专利名称：筛选好氧反硝化菌的方法
技术领域：
本发明涉及一种高效筛选好氧反硝化菌的方法。
背景技术：
一般认为，进行硝酸盐呼吸的反硝化细菌都是兼性厌氧微生物，因为只有在无氧条件下，才能诱导出反硝化作用所需要的硝酸盐还原酶A和亚硝酸盐还原酶。然而，近几年人们不断地发现好氧条件下总氮的损失，因此，对好氧反硝化的研究逐渐引起研究者的重视。目前，对好氧反硝化现象形成的原因尚没有定论，国内外大多数研究者都从制造局部厌氧或微环境厌氧来研究好氧反硝化技术，其操作控制复杂，系统运行不稳定。水体中的氮会造成水体富营养化，所以氮的去除已引起研究者们的普遍关注。然而，传统生物脱氮技术，因硝化菌与反硝化菌对氧的需求截然相反，而使硝化反硝化两个过程在时间和空间上难以统一，并具有以下弊端(1)工程造价高，操作控制复杂；(2)硝化过程中产生的酸度需要投加碱中和，不仅增加了处理费用，而且还可能造成二次污染；(3)系统抗冲击能力差，高浓度NH4+、NO2-都会抑制硝化菌生长。
发明内容
本发明的目的是采用筛选好氧反硝化菌的方法，从生物学角度实现好氧反硝化现象，该技术是实现短程同步硝化反硝化的先决条件，对比传统生物脱氮技术，具有绝对优势。本发明按照下述步骤进行a、好氧反硝化菌富集采取驯化厌氧脱氮污泥的方法富集生物菌群；b、细菌分离纯化将驯化后得到的活性污泥内的生物菌群采用平板稀释法与平板划线法分离和纯化；c、好氧反硝化菌初筛对分离、纯化后得到的纯菌进行初筛，得到对TN去除率达50％以上的菌株；d、好氧反硝化菌复筛对初筛后的菌株进行复筛，得到好氧反硝化菌。本发明好氧反硝化技术的实现，不仅能克服传统生物脱氮技术的弊端，还具有以下优势(1)能够实现同一反应器内脱氮、除COD；(2)在反馈作用的调节下缩短停留时间；(3)减小曝气量；(4)反硝化过程产生的碱度能够中和硝化过程产生的酸度，减小碱度消耗；(5)有助于实现短程同步硝化反硝化。好氧反硝化技术以上特点可以大大减小污水处理费用，提高处理能力和效率。
图1为好氧反硝化菌富集装置图，图2为好氧反硝化菌复筛装置图。
具体实施例方式具体实施方式
一本实施方式按照下述步骤进行a、好氧反硝化菌富集采取驯化厌氧脱氮污泥的方法富集生物菌群，微生物与环境、微生物与微生物间的相互作用是复杂微妙的，突然改变环境条件(从厌氧/缺氧→好氧)不仅起不到富集的作用，还会破坏原来的生态平衡，对原有菌群也是一种破坏，所以采取驯化厌氧脱氮污泥的手段(驯化装置如图1所示)，逐渐改变环境条件，即逐渐增大曝气量、曝气时间、进水硝酸盐和亚硝酸盐浓度，达到所要筛选菌株的环境条件，给生物菌群一个适应的过程，最终使目的菌群—好氧反硝化菌成为优势菌群，来达到富集的目的；b、细菌分离纯化将驯化后得到的活性污泥内的生物菌群采用平板稀释法与平板划线法分离和纯化；c、好氧反硝化菌初筛对分离、纯化后得到的纯菌进行初筛，得到对TN去除率达50％以上的菌株；d、好氧反硝化菌复筛对初筛后的菌株进行复筛，得到好氧反硝化菌。