专利名称：用于携带放射性物质的载体及其使用方法
技术领域：
本发明涉及一种用于携带放射性物质的载体及其使用方法。
利用放射性物质对肿瘤细胞进行放射线治疗兴起于近20年，即利用肿瘤等快速分裂的细胞对放射线造成的伤害特别敏感，经过足量的照射后会引起细胞代谢紊乱，进而走向死亡。其中以放射性碘治疗甲状腺病变是目前放射性物资应用于治疗癌症的最佳例子。放射性碘治疗只要以最简便的口服方式即可，由于甲状腺组织对碘的摄取具有高度亲和性，所以放射性碘可以有效地累积在甲状腺中。癌变后的甲状腺组织同样也具有摄取放射性碘的能力，此时借助于放射性碘释放的β射线将病变组织破坏，以达到清除癌组织及预防复发或转移的治疗目的。又因放射性碘释放的β射线在组织中射程约二毫米，因此对甲状腺周围正常组织的影响不大。
然而现有的放射线治疗方法其实是不具有选择性，即会同时杀死肿瘤细胞及正常组织，例如钴60采用体外照射治疗，放射线要先穿过正常组织后才能抵达肿瘤组织，因此，对于肿瘤周围的正常组织造成的损伤也较大。放射性碘是利用甲状腺组织对其特定摄取能力而能达到一定的疗效，但由于放射性碘无法直接与其他肿瘤细胞结合，因此并不能适用在其他肿瘤细胞的治疗中。手术方法虽然可以在特定组织部位中植入放射性物质，但是已经先造成伤害。
为此，如何提供一个可以携带放射性物质到特定肿瘤组织中的载体是本发明中创作人所研创的动机所在。
本发明中用于携带放射性物质的载体是藻红蛋白(Phycoerythrin；PE)，即利用藻红蛋白(Phycoerythrin；PE)作为载体来携带放射性物质，使放射性物质能够专一性地累积在肿瘤细胞中。
本发明中利用藻红蛋白作为载体将放射性物质带入肿瘤细胞中的方法，至少包含下列步骤提供一藻红蛋白；将欲携带的放射性物质与藻红蛋白结合；借助于携带放射性物质的藻红蛋白与肿瘤细胞结合；将放射性物质累积于肿瘤细胞中；借助于藻红蛋白中携带的放射性物质产生的放射线来消灭肿瘤细胞。
另外，所述藻红蛋白可以是R-藻红蛋白(R-PE)或B-藻红蛋白(B-PE)，其中较佳的是R-藻红蛋白。
另外，所述累积于肿瘤细胞中的藻红蛋白可用于协助判定肿瘤的位置及范围，其方式是经投入有效量的藻红蛋白于肿瘤细胞上，并以特定光波照射藻红蛋白使其射出特定的荧光波长，以判断肿瘤的位置及范围。
另外，所述R-藻红蛋白(R-PE)的照射波长范围为488nm至633nm，其中最佳使用的波长为488nm，经照射后发出红色荧光，波长为575nm；所述B-藻红蛋白(B-PE)的照射波长范围为488nm至633nm，其中最佳使用的波长为543nm，经照射后发出红色荧光，波长为575nm。
另外，前述放射性物质包含任何易与蛋白质接合的放射性物质，例如放射性碘，其可产生放射线，至使肿瘤细胞死亡。
本发明是借助于藻红蛋白与肿瘤细胞的高度亲合力来识别肿瘤细胞，并协助判定肿瘤的位置及范围，再利用藻红蛋白中携带的放射性物质放出的放射线来有效地杀灭肿瘤细胞，而对其他正常组织细胞不会发生损伤。
图1是显示R-藻红蛋白的光谱图；图2是显示B-藻红蛋白的光谱图；图3是显示R-藻红蛋白在人类纤维母细胞(正常细胞)中并无累积现象的影像图；图4是显示R-藻红蛋白在人类神经母细胞瘤(肿瘤细胞)中有明显累积现象的影像图。
本发明经研究发现微藻中特有的藻红蛋白对肿瘤细胞有高度的亲合力，并会选择性地累积在肿瘤细胞中，而不停留在正常细胞中，因此，本发明是利用藻红蛋白的特性来作为癌症治疗中携带放射性物质的载体。
本发明中利用藻红蛋白作为载体将放射性物质带入并消灭肿瘤细胞的方法，至少包含下列步骤提供一藻红蛋白；将欲携带的放射性物质与藻红蛋白结合；藉由携带放射性物质的藻红蛋白与肿瘤细胞结合；将放射性物质累积于前述肿瘤细胞中；及藉由藻红蛋白中携带的放射性物质产生的放射线来消灭肿瘤细胞。
在一般的放射性物质中如碘元素，其物质本身就与蛋白质有很好的反应能力，能够高效率地将碘键结合在酪胺酸(Tyrosine)上，同时又是常用的医疗用放射性元素之一。因此本发明的实施例之一是选择R-藻红蛋白作为放射性碘的载体，将放射性碘携带至肿瘤细胞所在的位置，再利用放射性碘放出的β射线来有效且专一性地使肿瘤细胞死亡，而不会破坏其他正常细胞。
