNA分子的全长核苷酸序列推算出。
19.如权利要求16的方法，其特征在于其中于步骤(a)中，DNA物质是从一或数个选自于下列所构成的群组中的媒介物被分离出纸、玻璃、塑料、硝基纤维素层、聚碳酸酯层、尼龙层、织物，以及其组合。
20.如权利要求16的方法，其特征在于其中于步骤(b)中，被使用作为第一解密钥匙的该数组PCR引物对具有彼此相同或不同的正向引物。
21.如权利要求16的方法，其特征在于其中于步骤(b)中，被使用作为第一解密钥匙的该数组PCR引物对具有彼此相同或不同的反向引物。
22.如权利要求16的方法，其特征在于其中于步骤(c)中，被使用作为第二解密钥匙的该数个测序引物是彼此相同的。
23.如权利要求16的方法，其特征在于其中于步骤(c)中，被使用作为第二解密钥匙的该数个测序引物是彼此不同的。
全文摘要
本发明揭示了一种用以隐藏一被携带于一DNA分子内的秘密信息(secret information)的方法以及一种用以将一通过该隐藏方法而被隐藏的秘密信息予以解密的方法，其中该隐藏方法涉及到测序识别序列、正向引物识别序列以及反向引物识别序列的使用，而该解密方法涉及到分别对应于在用以隐藏该秘密信息的方法中所使用到的测序识别序列、正向引物识别序列以及反向引物识别序列的测序引物、正向引物以及反向引物的使用。
文档编号C12Q1/68GK1580277SQ0312751
公开日2005年2月16日 申请日期2003年8月6日 优先权日2003年8月6日
发明者梁明华 申请人:博微生物科技股份有限公司