所述驯化厌氧脱氮污泥的方法是这样实现的(1)从SBR法处理高浓度氨氮废水工艺或传统厌氧脱氮污泥工艺中取活性污泥；(2)驯化初始，仅以FM配水作为进水，每隔2～3d，增加DM配水培养液在配水中的含量，直到配水全部为DM培养液，驯化一个月后得到在DO值大于5mg/L的条件下，对500mg/L的TN可去除率达60％以上的活性污泥；所述FM配水由1.0g/L牛肉膏、5.0g/L蛋白胨和1.0g/LKNO3组成；所述DM配水由7.9g/LNa2HPO4·7H2O、1.5g/LKH2PO4、0.3g/LNH4Cl、0.1g/LMgSO4·7H2O、4.7g/L琥珀酸钠、2ml微量元素溶液和氧化态氮组成；所述氧化态氮为KNO3和/或NaNO2；所述微量元素溶液由50.0g/L EDTA、2.2g/L ZnSO4、5.5g/LCaCl2、5.06g/L MnCl2·4H2O、5.0g/L FeSO4·7H2O、1.1g/L(NH4)6Mo7O2·4H2O、1.57g/L CuSO4·5H2O和1.61g/L CoCl2·6 H2O组成；所述进水的化学需氧量(COD)控制在4500～5500mg/L，总氮(TN)在450～550mg/L。所述好氧反硝化菌初筛的方法是这样实现的将分离纯化后得到的纯菌斜面，用灭菌后的DM培养液洗到装有100mL DM培养液的250mL三角瓶中，并在三角瓶内加入灭过菌的玻璃株，用9层纱布包好瓶口，放入空气振荡器，在温度为30℃、转速为160rpm的条件下培养24h，得到对TN去除率达50％以上的菌株。所述好氧反硝化菌复筛的方法是这样实现的(1)好氧反硝化菌复筛装置(见图2)的反应器中装入1000mLDM培养基后密封，与氧气罐组装，打开进气口和排气口，以3L/min的流量通入氧气3min；(2)关闭排气口，通入氩气，当反应器内压力为正压时停止通入氩气，关闭进气口，对培养液进行培养；(3)采用氮元素轨迹跟踪测定法监测培养液中NO3--N、NO2--N和DO的变化。
具体实施方式
二本实施方式是这样实现的a、好氧反硝化菌富集(1)从SBR法处理高浓度氨氮废水工艺或传统厌氧脱氮污泥工艺中取活性污泥；(2)驯化初始，仅以FM配水作为进水，每隔2～3d，增加DM配水培养液在配水中的含量，直到配水全部为DM培养液，进水的COD控制在5000mg/L，总氮(TN)在500mg/L，并且在驯化过程中，维持污泥在原溶解氧(DO)浓度2～3d后，在改变配水的同时，也将DO增加0.5～1mg/L，以上做法的目的一是避免突然破坏生物菌群的营养环境对菌群造成伤害，二是逐渐达到好氧反硝化菌适宜的条件，使该类菌在污泥驯化过程中得到富集，采用上述方法驯化一个月后可完成污泥驯化，此时活性污泥由驯化初始的深黑色、散状转变为驯化末期的浅灰色、絮状，呈好氧污泥状态。驯化后活性污泥在DO值大于5mg/L的条件下，对500mg/L的TN可去除60％以上，COD降解率可达到80％以上，并具备一定的抗冲击负荷能力，污泥活性强，并在具有较高浓度的好氧反硝化菌群。采取驯化厌氧脱氮污泥的方法富集生物菌群，微生物与环境、微生物与微生物间的相互作用是复杂微妙的，突然改变环境条件(从厌氧/缺氧→好氧)不仅起不到富集的作用，还会破坏原来的生态平衡，对原有菌群也是一种破坏，所以采取驯化厌氧脱氮污泥的手段，逐渐改变环境条件，即逐渐增大曝气量、曝气时间、进水硝酸盐和亚硝酸盐浓度，达到所要筛选菌株的环境条件，给生物菌群一个适应的过程，最终使目的菌群—好氧反硝化菌成为优势菌群，来达到富集的目的。
b、细菌分离纯化将驯化后得到的活性污泥内的生物菌群采用平板稀释法与平板划线法分离和纯化。