另外，前述累积于肿瘤细胞中的藻红蛋白可经投入有效量的藻红蛋白在肿瘤细胞上，并以特定光波照射藻红蛋白使其放射出特定波长的荧光，以判断肿瘤的位置及范围。
上述藻红蛋白可以是R-藻红蛋白(R-PE)或B-藻红蛋白(B-PE)，其中较佳的是R-藻红蛋白。
R-藻红蛋白属于藻类中特有的一类水溶性、发荧光的色素蛋白。该藻红蛋白的主要理化特性如下其结构由阿法(α)、贝塔(β)及加玛(γ)三种亚单体(Subunit)组成，并通常以六聚体(Hexamer，(αβ)6γ)型态出现，其分子量为260000道尔顿(Dalton)，吸收光谱如图1中的A线所示，吸收光谱的主峰落在566nm处，另外在498nm处有一个肩峰；其荧光发射光谱如图1中的B线所示，荧光发射光谱的主峰位于575nm处，最佳激发光波长为488nm，以该波长激发的荧光产生率(Fluorescence Quantum Yield)为0.84。
B-藻红蛋白的主要理化特性如下其结构由阿法(α)、贝塔(β)及加玛(γ)三种亚单体(subunit)组成，且通常以六聚体(Hexamer，(αβ)6γ)型态出现；分子量为240000道尔顿(Dalton)；吸收光范围落在可见光区，其吸收光谱如图2中的实线所示，吸收光谱的主峰落在545nm处，在498nm有一个肩峰；荧光放射光范围落在可见光区，其荧光发射光谱如图2中虚线所示，荧光发射光谱的主峰位于575nm处，发射荧光亮度强且稳定，受环境PH值、温度及其它生物分子存在的影响小；其最佳激发光波长为543nm，以该波长激发的荧光产生率(fluorescence quantum yield)为0.98。
本发明中所谓的肿瘤细胞，并无特殊限制，然而相对于不同类形的肿瘤细胞，投入的藻红蛋白剂量也将有所变动。
以下列举本发明中的最佳实施例，以进一步详细说明本发明，但并不以本
R-藻红蛋白可选择性地累积在肿瘤细胞中(1).R-藻红蛋白(R-Phyoerythin)的制备R-藻红蛋白的成份规格如下1.吸收光谱值A566/A280≥5.3；A566/A498≤1.5；A620/A566≤0.005；2.蛋白质纯度高于98％；3.保存于150mM磷酸钠缓冲液(Sodium phosphate buffer，pH7.0)中，内含60％饱和硫酸铵(ammonium sulfate)、1mM乙二胺四醋酸盐(SodiumEthylene-diaminetetraacetateEDTA)，以及1mM叠氮化钠(sodium azide)，需4℃冷藏。
先以150mM磷酸钠缓冲液透析完全，再以MEM培养基对该R-藻红蛋白做系列稀释，得到浓度范围从1至100ug/ml的R-藻红蛋白稀释液。
(2).肿瘤细胞的制备使用的肿瘤细胞是人类神经母细胞瘤(Human Neuroblastoma)，对照组正常细胞是人类纤维母细胞(Human Fibroblast)。首先，将细胞置于含有10％胎牛血清的MEM培养基(PH7.4)，并在95％饱和湿度、37℃的条件下进行培养，每二天更换一次培养基。当细胞进行继代培养时，首先，弃置培养基，并以磷酸钠缓冲液清洗细胞一次。其后，加入0.25％胰蛋白酵素(Trypsin-EDTA)使细胞从培养器皿表面脱落，再加入适量的上述培养基以终止胰蛋白酵素的作用，制得细胞悬浮液。其次，接种10万至40万的细胞到适当的载体上(如盖玻片(Cover Slip)，并将该载体置于12孔培养器皿中，在95％饱和湿度、37℃的条件下，培养16小时。
(3)细胞亲合力试验以下将进行R-藻红蛋白对于正常人类纤维母细胞及人类神经母细胞瘤的亲合力测试。取前述步骤(2)所得载有细胞的培养器皿，弃置培养基，并以磷酸钠缓冲液清洗细胞一次。其后，加入上述步骤(1)的R-藻红蛋白稀释液1ml，置于95％饱和湿度、37℃的条件下培养。培养24小时后，弃置培养基，并用磷酸钠缓冲液清洗细胞3次。其次，在每个培养孔中加入4％的多聚甲醛(paraformaldehyde)，放置在室温下，直到细胞完全固定在载体上。经过一次磷酸钠缓冲液清洗后，将细胞载体自培养器皿中取出，用80％的甘油(Glycerol)包埋细胞，随后用荧光显微镜观察R-藻红蛋白对细胞的染色程度。
其结果如图3及图4所示，图3A显示了正常的人类纤维母细胞中未加入R-藻红蛋白的效果图，图3B至图3D是显示分别加入10μg/ml、20μg/ml及40μg/ml的R-藻红蛋白的正常人类纤维母细胞的荧光观测图，结果显示，在正常的人类纤维母细胞中并无观察到荧光放射反应，即表示R-藻红蛋白并不会累积在正常细胞中。
图4A表示肿瘤细胞中未加入R-藻红蛋白，图4B至图4D是显示分别加入有10μg/ml、20μg/ml及40μg/ml的R-藻红蛋白的人类神经母细胞瘤的荧光观测图，结果显示，在肿瘤细胞中随着加入R-藻红蛋白量的增加，观察到的荧光放射越强(即图4中反白之处1)，此即表示R-藻红蛋白会选择性滞留在肿瘤细胞中。
综上所述，本发明是利用藻红蛋白作为癌症放射性治疗中有效携带放射性物质的载体，经投入有效量的藻红蛋白在肿瘤细胞上。以上述最佳实施例的结果证实1.R-藻红蛋白会选择性的滞留在肿瘤组织内；2.以特定光波(波长范围为488nm至633nm；最佳使用波长为488nm)照射会发出红色荧光(荧光波长575nm)，可协助肿瘤位置及范围的判定；3.若投入的R-藻红蛋白已事先键结有放射性碘，可藉由放射性碘所放出的β射线，即可造成肿瘤细胞死亡。
权利要求
1.一种用于携带放射性物质的载体，是以藻红蛋白(Phycoerythrin；PE)为载体来携带放射物质，使放射性物质能够专一性地累积在肿瘤细胞中。
2.根据权利要求1中所述的载体，其特征在于所述藻红蛋白为R-藻红蛋白(R-PE)或B-藻红蛋白(B-PE)。
3.根据权利要求1中所述的载体，其特征在于所述累积于肿瘤细胞中的藻红蛋白可协助判定肿瘤的位置及范围。
4.根据权利要求2中所述的载体，其特征在于所述R-藻红蛋白(R-PE)的照射波长范围为488nm至633nm。
5.根据权利要求4中所述的载体，其特征在于所述R-藻红蛋白(R-PE)最佳使用的照射波长为488nm。
6.根据权利要求2中所述的载体，其特征在于所述B-藻红蛋白(B-PE)的照射波长范围为488nm至633nm。
7.根据权利要求6中所述的载体，其特征在于所述B-藻红蛋白(B-PE)最佳使用的照射波长为543nm。
8.根据权利要求1中所述的载体，其特征在于所述放射性物质包含有任何易与蛋白质接合的放射性物质。
9.根据权利要求8中所述的载体，其特征在于所述放射性物质为放射性碘。
10.一种利用藻红蛋白作为载体将放射性物质带入肿瘤细胞中的方法，其至少包含下列步骤提供一藻红蛋白；将欲携带的放射性物质与藻红蛋白结合；借助于携带放射性物质的藻红蛋白与肿瘤细胞结合；将放射性物质累积于前述肿瘤细胞中及借助于藻红蛋白中携带的放射性物质产生的放射线来消灭肿瘤细胞。
11.根据权利要求10中所述的方法，其特征在于所述藻红蛋白为R-藻红蛋白(R-PE)或B-藻红蛋白(B-PE)。
12.根据权利要求11中所述的方法，其特征在于所述R-藻红蛋白(R-PE)的照射波长范围为488nm至633nm。
13.根据权利要求12中所述的方法，其特征在于所述R-藻红蛋白(R-PE)最佳使用的照射波长为488nm。
14.根据权利要求10中所述的方法，其特征在于所述累积于肿瘤细胞中的藻红蛋白可协助判定肿瘤的位置及范围。
15.根据权利要求10中所述的方法，其特征在于所述放射性物质为放射性碘。
全文摘要
本发明公开了一种用于携带放射性物质的载体及其使用方法，其是以藻红蛋白(Phycoerythrin；PE)为载体来携带放射性物质，使放射性物质能够专一性地累积在肿瘤细胞中，再借助于放射性物质产生的放射线从而有效地造成肿瘤细胞死亡，因此可应用在各种肿瘤治疗中。
文档编号A61K47/42GK1478552SQ02142259
公开日2004年3月3日 申请日期2002年8月28日 优先权日2002年8月28日
发明者阙壮群, 阙壮卿 申请人:阙壮群