c、好氧反硝化菌初筛将分离纯化后得到的纯菌斜面，用灭菌后的DM(加入的氧化态氮为1.0g/LKNO3、0.5g/LNaNO2)培养液洗到装有100mL DM培养液的250mL三角瓶中，并在每个三角瓶内加入几粒灭过菌的玻璃株(尽量减小厌氧微环境对实验结果的影响)，用9层纱布包好瓶口(保证好氧条件)，放入空气振荡器，在温度为30℃、转速为160rpm的条件下培养24h，得到对TN去除率达50％以上的菌株。取培养前后的菌液测量TN浓度，考察其对TN的去除率。在本实验中，分别考察分离得到的105株菌对TN的去除率，其中去除率在50％以上的菌株有21株，40％～50％的菌株有15株，30％～40％的菌株有10株。一般认为，生物同化作用利用的氮不会超过30％，所以可以认为这46株菌基本在好氧条件下具有反硝化作用。另外，驯化前从活性污泥中筛选出的17株菌，对TN去除率都较低，最高不过17％。可见，驯化后分离的菌株对TN的去除率有明显提高，该结果进一步证实驯化可以提高好氧反硝化菌群的浓度。但由于同化作用对结果有干扰，故应采取复筛的方法进一步确认所筛选菌株是否为好氧反硝化菌。
d、好氧反硝化菌复筛整个反应装置是密闭的，反应器由2000mL具塞密闭的试剂瓶及管件组成，进出口两端配有孔径为0.25μm的滤菌器，反应器装入1000mLDM培养基后密封，与氧气罐组装，打开进气口和排气口，以3L/min的流量通入氧气3min，赶走反应器和管路内的空气来去除空气中所含的氮气，避免氮气对测量结果的干扰。关闭排气口，通入氩气，通过气体压力表的读数确定反应器内压力为正压，停止通入氩气，关闭进气口。与此同时，打开磁力搅拌器，目的是使培养液均质并与上部氧气充分接触(培养过程中测得DO能够始终维持在8mg/L～10mg/L)。通入氩气的目的是制造有压条件一是使反应器内形成正压，使氧能够更充分地溶解到培养液中，确保绝对好氧；二是正压能够阻止空气中的氮气进入反应器，使取得气体样中的氮的量绝对代表反硝化的产物的量。取样口1用以取气体样，来监测培养过程中氮气生成量(气相色谱法)，取样口2用以取培养液样品，来监测培养液中NO3--N、NO2--N和DO等的变化。实验用的培养基为DM培养基，受氢体KNO30.8g/L，其他成份不变。本实验中，对初筛的21株对TN的去除率在50％以上的菌株做了复筛，证实了它们都可以在好氧的条件下进行硝酸盐呼吸，脱氮率可达95％以上，且反硝化末端产物为氮气，即这21株菌都是好氧反硝化菌，这进一步佐证驯化污泥内好氧反硝化的实现，是由于污泥内部高效的、大量的好氧反硝化菌在起作用。
由以上实验结果可知，采用此方法筛选好氧反硝化菌是高效的，且各个步骤都发挥着重要的作用，其中污泥驯化工作起关键的作用，而好氧反硝化菌的复筛又起着决定性的作用。
权利要求
1.筛选好氧反硝化菌的方法，其特征在于它按照下述步骤进行a、好氧反硝化菌富集采取驯化厌氧脱氮污泥的方法富集生物菌群；b、细菌分离纯化将驯化后得到的活性污泥内的生物菌群采用平板稀释法与平板划线法分离和纯化；c、好氧反硝化菌初筛对分离、纯化后得到的纯菌进行初筛，得到对TN去除率达50％以上的菌株；d、好氧反硝化菌复筛对初筛后的菌株进行复筛，得到好氧反硝化菌。
2.根据权利要求1所述的筛选好氧反硝化菌的方法，其特征在于所述驯化厌氧脱氮污泥的方法是这样实现的(1)从SBR法处理高浓度氨氮废水工艺或传统厌氧脱氮污泥工艺中取活性污泥；(2)驯化初始，仅以FM配水作为进水，每隔2～3d，增加DM配水培养液在配水中的含量，直到配水全部为DM培养液，驯化一个月后得到在DO值大于5mg/L的条件下，对500mg/L的TN可去除率达60％以上的活性污泥。
3.根据权利要求2所述的筛选好氧反硝化菌的方法，其特征在于所述FM配水由1.0g/L牛肉膏、5.0g/L蛋白胨和1.0g/LKNO3组成。
4.根据权利要求2所述的筛选好氧反硝化菌的方法，其特征在于所述DM配水由7.9g/L Na2HPO4·7H2O、1.5g/L KH2PO4、0.3g/L NH4Cl、0.1g/LMgSO4·7H2O、4.7g/L琥珀酸钠、2ml微量元素溶液和氧化态氮组成。
5.根据权利要求4所述的筛选好氧反硝化菌的方法，其特征在于所述氧化态氮为KNO3和/或NaNO2。
6.根据权利要求4所述的筛选好氧反硝化菌的方法，其特征在于所述微量元素溶液由50.0g/L EDTA、2.2g/L ZnSO4、5.5g/L CaCl2、5.06g/LMnCl2·4H2O、5.0g/L FeSO4·7H2O、1.1g/L(NH4)6Mo7O2·4H2O、1.57g/LCuSO4·5H2O和1.61g/L CoCl2·6H2O组成。
7.根据权利要求2所述的筛选好氧反硝化菌的方法，其特征在于所述进水的COD控制在4500～5500mg/L，总氮控制在450～550mg/L。
8.根据权利要求1所述的筛选好氧反硝化菌的方法，其特征在于所述好氧反硝化菌初筛的方法是这样实现的将分离纯化后得到的纯菌斜面，用灭菌后的DM培养液洗到装有100mL DM培养液的250mL三角瓶中，并在三角瓶内加入灭过菌的玻璃株，用9层纱布包好瓶口，放入空气振荡器，在温度为30℃、转速为160rpm的条件下培养24h，得到对TN去除率达50％以上的菌株。
9.根据权利要求1所述的筛选好氧反硝化菌的方法，其特征在于所述好氧反硝化菌复筛的方法是这样实现的(1)好氧反硝化菌复筛装置的反应器中装入1000mLDM培养基后密封，与氧气罐组装，打开进气口和排气口，以3L/min的流量通入氧气3min；(2)关闭排气口，通入氩气，当反应器内压力为正压时停止通入氩气，关闭进气口，对培养液进行培养；(3)采用氮元素轨迹跟踪测定法监测培养液中NO3--N、NO2--N和DO的变化。
全文摘要
筛选好氧反硝化菌的方法，它涉及一种高效筛选好氧反硝化菌的方法。本发明按照下述步骤进行a.采取驯化厌氧脱氮污泥的方法富集生物菌群；b.将驯化后得到的活性污泥内的生物菌群采用平板稀释法与平板划线法分离和纯化；c.对分离、纯化后得到的纯菌进行初筛，得到对TN去除率达50％以上的菌株；d.对初筛后的菌株进行复筛，得到好氧反硝化菌。本发明好氧反硝化技术的实现，不仅能克服传统生物脱氮技术的弊端，还具有以下优势(1)能够实现同一反应器内脱氮、除COD；(2)在反馈作用的调节下缩短停留时间；(3)减小曝气量；(4)反硝化过程产生的碱度能够中和硝化过程产生的酸度，减小碱度消耗；(5)有助于实现短程同步硝化反硝化。
文档编号C12Q1/02GK1594591SQ20041004370
公开日2005年3月16日 申请日期2004年7月12日 优先权日2004年7月12日
发明者马放, 周丹丹, 任南琪, 杨基先 申请人:哈尔滨工业大学